高效液相色譜-化學發(fā)光分析研究

高效液相色譜—化學發(fā)光分析研究一、本文概述本文旨在深入探討高效液相色譜（HPLC）與化學發(fā)光分析（CLA）的聯(lián)合應用，分析其在化學分析領域中的優(yōu)勢、挑戰(zhàn)以及未來的發(fā)展趨勢。高效液相色譜作為一種高效的分離技術，已被廣泛應用于各類化合物的分離和純化。而化學發(fā)光分析，以其高靈敏度、寬線性范圍、低背景干擾等優(yōu)點，在痕量分析、生物分子檢測等領域具有廣闊的應用前景。將這兩種技術相結合，不僅可以提高分析的準確性和靈敏度，還可以拓寬其應用領域，為復雜樣品的分析提供新的手段。本文首先介紹高效液相色譜和化學發(fā)光分析的基本原理和特點，然后重點闡述HPLCCLA聯(lián)用技術的基本原理、實驗裝置、操作流程以及關鍵影響因素。在此基礎上，通過實例分析，探討HPLCCLA聯(lián)用技術在藥物分析、環(huán)境污染物檢測、生物樣品分析等領域的應用，并對其在實際應用中的優(yōu)勢與局限性進行評估。對HPLCCLA聯(lián)用技術的發(fā)展趨勢和未來的研究方向進行展望，以期為相關領域的研究人員提供有益的參考和啟示。二、高效液相色譜技術高效液相色譜（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）技術是一種廣泛應用于化學和生物化學領域的分離和分析技術。其基于液液分配原理，將流動相和固定相之間的相互作用作為分離混合物的基礎，使得不同物質在色譜柱中具有不同的保留時間，從而實現(xiàn)物質的分離和純化。相較于傳統(tǒng)的液相色譜，HPLC具有更高的分離效能、更快的分析速度和更高的靈敏度，因此在現(xiàn)代分析化學中占據(jù)了重要地位。在HPLC中，色譜柱是關鍵部件，其填料類型和粒度大小對分離效果有著決定性影響。常見的填料類型包括硅膠、氧化鋁、聚合物等，而粒度大小則通常在幾微米至幾十微米之間。流動相的選擇同樣重要，需要根據(jù)待測物質的性質和分離要求進行優(yōu)化。通常，流動相由有機溶劑和水組成，通過調(diào)節(jié)溶劑比例、pH值和添加劑的種類和濃度等參數(shù)，可以控制待測物質在色譜柱上的保留行為。除了色譜柱和流動相外，檢測器也是HPLC系統(tǒng)的重要組成部分。常用的檢測器包括紫外可見檢測器、熒光檢測器和化學發(fā)光檢測器等。這些檢測器具有高靈敏度、高穩(wěn)定性和高分辨率等優(yōu)點，可以對分離后的組分進行定性和定量分析。在化學發(fā)光分析研究中，HPLC與化學發(fā)光檢測器的結合具有顯著優(yōu)勢。通過HPLC實現(xiàn)待測物質的分離和純化后，化學發(fā)光檢測器可以對待測物質進行高靈敏度的檢測。這種聯(lián)用技術不僅提高了分析的準確性和可靠性，還拓寬了化學發(fā)光分析的應用范圍。高效液相色譜技術是一種強大的分離和分析工具，在化學發(fā)光分析研究中發(fā)揮著重要作用。通過不斷優(yōu)化色譜條件、選擇合適的檢測器以及與其他分析技術的聯(lián)用，可以進一步提高HPLC在化學發(fā)光分析中的應用效果。三、化學發(fā)光分析技術化學發(fā)光分析技術是一種基于化學反應產(chǎn)生的光輻射進行物質分析和測定的方法。該技術結合了化學發(fā)光的高靈敏度和高效液相色譜的高分辨率，使得對復雜樣品中的痕量組分進行快速、準確的定量分析成為可能?；瘜W發(fā)光分析技術的核心在于化學反應中的能量轉化。當某些特定的化學反應發(fā)生時，會釋放出化學能，這些能量轉化為光能，形成光輻射。這些光輻射的強度和波長與反應的類型、濃度、溫度等條件密切相關。通過測量光輻射的強度和波長，可以實現(xiàn)對反應物濃度的定量和定性分析。在高效液相色譜—化學發(fā)光分析技術中，高效液相色譜首先將復雜樣品中的各組分進行分離，然后通過化學發(fā)光反應對分離后的組分進行測定。這種方法的優(yōu)點在于，它既可以避免組分間的干擾，提高分析的準確性，又可以利用化學發(fā)光的高靈敏度，實現(xiàn)對痕量組分的檢測?；瘜W發(fā)光分析技術的另一個重要優(yōu)點是它的實時性。由于光輻射的產(chǎn)生與化學反應的進行同步，因此可以實時監(jiān)測反應的過程和結果，這對于研究反應機理、優(yōu)化反應條件等具有重要意義。化學發(fā)光分析技術也存在一些挑戰(zhàn)和限制。例如，化學發(fā)光反應的選擇性較差，可能受到多種因素的干擾。一些化學發(fā)光反應的靈敏度雖然高，但線性范圍較窄，對于高濃度組分的測定可能存在一定的困難。在實際應用中，需要根據(jù)具體的需求和條件，選擇合適的化學發(fā)光反應和測定方法。高效液相色譜—化學發(fā)光分析技術是一種強大的分析工具，它為復雜樣品中的痕量組分分析提供了有效的手段。隨著科學技術的不斷發(fā)展，我們有理由相信，這一技術將在未來的化學分析領域發(fā)揮更大的作用。四、高效液相色譜—化學發(fā)光分析聯(lián)用技術隨著分析技術的不斷進步，高效液相色譜（HPLC）與化學發(fā)光分析（CLA）的聯(lián)用技術逐漸成為了分析化學領域的研究熱點。該技術將HPLC的高效分離能力與CLA的高靈敏度、高選擇性特點相結合，實現(xiàn)了對復雜樣品中痕量組分的高精度、高靈敏度檢測。HPLCCLA聯(lián)用技術的核心在于將HPLC的流出液直接導入CLA檢測器，通過特定的化學反應將待測組分轉化為發(fā)光物質，進而實現(xiàn)對待測組分的定量分析。這種聯(lián)用技術不僅保留了HPLC的高分辨率和高分離效能，還顯著提高了CLA分析的選擇性和靈敏度。在HPLCCLA聯(lián)用技術的應用中，化學發(fā)光試劑的選擇至關重要。選擇合適的化學發(fā)光試劑需要與待測組分發(fā)生高效、特異的化學反應，生成穩(wěn)定的發(fā)光物質。同時，還需要考慮發(fā)光反應的動力學特性，以確保反應的快速性和完全性。HPLCCLA聯(lián)用技術還面臨著一些挑戰(zhàn)。例如，流動相的選擇需要兼顧HPLC的分離效果和CLA的發(fā)光效率樣品的預處理和凈化過程也需要優(yōu)化，以減少背景干擾和提高分析準確性。盡管如此，HPLCCLA聯(lián)用技術在許多領域仍展現(xiàn)出了廣闊的應用前景。例如，在環(huán)境監(jiān)測領域，該技術可用于痕量有機污染物的檢測在藥物分析領域，可用于藥物代謝產(chǎn)物的定性和定量分析在生物醫(yī)學領域，可用于生物活性物質和生物標記物的檢測等。高效液相色譜—化學發(fā)光分析聯(lián)用技術是一種具有廣闊應用前景的分析方法。通過不斷優(yōu)化技術細節(jié)和拓展應用領域，相信該技術將在未來的分析化學領域中發(fā)揮更加重要的作用。五、實驗研究本實驗旨在通過高效液相色譜（HPLC）與化學發(fā)光分析技術的結合，對特定樣品中的目標化合物進行高靈敏度、高分辨率的定量與定性分析。實驗過程中，我們優(yōu)化了色譜條件、化學發(fā)光試劑的選擇及反應條件，以期達到最佳的分離效果和發(fā)光信號強度。我們選擇了合適的色譜柱和流動相，通過調(diào)整流速和梯度洗脫程序，實現(xiàn)了目標化合物與其他組分的有效分離。同時，我們對樣品的預處理方法進行了優(yōu)化，以提高目標化合物的提取效率和純度。在化學發(fā)光分析方面，我們篩選了多種發(fā)光試劑，并通過對比實驗確定了最佳的發(fā)光體系。同時，我們對發(fā)光反應的條件進行了詳細研究，包括反應溫度、pH值、發(fā)光試劑的濃度等，以獲取最大的發(fā)光信號強度和穩(wěn)定性。實驗過程中，我們采用了內(nèi)標法和外標法對目標化合物進行定量分析，并通過對比實驗結果，驗證了方法的準確性和可靠性。我們還利用HPLC化學發(fā)光聯(lián)用技術對實際樣品進行了分析，并成功檢測到了目標化合物的存在。通過本實驗，我們驗證了HPLC化學發(fā)光聯(lián)用技術在復雜樣品分析中的優(yōu)越性和實用性。該方法不僅具有高靈敏度、高分辨率和高選擇性等優(yōu)點，還可實現(xiàn)對目標化合物的快速、準確和可靠分析。該技術在環(huán)境監(jiān)測、食品安全、生物醫(yī)藥等領域具有廣泛的應用前景。同時，我們也意識到在實驗過程中存在一些不足和需要改進的地方。例如，樣品的預處理過程可能會引入一些干擾物質，影響目標化合物的分離和檢測效果發(fā)光試劑的穩(wěn)定性和發(fā)光效率也有待進一步提高。在未來的研究中，我們將繼續(xù)優(yōu)化實驗條件和方法，以提高HPLC化學發(fā)光聯(lián)用技術的分析性能和應用范圍。本實驗通過HPLC化學發(fā)光聯(lián)用技術成功實現(xiàn)了對特定樣品中目標化合物的高靈敏度、高分辨率分析。實驗結果表明，該技術具有廣泛的應用前景和實用價值，為環(huán)境監(jiān)測、食品安全、生物醫(yī)藥等領域的研究提供了有力的技術支持。六、總結與展望本文系統(tǒng)地探討了高效液相色譜（HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC）與化學發(fā)光檢測（ChemiluminescenceDetection,CLD）相結合的方法在分析研究中的應用與發(fā)展。通過對相關理論基礎、實驗技術、實際案例以及最新研究成果的綜述，我們得以對這一復合技術體系有了全面而深入的認識?；仡櫛狙芯康暮诵膬?nèi)容，高效液相色譜—化學發(fā)光分析憑借其獨特的分離效能與高靈敏度檢測優(yōu)勢，在眾多分析領域展現(xiàn)出了顯著的應用價值。HPLC以其高效分離、良好重現(xiàn)性及對復雜樣品處理能力強等特性，能夠有效地分離目標化合物及潛在干擾物質，為后續(xù)精確檢測奠定基礎。而CLD作為非放射性、高選擇性且動態(tài)范圍寬的檢測手段，尤其適用于痕量物質的定量分析，其與HPLC聯(lián)用時，通過化學反應引發(fā)的光信號，實現(xiàn)了對流出色譜柱的組分進行實時、無背景干擾的檢測，顯著提升了分析的靈敏度和特異性。在方法優(yōu)化與技術創(chuàng)新方面，本研究著重闡述了色譜條件優(yōu)化（如流動相組成、梯度洗脫程序）、色譜柱選擇（如固定相性質、粒徑大?。⒒瘜W發(fā)光體系的改進（如新型發(fā)光試劑、增強劑的研發(fā)與應用）以及數(shù)據(jù)處理技術的進步（如多變量校正、深度學習輔助定性定量），這些策略共同推動了HPLCCLD方法的性能提升與適用范圍拓展。實際應用案例的研究則進一步驗證了該技術在環(huán)境監(jiān)測、食品安全、藥物分析、生物標志物檢測等領域的廣泛適用性和卓越性能。展望未來，高效液相色譜—化學發(fā)光分析的研究與應用有望在以下幾個方向取得突破與進展：微型化與便攜化：隨著微流控技術、芯片實驗室（LabonaChip）等前沿科技的發(fā)展，HPLCCLD系統(tǒng)的微型化與集成化將成為趨勢。這不僅將大幅縮小設備體積，降低實驗成本，更有可能實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，對于環(huán)境突發(fā)事件、臨床即時診斷等場景具有重大意義。智能化與自動化：人工智能、機器學習算法的融入，將助力HPLCCLD系統(tǒng)實現(xiàn)自動優(yōu)化操作條件、智能識別復雜樣品中的未知成分、預測分析結果等高級功能，顯著提高分析效率并減少人為誤差。新型發(fā)光體系開發(fā)：繼續(xù)探索新型高效的化學發(fā)光試劑、更靈敏的信號轉換機制以及穩(wěn)定的能量轉移途徑，有望進一步提升檢測限，拓寬線性范圍，適應更廣泛的分析目標和更苛刻的樣品條件。多維度與多模式聯(lián)用：結合其他先進分析技術如質譜、熒光、電化學等，構建多維度、多模式的聯(lián)合檢測平臺，可實現(xiàn)對復雜樣品中多種信息的同時獲取，提高定性與定量的準確性，滿足深層次、全方位的分析需求。標準與法規(guī)建設：隨著HPLCCLD方法在各領域的廣泛應用，制定統(tǒng)一的標準操作規(guī)程、認證參考物質，以及推動相關法規(guī)與指南的完善，將有助于確保分析結果的可靠性和可比性，促進其在全球范圍內(nèi)的規(guī)范使用與認可。高效液相色譜—化學發(fā)光分析作為一項極具潛力的分析技術，其未來發(fā)展將深度融合現(xiàn)代科學技術的最新成果，不斷突破性能極限，拓寬應用邊界，為解決復雜體系中痕量、微量物質的精準測定問題提供更為強大而靈活的工具。參考資料：高效液相色譜（HPLC）是一種常用的分離和分析方法，主要用于分析有機化合物和生物分子。傳統(tǒng)的HPLC檢測方法往往需要使用有毒的化學試劑，這不僅對環(huán)境造成污染，而且可能對實驗人員的健康構成威脅。研究一種綠色、環(huán)保的檢測技術是色譜學領域的重要方向。本文將探討高效液相色譜在線電生試劑化學發(fā)光檢測技術，旨在解決傳統(tǒng)檢測方法的不足。高效液相色譜在線電生試劑化學發(fā)光檢測技術結合了電化學反應和化學發(fā)光反應，通過在線生成試劑實現(xiàn)化學發(fā)光的檢測。在色譜分離過程中，當流動相經(jīng)過電化學反應器時，流動相中的分析物在電極表面被氧化或還原，生成具有高化學發(fā)光活性的中間體。這些中間體與特定的發(fā)光劑反應產(chǎn)生化學發(fā)光，通過光電倍增管等檢測器進行檢測。該技術具有靈敏度高、選擇性好、無需使用有毒試劑等優(yōu)點。高效液相色譜在線電生試劑化學發(fā)光檢測技術已廣泛應用于各種分析領域，如藥物分析、環(huán)境分析和生命科學研究等。在藥物分析中，該技術可用于新藥開發(fā)過程中的藥物代謝和藥物動力學研究，以及藥品質量控制和臨床藥物監(jiān)測。在環(huán)境分析中，該技術可用于研究環(huán)境污染物如重金屬、有機氯化合物等的遷移和轉化。在生命科學研究中，該技術可用于研究生物分子如蛋白質、核酸、神經(jīng)遞質等的相互作用和構象變化。盡管高效液相色譜在線電生試劑化學發(fā)光檢測技術在許多領域取得了成功應用，但仍面臨一些挑戰(zhàn)。例如，如何提高化學發(fā)光的效率和穩(wěn)定性仍然是亟待解決的問題。由于不同領域的應用需要應對不同的復雜樣品和檢測目標，因此開發(fā)更具通用性和適應性的檢測系統(tǒng)也是未來的研究方向。隨著科學技術的發(fā)展，我們有理由相信高效液相色譜在線電生試劑化學發(fā)光檢測技術將在更多領域得到廣泛應用，為人類的發(fā)展和健康做出更大的貢獻。我們期待未來的研究能夠進一步優(yōu)化該技術的反應條件和檢測系統(tǒng)，提高其靈敏度和選擇性，以適應更廣泛的分析需求。同時，我們也希望看到該技術在實時監(jiān)測、臨床診斷和過程控制等方面的應用得到進一步拓展，為人類的健康和生活帶來更多便利。高效液相色譜在線電生試劑化學發(fā)光檢測技術是一種綠色、環(huán)保的檢測方法，具有高靈敏度、高選擇性和無需使用有毒試劑等優(yōu)點。本文介紹了該技術的基本原理、應用領域以及面臨的挑戰(zhàn)和未來的發(fā)展前景。盡管該技術仍存在一些不足和挑戰(zhàn)，但隨著科學技術的發(fā)展，我們有理由相信該技術將在未來得到更廣泛的應用和發(fā)展。高效液相色譜法（HighPerformanceLiquidChromatography\HPLC）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。該方法已成為化學、醫(yī)學、工業(yè)、農(nóng)學、商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術應用。1903年俄國植物化學家茨維特（Tswett）首次提出“色譜法”（Chromatography）和“色譜圖”（Chromatogram）的概念。茨維特使用色譜法chromatography（來自希臘字，chroma意思是顏色，graphy意思是記錄-直譯為顏色記錄）來描述他的彩色試驗。（令人好奇的是,俄羅斯名字茨維特意思是顏色。）他在論文中寫到：“（原文）一植物色素的石油醚溶液從一根主要裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管上端加入，沿管濾下，后用純石油醚淋洗，結果按照不同色素的吸附順序在管內(nèi)觀察到它們相應的色帶，就象光譜一樣，稱之為色譜圖?！?930年以后，相繼出現(xiàn)了紙色譜、離子交換色譜和薄層色譜等液相色譜技術。1952年，英國學者Martin和Synge基于他們在分配色譜方面的研究工作，提出了關于氣－液分配色譜的比較完整的理論和方法，把色譜技術向前推進了一大步，這是氣相色譜在此后的十多年間發(fā)展十分迅速的原因。1958年，基于Moore和Stein的工作，離子交換色譜的儀器化導致了氨基酸分析儀的出現(xiàn)，這是近代液相色譜的一個重要嘗試，但分離效率尚不理想。1960年中后期，氣相色譜理論和實踐發(fā)展，以及機械、光學、電子等技術上的進步，液相色譜又開始活躍。到60年代末期把高壓泵和化學鍵合固定相用于液相色譜就出現(xiàn)了HPLC。1970年中期以后，微處理機技術用于液相色譜，進一步提高了儀器的自動化水平和分析精度。1990年以后，生物工程和生命科學在國際和國內(nèi)的迅速發(fā)展，為高效液相色譜技術提出了更多、更新的分離、純化、制備的課題，如人類基因組計劃，蛋白質組學有HPLC作預分離等。①高壓：流動相為液體，流經(jīng)色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。②高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時。③高效：分離效能高。可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。⑤應用范圍廣：百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢。⑦樣品量少、容易回收：樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。此外高效液相色譜還有色譜柱可反復使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點，但也有缺點，與氣相色譜相比各有所長，相互補充。高效液相色譜的缺點是有“柱外效應”。在從進樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。1．吸附色譜法(AdsorptionChromatography)2．分配色譜法(PartitionChromatography)4．分子排阻色譜法/凝膠色譜法(SizeExclusionChromatography)5．鍵合相色譜法（bonded-phasechromatography）6．親和色譜法(AffinityChromatography)可分為“高壓輸液泵”、“色譜柱”、“進樣器”、“檢測器”、“餾分收集器”以及“數(shù)據(jù)獲取與處理系統(tǒng)”等部分。液相色譜和質譜連接，可以增加額外的分析能力，能夠準確鑒定和定量像細胞和組織裂解液，血液，血漿，尿液和口腔液等復雜樣品基質中的微量化合物。高效液相色譜質譜系統(tǒng)（ABSciexEksigentLC/MS和LC/MS/MS）提供了一些獨特的優(yōu)勢，包括：流量穩(wěn)定（±1)，耐高壓(30～60Mpa)，耐各種流動相：例如：有機溶劑、水和緩沖液；如果所進行的色譜分離不是為了純粹的色譜分析，而是為了做其它波譜鑒定，或獲取少量試驗樣品的小型制備，餾分收集是必要的；(Liquid-liquidPartitionChromatography)及化學鍵合相色譜(ChemicallyBondedPhaseChromatography)流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間進行分配。達到平衡時，服從于高效液相色譜計算公式：式中，cs—溶質在固定相中濃度；cm—溶質在流動相中的濃度；Vs—固定相的體積；Vm—流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決于K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。a.正相液-液分配色譜法(NormalPhaseliquidChromatography):流動相的極性小于固定液的極性。b.反相液-液分配色譜法(ReversePhaseliquidChromatography):流動相的極性大于固定液的極性。c.液-液分配色譜法的缺點：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀70年代末發(fā)展的化學鍵合固定相（見后），可克服上述缺點。流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據(jù)物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分子()和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發(fā)生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S)，可表示如下：mnSa======anSm式中：m--流動相中的溶質分子；Sa--固定相中的溶劑分子；a--固定相中的溶質分子；Sm--流動相中的溶劑分子。IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據(jù)這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下：-（溶劑中）(樹脂-R4NCl-)===（樹脂-R4N-)Cl-（溶劑中）凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。離子對色譜法是將一種(或多種)與溶質分子電荷相反的離子(稱為對離子或反離子)加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。其原式中：水相--流動相中待分離的有機離子（也可是陽離子）；Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；Y---形成的離子對化合物。離子對色譜法（特別是反相）解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物堿以及藥物等分離。用離子交換樹脂為固定相，電解質溶液為流動相。以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾，設置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。以陰離子交換樹脂(R-OH)作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當待測陰離子Br-隨流動相(NaOH)進入色譜柱時，發(fā)生如下交換反應（洗脫反應為交換反應的逆過程）：可見，通過抑制柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水，消除了本底電導的影響；試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸HBr-，可用電導法靈敏的檢測。(StericExclusionChromatography)空間排阻色譜法以凝膠(gel)為固定相。它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數(shù)納米到數(shù)百納米。溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離，而是按分子大小進行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質的流動力學體積或分子大小有關。試樣進入色譜柱后，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現(xiàn)，一些很小的分子可以進入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現(xiàn)。流程：如圖1所示，溶劑貯器⑴中的流動相被泵⑵吸入，經(jīng)〔3〕梯度控制器按一定的梯度進行混合然后輸出，經(jīng)⑷測其壓力和流量，導入(5進樣閥（器）經(jīng)⑹保護柱、⑺分離柱后到⑻檢測器檢測，由⑽數(shù)據(jù)處理設備處理數(shù)據(jù)或⑾記錄儀記錄色譜圖，⑿餾分收集器收集餾分，⒀為廢液。色譜圖(chromatogram)——樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線(elutionprofile)?；€(baseline)——經(jīng)流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應平行于時間軸。噪音(noise)——基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩(wěn)定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。漂移(drift)——基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產(chǎn)生漂移。色譜峰(peak)——組分流經(jīng)檢測器時響應的連續(xù)信號產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少見?！吨袊幍洹芬?guī)定fn=95~05為正常峰，fn<95為前延峰，fn>05為拖尾峰。峰寬（peakwidth，W)—峰兩側拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。W=4σ半峰寬（peakwidthathalf-height，Wh/2)—峰高一半處的峰寬。Wh/2=355σ保留時間(retentiontime，tR)——從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間。理論塔板數(shù)(theoreticalplatenumber，N)——用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。分離度(resolution，R)——相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R≥5稱為完全分離。拖尾因子(tailingfactor，T)——T=，用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetryfactor)或不對稱因子(asymmetryfactor)。應按各品種項下的規(guī)定，常用的色譜柱填料有硅膠和化學鍵合硅膠。后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用辛基鍵合硅膠次之，氰基或氨基鍵合硅膠也有使用；離子交換填料用于離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用于分子排阻色譜等。注樣量一般為數(shù)微升。除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。在用紫外吸收檢測器時，所用流動相應符合紫外分光光度法項下對溶劑的要求。正文中各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變。以適應具體品種并達到系統(tǒng)適用性試驗的要求。一般色譜圖約于20分鐘內(nèi)記錄完畢。按各品種項下要求對儀器進行適用性試驗，即用規(guī)定的對照品對儀器進行試驗和調(diào)整，應達到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)、分離度和拖尾因子.在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內(nèi)標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標物質峰的保留時間t(R)和半高峰寬W(h/2)，按n=54^2計算色譜柱的理論板數(shù)，如果測得理論板數(shù)低于各品種項下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等），使理論板數(shù)達到要求。定量分析時，為便于準確測量，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標峰之間有較好的分離度。分離度(R)的計算公式為：R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)，式中t(R2)為相鄰兩峰中后一峰的保留時間；t(R1)為相鄰兩峰中前一峰的保留時間；W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。除另外有規(guī)定外，分離度應大于5。為保證測量精度，特別當采用峰高法測量時，應檢查待測峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項下的規(guī)定或不同濃度進樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計算公式為：T(拖尾因子)=W05h/2d1式中W(05h)為05峰高處的峰寬；d1為峰極大至峰前沿之間的距離。除另有規(guī)定外,T應在95～05間。也可按各品種校正因子測定項下，配制相當于80%、100%和120%的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別注樣3次，計算平均校正因子，其相對標準偏差應不大于0%。定量測定時，可根據(jù)樣品的具體情況采用峰面積法或峰高法。但用歸一法或內(nèi)標法測定雜質總量時，須采用峰面積法。測定供試品（或經(jīng)衍生化處理的供試品）中各雜質及雜質的總量限度采用不加校正因子的峰面積歸一法。計算各雜質峰面積及其總和，并求出占總峰面積的百分率。但溶劑峰不計算在內(nèi)。色譜圖的記錄時間應根據(jù)各品種所含雜質的保留時間決定，除另有規(guī)定外可為該品種項下主成分保留時間的倍數(shù)。當雜質峰面積與成分峰面積相差懸殊時，采用主成分自身對照法。在測定前，先按各品種項下規(guī)定的雜質限度，將供試品稀釋成一定濃度的溶液作為對照溶液，進樣，調(diào)節(jié)檢測器的靈敏度或進樣量，使對照溶液中的主成分色譜峰面積滿足準確測量要求。然后取供試品溶液，進樣，記錄時間，除另有規(guī)定外，應為主成分保留時間的倍數(shù)。根據(jù)測得的供試品溶液的各雜質峰面積及其總和并和對照溶液主成分的峰面積比較，計算雜質限度。采用不加校正因子的峰面積法。取供試品，按各品種項下規(guī)定的方法配制不含內(nèi)標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖Ⅰ；再配制含有內(nèi)標物質的供試品溶液，在同樣的條件下注樣，記錄色譜圖Ⅱ。記錄的時間除另有規(guī)定外，應為該品種項下規(guī)定的內(nèi)標峰保留時間的倍數(shù)，色譜圖上內(nèi)標峰高應為記錄儀滿標度的30%以上，否則應調(diào)整注樣量或檢測器靈敏度。如果色譜圖Ⅰ中沒有與色譜圖Ⅱ上內(nèi)標峰保留時間相同的雜質峰，則色譜圖Ⅱ中各雜質峰面積之和應小于內(nèi)標物質峰面積（溶劑峰不計在內(nèi)）。如果色譜圖Ⅰ中有與色譜圖Ⅱ上內(nèi)標物質峰保留時間相同的雜質峰，應將色譜圖Ⅱ上的內(nèi)標物質峰面積減去色譜圖Ⅰ中此雜質峰面積，即為內(nèi)標物質峰的校正面積；色譜圖Ⅱ中各雜質峰總面積加色譜圖Ⅰ中此雜峰面積，即為各雜質峰的校正總面積，各雜質峰的校正總面積應小于內(nèi)標物質峰的校正面積。按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內(nèi)標物質，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和內(nèi)標物質的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：As/ms]校正因子f=-Ar/mr式中As為內(nèi)標物質的峰面積或峰高,Ar為對照品的峰面積或峰高；ms為加入內(nèi)標物質的量mr為加入對照品的量。再取各品種項下含有內(nèi)標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品（或其雜質）峰和內(nèi)標物質的峰面積或峰高，按下式計算含量：Ax含量(mx)=f×-As/ms式中Ax為供試品（或其雜質）峰面積或峰高；mx為供試品（或其雜質）的量。f、As和ms的意義同上。當配制校正因子測定用的對照溶液和含有內(nèi)標物質的供試品溶液使用同一分內(nèi)標物質溶液時，則配制內(nèi)標物質溶液不必精密稱（量）取。按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和供試品待測成分的峰面積（或峰高），按下式計算含量：由于微量注射器不易精確控制進樣量，當采用外標法測定供試品中某雜質或主成分含量時，以定量環(huán)進樣為好。要正確地選擇色譜分離方法，首先必須盡可能多的了解樣品的有關性質，其次必須熟悉各種色譜方法的主要特點及其應用范圍。選擇色譜分離方法的主要根據(jù)是樣品的相對分子質量的大小，在水中和有機溶劑中的溶解度，極性和穩(wěn)定程度以及化學結構等物理、化學性質。對于相對分子質量較低（一般在200以下），揮發(fā)性比較好，加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進行分析。相對分子質量在200~2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和離子交換色譜法。相對分子質量高于2000，則可用空間排阻色譜法。水溶性樣品最好用離子交換色譜法和液液分配色譜法；微溶于水，但在酸或堿存在下能很好電離的化合物，也可用離子交換色譜法；油溶性樣品或相對非極性的混合物，可用液-固色譜法。若樣品中包含離子型或可離子化的化合物，或者能與離子型化合物相互作用的化合物（例如配位體及有機螯合劑），可首先考慮用離子交換色譜，但空間排阻和液液分配色譜也都能順利地應用于離子化合物；異構體的分離可用液固色譜法；具有不同官能團的化合物、同系物可用液液分配色譜法；對于高分子聚合物，可用空間排阻色譜法。HPLC的出現(xiàn)不過三十多年的時間，但這種分離分析技術的發(fā)展十分迅猛，應用十分廣泛。其儀器結構和流程多種多樣。典型的高效液相色譜儀結構和流程可用下列方框圖表示(SeeFig.3-4)。高效液相色譜儀一般都具備貯液器、高壓泵、梯度洗提裝置（用雙泵）、進樣器、色譜柱、檢測器、恒溫器、記錄儀等主要部件。高效液相色譜更適宜于分離、分析高沸點、熱穩(wěn)定性差、有生理活性及相對分子量比較大的物質，因而廣泛應用于核酸、肽類、內(nèi)酯、稠環(huán)芳烴、高聚物、藥物、人體代謝產(chǎn)物、表面活性劑，抗氧化劑、殺蟲劑、除銹劑的分析等物質的分析。HPLC使用的色譜柱是很細的(1~6mm)，所用固定相的粒度也非常?。◣爪蘭到幾十μm)，所以流動相在柱中流動受到的阻力很大，在常壓下，流動相流速十分緩慢，柱效低且費時。為了達到快速、高效分離，必須給流動相施加很大的壓力，以加快其在柱中的流動速度。為此，須用高壓泵進行高壓輸液。高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。HPLC使用的高壓泵應滿足下列條件：a.流量恒定，無脈動，并有較大的調(diào)節(jié)范圍（一般為1~10mL/min)；c.有較高的輸液壓力；對一般分離，60×10^5Pa的壓力就滿足了，對高效分離，要求達到150~300×10^5Pa。當柱塞推入缸體時，泵頭出口（上部）的單向閥打開，同時，流動相進入的單向閥（下部）關閉，這時就輸出少量的流體。反之，當柱塞向外拉時，流動相入口的單向閥打開，出口的單向閥同時關閉，一定量的流動相就由其儲液器吸入缸體中。這種泵的特點是不受整個色譜體系中其余部分阻力稍有變化的影響，連續(xù)供給恒定體積的流動相。其工作原理是：壓力為p1的低壓氣體推動大面積（SA）活塞A，則在小面積（SB）活塞B輸出壓力增大至p2的液體。壓力增大的倍數(shù)取決于A和B兩活塞的面積比，如果A與B的面積之比為50:1，則壓力為5×Pa的氣體就可得到壓力為250×Pa的輸出液體。這是一種恒壓泵。類似于GC中的程序升溫。已成為現(xiàn)代高效液相色譜中不可缺少的部分。梯度洗提，就是載液中含有兩種（或更多）不同極性的溶劑，在分離過程中按一定的程序連續(xù)改變載液中溶劑的配比和極性，通過載液中極性的變化來改變被分離組分的分離因素，以提高分離效果。梯度洗提可以分為兩種：a.低壓梯度（也叫外梯度）：在常壓下，預先按一定程序將兩種或多種不同極性的溶劑混合后，再用一臺高壓泵輸入色譜柱。b.高壓梯度(或稱內(nèi)梯度系統(tǒng))：利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按設定的比例送入梯度混合室，混合后，進入色譜柱。⑴注射器進樣裝置：進樣所用微量注射器及進樣方式與GC法一樣。進樣壓力150×10^5Pa時，必須采用停流進樣。⑵高壓定量進樣閥：與GC法用的流通法相似，能在高壓下進樣。色譜柱是色譜儀最重要的部件（心臟）。通常用厚壁玻璃管或內(nèi)壁拋光的不銹鋼管制作的，對于一些有腐蝕性的樣品且要求耐高壓時，可用銅管、鋁管或聚四氟乙烯管。柱子內(nèi)徑一般為1～6mm。常用的標準柱型是內(nèi)徑為6或9mm，長度為15～30cm的直形不銹鋼柱。填料顆粒度5～10μm，柱效以理論塔板數(shù)計大約7000～10000。它的作用原理是基于被分析試樣組分對特定波長紫外光的選擇性吸收，組分濃度與吸光度的關系遵守比爾定律。最常用的檢測器，應用最廣，對大部分有機化合物有響應。a.靈敏度高：其最小檢測量10-9g·mL-1,故即使對紫外光吸收很弱的物質，也可以檢測；c.流通池可做的很小(1mm×10mm，容積8μL)；e.波長可選，易于操作：如，使用裝有流通池的可見紫外分光光度計（可變波長檢測器）。缺點：對紫外光完全不吸收的試樣不能檢測；同時溶劑的選擇受到限制。紫外檢測器的重要進展；陣列由1024個光電二極管陣列，每個光電二極管寬僅50μm，各檢測一窄段波長。在檢測器中，光源發(fā)出的紫外或可見光通過液相色譜流通池，在此流動相中的各個組分進行特征吸收，然后通過狹縫，進入單色其進行分光，最后由光電二極管陣列檢測，得到各個組分的吸收信號。經(jīng)計算機快速處理，得三維立體譜圖。對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應。差示折光檢測器是借連續(xù)測定流通池中溶液折射率的方法來測定試樣濃度的檢測器。溶液的折射率是純?nèi)軇鲃酉啵┖图內(nèi)苜|（試樣）折射率乘以各物質的濃度之和。因此溶有試樣的流動相和純流動相之間折射率之差表示試樣在流動相中的濃度。其作用原理是根據(jù)物質在某些介質中電離后所產(chǎn)生電導變化來測定電離物質含量。采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。一般用非極性固定相（如CC8)；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計，它占整個HPLC應用的80%左右。高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要氣化，因此不受試樣揮發(fā)性的限制。對于高沸點、熱穩(wěn)定性差、相對分子量大（大于400以上）的有機物（這些物質幾乎占有機物總數(shù)的75%～80%）原則上都可應用高效液相色譜法來進行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70～80%。流動相：20%甲醇-水～100%甲醇；線性梯度淋洗2%/min流動相：003mol·L-1NaHCO3/0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr。七種陰離子在20分鐘內(nèi)基本上得到完全分離，各組分含量在3～50ppm。液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。高效液相色譜法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(HighPressureLiquidChromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(HighSpeedLiquidChromatography，HSLP)。也稱現(xiàn)代液相色譜。高效液相色譜法（HPLC）是一種常用的分離分析技術，自20世紀60年代問世以來，經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，已經(jīng)成為許多領域不可或缺的分析工具。它的出現(xiàn)極大地推動了色譜分析技術的發(fā)展，并在化學、生物學、醫(yī)學、環(huán)境科學等領域發(fā)揮了重要作用。HPLC的發(fā)展可以追溯到20世紀60年代初期。當時，為了解決氣相色譜法在分離復雜混合物時的困難，科學家們開始探索使用液體作為流動相的可能性。1960年，馬丁和辛格提出了液固吸附色譜法，這是HPLC的雛形。在此基礎上，科學家們不斷優(yōu)化分離介質和流動相，逐漸發(fā)展出了高效液相色譜法。1965年，戈雷利克等人引入了微粒固定相的概念，并成功地分離了氨基酸和胺類化合物。這一突破使得HPLC的分離效率大大提高，為該技術的廣泛應用奠定了基礎。隨著技術的不斷完善，高效液相色譜法逐漸成為一種可靠、高效的分離分析方法。進入20世紀70年代，隨著高分子合成技術的發(fā)展，科學家們開始研究使用有機聚合物作為固定相。這一進展使得HPLC的分離性能得到進一步提升，能夠更好地適應復雜混合物的分離分析。20世紀80年代，隨著計算機技術和檢測器技術的發(fā)展，高效液相色譜法的自動化程度和靈敏度得到了顯著提高。這為HPLC在生命科學、藥物開發(fā)、環(huán)境監(jiān)測等領域的應用提供了有力支持。進入21世紀以來，高效液相色譜法在理論、技術和應用方面都取得了重要進展。新型固定相和流動相的研發(fā)、超高壓液相色譜技術的發(fā)展以及與質譜等檢測技術的聯(lián)用，進一步拓展了高效液相色譜法的應用范圍。高效液相色譜法自20世紀60年代誕生以來，經(jīng)歷了數(shù)十年的發(fā)展歷程。從最初的液固吸附色譜法到現(xiàn)代的高效、高靈敏度液相色譜技術，HPLC不斷克服技術瓶頸，逐步成為一種廣泛應用于各個領域的分離分析工具。反相高效液相色譜是由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，它正好與由極性固定相和弱極性流動相所組成的液相色譜體系（正相色譜）相反。RP-HPLC的典型的固定相是十八烷基鍵合硅膠，典型的流動相是甲醇和乙腈。RP-HPLC是當今液相色譜的最主要的分離模式，幾乎可用于所有能溶于極性或弱極性溶劑中的有機物的分離。反相色譜法適于分離非極性、極性或離子型化合物，大部分的分析任務皆由反相色譜法完成。反相高效液相色譜是由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，它正好與由極性固定相和弱極性流動相所組成的液相色譜體系（正相色譜）相反。RP-HPLC的典型的固定相是十八烷基鍵合硅膠，典型的流動相是甲醇和乙腈。RP-HPLC