基因工程第四章目的基因的分離和合成

第四章目的基因的分離與合成通常我們把插入到載體內(nèi)的那個特定的片段基因稱為“外源基因”將那些已被或者準備要被分離、改造、擴增或表達的特定基因或DNA片段，稱為“目的基因”。獲得目的基因進行分子克隆，一方面為了獲得表達產(chǎn)物，另一方面就是要獲得大量拷貝，以便進行基因結構和功能的研究4/11/2024第四章目的基因的分離與合成獲得目的基因的方法：限制酶直接分離從基因組文庫中篩選逆轉錄制備cDNA或從cDNA文庫中篩選人工合成PCR擴增基因改造

4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新第四章目的基因的分離與合成第一節(jié)限制酶直接分離一、用于一些物理圖譜已確定的、背景資料比較清晰的原核生物基因的制備對已定序列的DNA分子只需用已知識別序列的限制酶進行一次或幾次的切割，分離純化所需的DNA片斷，與適當?shù)妮d體重組后轉化受體菌后即可得到目的基因的克隆。對已知定位的目的基因只要根據(jù)目的基因兩側的已知酶切位點，用適當?shù)拿盖懈?，一次即可獲得目的基因。4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新第一節(jié)限制酶直接分離二、用于一些物理圖譜未確定的、背景資料不明的原核生物基因的制備采用鳥槍法（shotgun）：從細菌細胞中分離細菌染色體用機械切割或限制酶分解得到各種大小的基因片段用相同的限制酶酶切載體質粒，與染色體片斷連接輸入到受體細胞轉化子的選擇4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略染色體DNA的切斷超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端全酶切：片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控部分酶切：片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整與載體連接如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達型載體如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為轉化受體細胞受體細胞；如果轉化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達的受體細胞篩選含有目的基因的目的重組子菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的建立）4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新鳥槍法操作的改進

使用這一改進方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率

使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA

4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新鳥槍法操作的改進例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當于1.6-2.0kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收DNA片段，然后與載體進行拼接在連接前將DNA片段進行分級分離

2.0kb1.6kb1.8kb4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結構4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新基因文庫的基本概念基因庫（genepool）

特定生物體全基因組的集合（天然存在）基因文庫（genelibraryorgenebank）

從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式基因組文庫（含有全部基因）

存在（人工構建）。根據(jù)構建方法的不同，基因文庫分為：

cDNA文庫（含有全部蛋白質編碼的結構基因）

第二節(jié)建立基因組文庫4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新基因文庫構建的基本戰(zhàn)略用鳥槍法構建基因組文庫，材料來自染色體DNA用cDNA法構建cDNA文庫，材料來自mRNA在高度分化的生物體中，不同組織和細胞在不同時段的mRNA種類不同（即基因的表達譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫一般還有組織細胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA文庫等。很顯然，cDNA文庫的信息量遠小于基因組文庫第二節(jié)建立基因組文庫4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新基因文庫的完備性基因文庫的完備性是指：在構建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)其中：P=任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕蔲=克隆片段的平均大小/生物基因組的大小

例如，人的單倍體DNA總長為2.9x109bp，基因文庫中克隆片段的平均大小為15kb，則構建一個完備性為0.9的基因文庫至少需要45萬個克??；而當完備性提高到0.9999時，基因文庫至少需要180萬個克隆第二節(jié)建立基因組文庫4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新基因文庫的基本概念基因文庫的質量標準除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因文庫應具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新基因文庫的構建程序基因組DNA的制備為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性，用于基因組文庫構建的DNA在分離純化操作中應盡量避免過度的斷裂。制備的DNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段的比率就越低，重組率和完備性也就越高AAAA用常規(guī)方法制備的染色體DNA的長度一般在100kb左右如果先將細胞固定在低融點凝膠中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得1000kb大小的DNA片段4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新基因文庫的構建程序基因組DNA的切割用于基因組文庫構建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是：第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū)第二，保證DNA片段大小均一超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體！4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新基因文庫的構建程序載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC或BAC載體l-DNA由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構建的載體通常選質粒上述幾種載體的最大裝載量如下：質粒考斯質粒10kb25kb45kbBAC300kbYAC400kb用于基因文庫構建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新第二節(jié)建立基因組文庫三、建立基因組文庫的主要步驟1、利用λ噬菌體獲得目的基因的DNA片斷基因組DNA片段化的方法物理學方法：機械力和超聲波生物化學方法：限制酶（四個核甘酸序列識別位點的酶）與噬菌體克隆載體重組，體外包裝成噬菌體顆粒轉染宿主菌篩選培養(yǎng)4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新第二節(jié)建立基因組文庫三、建立基因組文庫的主要步驟2、利用Cosmid基本與用λ噬菌體載體構建基因組文庫相似。有如下不同：制備基因組DNA須特別小心必須保證DNA分子盡可能大載體的處理比較簡單連接重組時，cosmid的量要比插入片段的量高10倍以上包裝轉染后在平板上出現(xiàn)的轉化菌落，不是嗜菌斑4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新第二節(jié)建立基因組文庫三、建立基因組文庫的主要步驟3、利用YAC選用限制酶EcoRI和BamHI對pYAC4載體作雙酶消化選用適當?shù)姆椒ㄖ苽渖矬w完整的染色體DNA，并將其片段化收集純化大片段DNA，并與YAC臂連接轉化去壁酵母細胞，利用存在于兩臂上的選擇標記，篩選含有YAC兩臂的酵母細胞4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新第三節(jié)cDNA基因文庫的構建一、cDNA基因文庫的概念某種生物基因組轉錄的全部mRNA經(jīng)反轉錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與克隆載體重組，儲存在一種受體菌群體中，這樣的群體稱為cDNA基因文庫cDNA序列只與基因的編碼序列有關，不能反映基因的內(nèi)含子，也不能反映基因的轉錄啟動子、終止子等非轉錄序列cDNA基因文庫可分為表達型和非表達型表達型cDNA文庫的構建：λgt11非表達型cDNA文庫的構建：λgt104/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新第三節(jié)cDNA基因文庫的構建二、cDNA基因文庫的構建細胞總RNA的制備及mRNA的分離cDNA第一條鏈的合成雙鏈cDNA的合成cDNA與載體的連接，重組到相應的載體上，導入受體細胞增值4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新二、cDNA基因文庫的構建細胞總RNA的制備及mRNA的分離總RNA：mRNA、tRNA、rRNAmRNA的分離純化利用真核生物mRNA其3‘末端的poly（A）尾巴與oligo（dT）配對特性，制備oligo（dT）型纖維素親和層析柱4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新二、cDNA基因文庫的構建以mRNA分子為模板，合成cDNA分子第一鏈Oligo（dT）引導的cDNA合成法隨機引物引導的cDNA合成法4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新二、cDNA基因文庫的構建雙鏈cDNA分子的合成自我引導合成法堿處理mRNA-cDNA雜交分子，降解mRNA單鏈cDNA在3‘端易發(fā)生自身環(huán)化形成發(fā)夾結構為cDNA第二鏈的合成提供引物在klenow酶的作用下合成cDNA第二鏈用S1酶切割除去單鏈發(fā)夾結構4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新二、cDNA基因文庫的構建雙鏈cDNA分子的合成置換合成法RNA酶H和E.coliDNA聚合酶I混合處理mRNA-cDNA雜交分子，RNA酶H在雜合雙鏈mRNA鏈上產(chǎn)生缺口并形成部分cDNA單鏈區(qū)DNA聚合酶I以殘存的mRNA作為引物合成cDNA第二鏈T4-DNA連接酶修復缺口4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新二、cDNA基因文庫的構建雙鏈cDNA分子的合成引物合成法在第一鏈合成完畢后，變性殘留的mRNA，用末端轉移酶在cDNA游離的3‘羥基端添加同聚物（dC）末端將其與人工合成的oligo-dG退火，形成引物結構在klenow酶的作用下，合成第二條cDNA鏈。PCR法4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新二、cDNA基因文庫的構建雙鏈平頭的cDNA通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中：平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新二、cDNA基因文庫的構建雙鏈cDNA克隆的篩選探針原位雜交法差示雜交法4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA結構

細菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在細胞中含量少，對酶和堿極為敏感，分離純化困難僅限于克隆蛋白質編碼基因

4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新三、PCR擴增法PCR（PolymeraseChainReaction）法，又稱為聚合酶鏈反應或PCR擴增技術，是一種高效快速的體外DNA聚合程序使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目的基因或DNA片段兩側的序列，根據(jù)該序列化學合成聚合反應必需的雙引物PCR法定向擴增目的基因的基本原理4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新四、基因的化學合成DNA的化學

DNA合成儀酶促法全片段酶促連接法人工合成組成一個完整基因的所有寡核甘酸片段，相鄰的片段間有4-6個堿基的重疊互補相互互補的寡核甘酸片段復性，形成雙鏈寡核甘酸片段用T4連接酶連接酶促填充法4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新四、基因的化學合成DNA的化學

DNA合成儀酶促法全片段酶促連接法酶促填充法合成目的基因其中的一些片段，在這些相鄰的片段的3‘端有一短的序列互補復性形成模板用klenow酶去填補互補片段間的單鏈區(qū)域4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新化學合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成上述三種方法各有利弊：化學合成DNA的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時，雖然化學合成的份額相對較小，成本較低，但大片段化學合成的收率極低，例如，每聚合一個單體的產(chǎn)物收率為95%則合成50個堿基長的DNA單鏈大片段的總收率只有7.7%4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新化學合成法的基本戰(zhàn)略探針等寡聚核苷酸合成在某些情況下，往往只知道目的基因編碼產(chǎn)物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此時需要從已知的氨基酸序列推測為其編碼的DNA序列，然后合成探針，篩選由鳥槍法或cDNA法得到的重組子，最終獲得含有目的基因的目的重組子由于大多數(shù)氨基酸擁有簡并密碼子，故在探針序列的設計時必須考慮下列問題：生物體對簡并密碼子的偏愛性，合成系列探針探針應具有足夠的長度，通常在17-20個核苷酸之間探針內(nèi)部不應出現(xiàn)可能的互補區(qū)域4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新化學合成的單元操作

化學合成DNA的實質是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個個接上去，每接一個單體就是一個循環(huán)反應，包括：基團保護、分離、縮合、分離、去保護五大操作單元。從反應機理上來講，DNA化學合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸液三酯法；具體操作過程又有液相合成和固相合成兩種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應中間物的分離程序簡便，DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸液三酯法原理設計的4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新DNA化學合成的用途合成天然基因修飾改造基因

設計新型基因

制備探針、引物、接頭

如生長激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素基因等如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等

4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新目的基因的分離目的基因的功能克隆根據(jù)特異蛋白分離目的基因基本過程：分離特異蛋白，測定特異蛋白的氨基酸順序，推測該蛋白的核苷酸序列，合成探針分離特異蛋白，作為抗原制備抗體，篩選cDNA表達文庫4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新目的基因的分離目的基因的功能克隆根據(jù)特異蛋白分離目的基因注意事項：合成的探針必須特異的識別目的基因，充分考慮遺傳密碼的簡并性利用抗體篩選目的基因時，應構建cDNA的表達文庫4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新目的基因的分離目的基因的功能克隆功能互補法克隆基因利用被克隆的DNA片斷與寄主細胞的染色體DNA在功能上的互補性來進行目的基因的直接分離酵母基因組酶切DNA片斷λ噬菌體載體營養(yǎng)缺陷型菌株＋基本培養(yǎng)基重組體4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新實例：基因組文庫DNA→轉化釀酒酵母細胞（leu2,Leu-）→轉化細胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因基因組文庫DNA→轉化E.coli（無纖維素酶活性）→轉化細胞可在纖維素平板上形成水解圈→纖維素酶基因

優(yōu)點：簡便，快速，可靠，是首選方法。獲得的基因一定是完整基因。

缺點：適用范圍較窄。

必備條件：外源基因不僅能在受體細胞表達，而且必須具備生物學活性。4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新1.遺傳互補法1)

原理當把一外源DNA片段引入一受體細胞后，如果受體細胞獲得某種新的性狀，那么此片段上攜帶著決定新性狀的遺傳基因。i.營養(yǎng)缺陷型受體細胞+外源DNA→轉化細胞涂布在合成培養(yǎng)基上→原養(yǎng)型細胞生長ii.受體細胞（無某種表型）+外源DNA→轉化細胞涂布在特殊培養(yǎng)基上→具有新性狀細胞iii.雖然有些受體細胞也能產(chǎn)生某種酶活性，但當轉入目的基因后，該細胞可過量產(chǎn)生此酶活性，這亦可用于基因篩選。如釀酒酵母的MFα基因就是如此篩選到的。4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新2)分離步驟分離基因組文庫重組DNA分子→轉化適當宿主細胞→涂布在選擇培養(yǎng)基上→隨機挑選陽性克隆，分離重組DNA分子→再轉化相同受體細胞→高頻轉化子→基因的進一步證實和鑒定

重組DNA轉化細胞SDS→出現(xiàn)新蛋白質帶原載體轉化細胞(一)分別制備無細胞抽提物酶活測定→酶活性出現(xiàn)非轉化細胞（二）免疫分析→與特定抗原反應4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新2．核酸雜交法1)原理利用核酸探針與待分離DNA的同源序列可進行雜交的特點分離目的基因（同源序列不是完全相同序列）優(yōu)點：不需要基因表達必備條件：合適的核酸探針或有關資料，外源DNA能在宿主細胞中擴增

2)核酸探針種類

i.DNA探針:分離自某一種生物ii.寡核苷酸探針:根據(jù)目的基因編碼蛋白質的部分氨基酸序列推測4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala六肽

QUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCN

對應mRNAN：ACGT/U

CAN-AAP-GTP-CTP-CG

探針序列Q：CT/UP：AG

32種14聚體混合物，其中必有一種14聚體與待測DNA完全互補*選擇的肽段中氨基酸的簡并密碼子應最少。**這種探針最好用于目的cDNA分離。若用于分離基因，要事先考慮到此探針序列橫跨內(nèi)含子序列的可能。***此種探針亦可根據(jù)其他來源相同基因的保守序列設計。iii.cDNA探針:利用特異性mRNA反轉錄而成，亦可用不同mRNA混合物反轉錄而成iv.PCR探針v.RNA探針:由T3或T7啟動子和相應聚合酶轉錄其下游基因片段而得4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新

3)分離步驟

基因(基因組或cDNA)文庫→制備DNA樣品膜→與標記探針雜交→雜交斑點（陽性克?。蛛x重組DNA分子→作斑點雜交陽性克隆Southern雜交以確認雜交結果→DNA進一步證實和鑒定：核酸序列分析，與蛋白質一級結構比較；分離插入片段進行基因表達，用免疫方法或其他方法檢測表達產(chǎn)物3.免疫法1)原理

外源DNA引人宿主細胞后表達出蛋白質，以此為抗原與相應的抗體發(fā)生免疫反應,然后利用二抗與一抗反應，用二抗偶聯(lián)的酶反應篩選目的DNA4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新優(yōu)點：不依賴于基因表達產(chǎn)物的生物學活性,只要抗原決定序列能被正確表達。*外源DNA可以是一個完整編碼區(qū)，也可能是一個外顯子，這些序列可以插入E.coli表達型載體。必備條件：待分離基因的表達產(chǎn)物—蛋白質必須純化和用于制備相應抗體。2)

分離步驟基因文庫→蛋白質樣品膜制備→免疫法篩選→有色斑點（陽性克?。M一步證實：分離陽性克隆無細胞抽提物，作斑點印跡，western印跡免疫分析；分離重組DNA，檢測插入片段大小，測序等。4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新目的基因的分離目的基因的序列克隆法根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基因用核酸探針進行雜交篩選：根據(jù)已知序列合成相應探針，再與基因組文庫的克隆進行雜交，篩選陽性克隆，最后分離鑒定表達序列標簽（EST）法分離目的基因表達序列標簽（expressedsequencetagEST）:是指基因序列中一段能特異地標記或表征基因的序列。4/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新篩選目的基因片斷的差別雜交及減法雜交技術差別雜交（differentialhybridization）法應用前提：需要擁有兩種不同的細胞群，即在一個細胞群中目的基因能正常生長，而在另一細胞群中目的基因不表達。Fig4-21減法雜交（subtractivehybridization）技術mRNA減法雜交

fig4-22基因組DNA減法雜交

fig4-234/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新利用差示分析法分離目的基因克隆mRNA差別顯示技術（DD-PCR,DDRT-PCR）

fig4-24抑制性減法雜交（SSH）技術該法是一種用于分離和鑒定差異表達基因的革命性方法，特別適宜于那些差異表達量很低的基因，其富集效率在1000倍以上。待測ds-cDNA（testercDNA）和驅動ds-cDNA（drivercDNA）fig4-264/11/2024蘇州科技學院生物系葉亞新

4.染色體巡查法(chromosomewalking)1)原理

利用DNA探針篩選對應重組DNA，然后以插入片段兩末端片段為探針選擇對應重組DNA，此次篩選的DNA插入片段僅以一端為探針，繼續(xù)和重復該過程，直至篩選到目的基因優(yōu)點：可獲得染色體中一段DNA的限制酶圖譜，對基因組全序列測定十分有用缺點：工作量大，鑒定困難，當巡查高等真核生物染色體時，重復DNA序列區(qū)域難以跨越。必要條件：兩基因間距離應清楚。*該法的兩大難點：限制酶圖制作和末端片段探針制備。前者可用改進的載體，后者可用RNA聚合酶合成末端探針2)操作步驟4/11/2024蘇州科技學院