一種肺癌篩查的新方法

一種肺癌篩查的新方法溫鑫編寫肺、支氣管上皮細(xì)胞穩(wěn)定性檢測技術(shù)〔痰液細(xì)胞游離亞鐵原卟啉檢測〕肺癌當(dāng)今世界上嚴(yán)重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤發(fā)病率在多數(shù)國家呈明顯增高趨向近年來在我國許多大城市，占惡性腫瘤死亡率的第一位全世界每年有135萬左右新病人每年110萬人死于此病男性、女性死亡人數(shù)均位首例〔腫瘤致死〕至2025年，我國每年死于肺癌者達(dá)100萬人以上中國肺癌流行病學(xué)回憶26.9%38.4%30.5%2000和2005年肺癌患者數(shù)Yangetal,2005患者數(shù)中國肺癌流行病學(xué)回憶2000和2005年肺癌發(fā)病率14.0%19.9%Per100,000Yangetal,2005* ASR:Age-standardizedincidencerate(per100,000)usingworldstandardpopulation中國肺癌流行病學(xué)回憶2000和2005年癌癥發(fā)病率排名Yangetal,2005* ASR:Age-standardizedincidencerate(per100,000)用世界標(biāo)準(zhǔn)人口計算的年齡標(biāo)化發(fā)病率(每10萬人)中國肺癌流行病學(xué)回憶

胃積危險(75歲以下)：計算出的個人在沒有其他死亡原因時在75歲以下發(fā)生癌癥的凈風(fēng)險(以百分比表示)肺癌成為累積危險性最高的癌癥Yangetal,2005NSCLC主要組織學(xué)類型的發(fā)生率*因為診斷標(biāo)準(zhǔn)的差異，總和不等于100%。GinsbergRJ,etal.Cancer:PrinciplesandPracticesofOncology.5thed.1997;858-911.30%鱗狀細(xì)胞癌18%小細(xì)胞肺癌40%腺癌15%大細(xì)胞癌40302515154035351515咳嗽呼吸困難胸痛咯血肺炎體重減輕全身虛弱缺乏食欲發(fā)熱貧血發(fā)生頻率(%)NSCLC診斷時的體征和病癥肺癌的早期篩查痰細(xì)胞學(xué)檢查和胸部X片局部對照研究中提高診斷率和早期病例比例但疾病特異性死亡無差異對照組也接受了胸片檢查，并非空白對照低劑量CT檢出率較胸片高，多為IA期患者對生存率影響有待研究肺癌的篩查仍處于臨床研究階段

癌標(biāo)志物的檢測無可靠的血清癌標(biāo)志物用于診斷或普查肺癌NSCLC：組織多肽抗原(TPA)、癌胚抗原(CEA)、鱗癌抗原(Scc-Ag)、CYFRA21-1有一定意義SCLC：神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE)、蛙皮素(BN)、肌酸磷酸同功酶BB(CPK-BB)、胃泌肽(GRPC)檢測外周血中腫瘤細(xì)胞異常DNA，即DNA微衛(wèi)星改變及基因的異常甲基化一種肺癌篩查的新方法《肺、支氣管上皮細(xì)胞穩(wěn)定性檢測技術(shù)〔痰液細(xì)胞游離亞鐵原卟啉檢測〕》

使用《肺、支氣管上皮細(xì)胞穩(wěn)定性檢測技術(shù)》進(jìn)行肺癌臨床篩查，在肺、支氣管上皮細(xì)胞異常增生及癌變起始階段即可顯示陽性結(jié)果，能發(fā)現(xiàn)早期病人，精準(zhǔn)度高。該技術(shù)無采樣創(chuàng)傷、無采樣漏診、無需儀器設(shè)備和專業(yè)實驗室，可用于經(jīng)濟(jì)條件較弱的人群。該法操作簡單，經(jīng)費投入低，適合于大規(guī)模肺癌普查活動?！斗?、支氣管上皮細(xì)胞穩(wěn)定性檢測技術(shù)》是通過檢測痰液中是否含有細(xì)胞游離亞鐵原卟啉〔CellsFreeFerrousProtoporphyrinFH〕而了解肺部細(xì)胞是否癌變的一種檢測技術(shù)。細(xì)胞游離亞鐵原卟啉是肺癌發(fā)生過程中產(chǎn)生的因果性生物標(biāo)志因子。FH是含亞鐵原卟啉蛋白的分解產(chǎn)物。FH具有強(qiáng)氧化作用，導(dǎo)致細(xì)胞自穩(wěn)調(diào)節(jié)功能紊亂。FH含量具有連續(xù)可測量性，且與細(xì)胞癌變程度呈密切正相關(guān)。采用直接生物學(xué)介質(zhì)〔痰液〕進(jìn)行靶向定位檢測，即可顯示肺、支氣管上皮細(xì)胞惡變過程。諾貝爾獎獲得者德國生物化學(xué)家奧托.海因里希.瓦博格〔OttoHeinnichWarburg〕發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的耗糖速度是正常細(xì)胞的10倍，卻僅產(chǎn)生1/10的能量。腫瘤細(xì)胞主要通過磷酸戊糖途徑產(chǎn)能，使即便在有氧情況下有氧氧化過程也不能對糖酵解產(chǎn)生抑制，這稱為瓦博格氏效應(yīng)〔Warburgeffect〕。以6-磷酸葡萄糖開始，在6-磷酸葡萄糖脫氫酶催化下形成6-磷酸葡萄糖酸，進(jìn)而代謝生成以磷酸戊糖為中間代謝物的過程，稱為磷酸戊糖途徑，簡稱PPP途徑。反響部位：胞漿重要反響產(chǎn)物：NADPH、5-磷酸核糖限速酶〔啟動因子〕：6-磷酸葡萄糖脫氫酶

6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性與抑癌基因p53有關(guān)。p53基因因編碼一種分子質(zhì)量為53kDa的蛋白質(zhì)而得名，是一種抑癌基因。一旦p53基因發(fā)生突變，P53蛋白失活，細(xì)胞分裂失去節(jié)制，發(fā)生癌變。

在正常情況下,p53與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶相結(jié)合,抑制它的活性，阻止磷酸戊糖途徑進(jìn)行,細(xì)胞中的葡萄糖主要通過三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量。

在p53發(fā)生突變或缺失的腫瘤細(xì)胞中,失去了對葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的抑制,該酶作為戊糖磷酸途徑的啟動因子，使葡萄糖通過戊糖磷酸途徑代謝。1、耗能；2、產(chǎn)生大量復(fù)原型輔酶Ⅱ〔NADPH〕,進(jìn)行生物合成；3、改變細(xì)胞微環(huán)境。致癌因素

阻抑蛋白p53葡萄糖-6-磷酸脫氫酶P53突變突變的p53葡萄糖-6-磷酸脫氫酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶激活啟動因子葡萄糖戊糖磷酸代謝途徑TACNADPH果糖-6-磷酸3-磷酸甘油醛二氧化碳抑制瓦博格氏效應(yīng)細(xì)胞內(nèi)氧化復(fù)原狀態(tài)的變化在很大程度上受到GSH/GSSG的影響，它是機(jī)體的主要內(nèi)源性氧化-復(fù)原調(diào)控因子，其-SH和-S-S-間的轉(zhuǎn)換調(diào)控著許多生物大分子的活性，被稱為“分子開關(guān)”。Warburg效應(yīng)形成的細(xì)胞微環(huán)境紊亂低氧〔氧穩(wěn)態(tài)紊亂〕酸性環(huán)境〔酸堿平衡紊亂〕復(fù)原性狀態(tài)〔氧化-復(fù)原平衡紊亂〕

FH位于細(xì)胞含亞鐵原卟啉蛋白的肽鏈靠近外表的一個疏水核內(nèi)，它主要依靠Fe2+與F8His的咪唑氮配位而掛在Pr鏈上。但是它之所以能固定在蛋白質(zhì)的固定位置上而且取向一定，主要是因為還有大約21個殘基逼近FH，距離在4A°之內(nèi)，這些殘基中有60多處與FH比較靠近，可以發(fā)生極性與非極性的相互作用，足以保持FH在細(xì)胞蛋白中的位置。FH的極性局部丙酸基側(cè)鏈伸向親水的外表，在生理pH下解離成負(fù)離子，在α鏈中，有一個丙酸基與CD3His相連；在β鏈中，F(xiàn)H的兩個丙酸基分別與CD3Ser和E10Lys相連。FH與肽鏈之間的靜電引力對于維持FH在細(xì)胞含亞鐵原卟啉蛋白中的位置有很大作用。谷胱甘肽過氧化物酶以復(fù)原型谷胱甘肽(GSH)作為供氫體來分解H2O2，生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，使細(xì)胞內(nèi)GSH:GSSG的比率下降。GSH生成GSSG過程中形成腫瘤細(xì)胞的低氧狀態(tài)，激活氧感受器和缺氧信號傳導(dǎo)通路。氧感受器分子導(dǎo)致蛋白質(zhì)的巰基由氧化型向復(fù)原型轉(zhuǎn)變，促使缺氧特異性轉(zhuǎn)錄因子-低氧誘導(dǎo)因子〔hypoxia-induciblefactor；HIF〕HIF-1a的磷酸化并與HIF-1b結(jié)合而形成一個完整的HIF-1轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，從而與相應(yīng)靶基因上的缺氧反響元件(HRE)結(jié)合，促進(jìn)基因的表達(dá).并通過第二信使-活性氧族(ROS)與激酶系統(tǒng)發(fā)生聯(lián)系，激活下游酶系統(tǒng)。細(xì)胞在代謝過程中通過Fenton反響產(chǎn)生產(chǎn)生一系列活性氧族〔reactiveoxygenspecies,ROS〕，包括：O2-、H2O2及HO2·、·OH等。ROS可雙向調(diào)控細(xì)胞的凋亡和增殖，機(jī)體內(nèi)的自由基通過其濃度調(diào)節(jié)著機(jī)體細(xì)胞的生死平衡，對轉(zhuǎn)錄因子的激活以及對細(xì)胞增殖的促進(jìn)。由于瓦格博效應(yīng)，在低氧誘導(dǎo)因子〔hypoxiainduciblefactor，HIF〕的介導(dǎo)下，血管內(nèi)皮生長因子〔VEGF〕mRNA轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定性增加，且VEGF受體表達(dá)上調(diào)，VEGF的生物學(xué)效應(yīng)增強(qiáng)。其表達(dá)的結(jié)果是增加血管分支形成,增強(qiáng)血流量。HIF-1a、ROS、VEGF表達(dá)上調(diào)，使一種親脂性物質(zhì)〔Hydrophilicfattymolecules〕進(jìn)入細(xì)胞含亞鐵原卟啉蛋白疏水核內(nèi)，它所帶的負(fù)電荷中和了肽鏈上His、Lys所帶的正電荷，使它們不再與FH丙酸基側(cè)鏈保持靜電吸引，從而使FH在細(xì)胞蛋白中脫落。瓦博格效應(yīng)NADPH增加GSH增加激活氧感受器和缺氧信號傳導(dǎo)通路缺氧特異性轉(zhuǎn)錄因子HIF-1a活性增強(qiáng)激活第二信使-ROS與激酶系統(tǒng)EPO基因表達(dá)水平升高NADPH氧化酶H2O2下降cGMP抑制激活鳥苷酸環(huán)化酶VEGF表達(dá)上調(diào)血紅素氧合酶及NOS活性抑制內(nèi)源性CO及NO下降FH釋放

代謝改變

HIF-1

VEGF不典型增生癌前病變原位癌浸潤癌細(xì)胞增生

形態(tài)學(xué)改變低氧、還原態(tài)

ROS瓦博格效應(yīng)

α鏈CD3His

β鏈CD3Ser、E10Lys酶蛋白FH

p53等基因突變

致癌因素

Hfm細(xì)胞高增生低凋亡低分化低氧代謝通路致癌因素細(xì)胞能量代謝重編程細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂細(xì)胞形態(tài)紊亂細(xì)胞功能紊亂氧穩(wěn)態(tài)紊亂酸堿平衡紊亂氧化-復(fù)原態(tài)平衡紊亂細(xì)胞周期功能紊亂線粒體功能紊亂囊泡運輸功能紊亂表型遺傳修飾機(jī)制紊亂細(xì)胞對稱分裂抑制機(jī)制紊亂干細(xì)胞不對稱分裂機(jī)制紊亂細(xì)胞癌變瓦博格氏效應(yīng)采用一種脂溶性較強(qiáng)的物質(zhì)，使之很容易進(jìn)入細(xì)胞與細(xì)胞器中，其與FH物質(zhì)的氧化-復(fù)原產(chǎn)物使上皮細(xì)胞內(nèi)含有的內(nèi)源性過氧化物酶等酶染色。作為篩查手段，觀察痰液上皮細(xì)胞中FH物質(zhì)對細(xì)胞內(nèi)酶的染色情況，即可顯示肺、支氣管上皮細(xì)胞是否存有惡變及其程度。因細(xì)胞內(nèi)酶的差異，同一含量FH顯色可能略有不同。【判定標(biāo)準(zhǔn)】一、陰性(細(xì)胞游離亞鐵原卟啉含量低于0.5ng/ml〕：不變色。二、弱陽性(細(xì)胞游離亞鐵原卟啉含量0.5~5ng/ml〕：無色變?yōu)榈{(lán)色或黃綠色。三、陽性(細(xì)胞游離亞鐵原卟啉含量5~200ng/ml〕：藍(lán)綠色或藍(lán)色。

四、強(qiáng)陽性(細(xì)胞游離亞鐵原卟啉含量200ng/ml以上〕：深藍(lán)色五、假設(shè)標(biāo)本即刻顯深藍(lán)色后轉(zhuǎn)為深黃色或棕紅色，說明標(biāo)本內(nèi)內(nèi)混有血液，亦應(yīng)視為強(qiáng)陽性。即刻顯深藍(lán)色是FH的征象，轉(zhuǎn)為深黃色或棕紅色是血液的征象。

技術(shù)特色1、細(xì)胞游離亞鐵原卟啉是一種因果性生物標(biāo)志因子，是細(xì)胞穩(wěn)定性失調(diào)、腫瘤發(fā)生過程細(xì)胞代謝變化的必然產(chǎn)物。因而用以檢測肺癌敏感度高。2、本技術(shù)采用直接生物學(xué)介質(zhì)進(jìn)行檢測，是一種靶向定位檢測，因而用以檢測肺癌特異度高。

3、這種代謝改變的腫瘤細(xì)胞是全息性的，是體細(xì)胞全能性不協(xié)調(diào)的表現(xiàn)，因而用以檢測肺癌具有廣譜性，適用各型肺癌的檢測。

4、簡約設(shè)