組織DNA的提取與純化

組織DNA的提取與純化檢驗(yàn)系生化教研室陳寧1可編輯版講課內(nèi)容概述1試驗(yàn)原則2實(shí)驗(yàn)操作及相關(guān)試劑介紹3注意事項(xiàng)42可編輯版一、概述DNA在生物組織中以核蛋白的形式存在于細(xì)胞核中。單倍體人類DNA平均相對分子量為6×1010道爾頓，相當(dāng)于1.3×105kb。3可編輯版DNA的分類有：真核DNA細(xì)菌DNA病毒DNA質(zhì)粒DNA4可編輯版DNA樣品的來源：組織–肝臟、贅生物、肌肉、培養(yǎng)細(xì)胞血液細(xì)菌–培養(yǎng)細(xì)菌、質(zhì)粒5可編輯版二、實(shí)驗(yàn)原則

保證DNA一級結(jié)構(gòu)的完整性排出其他干擾性分子的污染6可編輯版干擾分子對酶有抑制作用的物質(zhì)樣品中存在的其他生物大分子有機(jī)溶劑、高濃度的金屬離子等蛋白質(zhì)、多糖和脂類應(yīng)盡量將此類物質(zhì)的濃度降低到最小程度相應(yīng)抽提對象之外的核酸污染DNA抽提時，應(yīng)避免RNA干擾7可編輯版相關(guān)因素對于核酸的影響：機(jī)械剪切力、高溫劇熱環(huán)境過酸、過堿的反應(yīng)體系各種核酸酶降解效應(yīng)物理因素化學(xué)因素生物因素操作輕柔，切忌劇烈混勻、震蕩；控制實(shí)驗(yàn)溫度pH4~10EDTA緩沖液8可編輯版避免干擾因素的解決方法簡化操作步驟，縮短提取過程，減少各類因素對核酸的降解。9可編輯版三、實(shí)驗(yàn)操作及相關(guān)試劑介紹【實(shí)驗(yàn)方法】

物理方式：玻璃珠法超聲波法研磨法凍融法化學(xué)方式：異硫氰酸胍法

酚-氯仿抽提法

堿裂解法生物方式：酶法10可編輯版酚-氯仿抽提法提取組織組織勻漿水相(DNA,RNA)絮狀沉淀(DNA,少量蛋白質(zhì),RNA)DNA裂解液苯酚-氯仿離心離心離心氯仿-異戊醇5mol/LNaCl冰無水乙醇75%乙醇TE11可編輯版1.裂解液0.1mol/LNaCl1%SDS（十二烷基磺酸鈉）10mmol/LTris-HClpH8.01mmol/LEDTApH8.0陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。抑制DNA酶活性pH值適宜DNA游離至水相，避免降解。12可編輯版2.苯酚-氯仿（3:1，V:V）Tris-HCl飽和操作時，應(yīng)將移液管伸至試劑瓶底部，吸取下層試劑。苯酚與氯仿均為表面變性劑，能夠有效地去除水溶液中的蛋白質(zhì)，使其變性后沉淀。13可編輯版3.氯仿-異戊醇（24:1，V:V）經(jīng)酚氯仿試劑第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性殘余的蛋白質(zhì)，同時一起將酚帶走。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。

14可編輯版4.5mol/LNaCl使水溶液中的DNA易于聚合，從而形成鈉鹽沉淀。反應(yīng)體系為pH8.0時，DNA分子所帶的電荷為負(fù)電荷。加入NaCl溶液后，Na+能夠中和DNA外周的負(fù)電荷，減少DNA分子之間因同種電荷產(chǎn)生的排斥力，使得DNA分子相互靠攏。15可編輯版5.冰無水乙醇冰：低溫條件能降低分子運(yùn)動，避免DNA破壞，而易于沉淀出DNA。①DNA不溶于乙醇。②乙醇可以吸附水分子（極性相同），使得溶液中相對的水分子減少，增大了DNA在水中的相對濃度。③乙醇沉淀DNA需要鹽離子，用金屬離子屏蔽DNA上磷酸的負(fù)電荷，降低DNA分子間的斥力，才能沉淀完全。所以，之前須加入5MNaCl。16可編輯版6.75%乙醇洗滌作用，去除殘余的金屬離子。同時，保護(hù)DNA完整性，避免降解；抑制核酸酶活性。17可編輯版7.TE緩沖液TE緩沖液是Tris+EDTA緩沖液，一般用作溶解劑或保持劑，主要是調(diào)控pH。TE緩沖液是弱堿性,對DNA的堿基有保護(hù)性。DNA在TE提供的環(huán)境中穩(wěn)定性較好,不易破壞其完整性或產(chǎn)生開環(huán)及斷裂。包括提取好的DNA也要放在TE緩沖液中保存。18可編輯版【操作】抽提組織加入裂解緩沖液制成勻漿加入等體積的苯酚-氯仿試劑，緩慢顛倒5min后，2500rpm離心10min吸取上清液至干凈離心管加入等體積氯仿-異戊醇，搖勻5min，2500rpm離心10min記錄上清液體積，吸取上清液至玻璃管，加入5mol/LNaCl,并稀釋至0.3mol/L,再加入2.5倍體積冰無水乙醇，緩慢搖勻，出現(xiàn)絮狀沉淀2500rpm離心10min，棄去上清液加入1ml75%乙醇混勻，2500rpm離心5min。棄去上清液后再重復(fù)一次沉淀DNA去除多余乙醇后，在快干時（半透明狀）加入2mlTE緩沖液檢測DNA濃度、純度START19可編輯版加入等體積的苯酚-氯仿試劑，緩慢顛倒5min后，2500rpm離心10min苯酚-氯仿試劑具有揮發(fā)性，對人體有毒。故，使用完畢后及時蓋上試劑瓶蓋，保持實(shí)驗(yàn)室良好的通風(fēng)。如果發(fā)生試劑濺滴至皮膚、粘膜，務(wù)必及時用流動水沖洗。20可編輯版記錄上清液體積，吸取上清液至玻璃管，加入5mol/LNaCl,并稀釋至0.3mol/L,再加入2.5倍體積冰無水乙醇，緩慢搖勻，出現(xiàn)絮狀沉淀5mol/L×VNaCl=0.3mol/L×(V上清液+VNaCl)VNaCl=（3×V上清液）

/4721可編輯版檢測DNA濃度、純度取完全溶解后的DNA原液進(jìn)行1:100稀釋，即1μl原液+99μl水，混勻。紫外分光光度計(jì)檢測：A260=?A280=?

22可編輯版DNA純度鑒定A260/A280＜1.6≈1.8＞2.0酚、蛋白質(zhì)污染視為純度較高的DNARNA污染23可編輯版DNA濃度鑒定DNA(μg/ml)=A260×稀釋倍數(shù)×50×1/光徑DNA在260nm處存在吸收峰檢測時對于原液的稀釋程度1OD相當(dāng)于：50μg/mlDNA40μg/mlRNA20μg/ml寡核苷酸24可編輯版四、注意事項(xiàng)組織抽提前應(yīng)保存于液氮中，以免DNA受到破壞；純化時應(yīng)時刻注意抑制核酸酶的污染，使用EDTA等防止DNA降解。劇烈振蕩可使DNA斷裂，故操作時應(yīng)盡量輕柔、緩慢地顛倒混勻。要獲得高純度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白質(zhì)。

DNA在260nm處有一吸收峰，而蛋白質(zhì)在280nm