精液冷凍技術

關于精液冷凍技術精液冷凍的歷史（一）探索

1776年，Spallanzani發(fā)現(xiàn)精液在自然冰雪中冷凍后復溫部分精子恢復活力

1938年，Jahnelv發(fā)現(xiàn)精液儲存于-79℃

的玻璃管40天后復溫部分恢復活力

1940年，Shettles置精液于毛細玻璃管內-196℃

儲存，存活率不超過10%突破

1949年，Polge等發(fā)現(xiàn)用甘油作為冷凍精子的保護劑第2頁,共23頁，2024年2月25日，星期天精液冷凍的歷史（二）奠基

1954年后的十年中，Sherman發(fā)明了使用10%甘油作保護劑，用-196℃

液氮蒸氣作制冷劑的方法，獲得76%的冷凍生存率，得到普遍認可發(fā)展在Sherman發(fā)明的方法基礎上，從冷凍方法、保護劑種類等方面的研究發(fā)展迅速穩(wěn)定經(jīng)過多年的發(fā)展，精子冷凍技術相對穩(wěn)定，探索不止

第3頁,共23頁，2024年2月25日，星期天精液冷凍的原理（一）一、冷凍精液長期儲存的原理一定的低溫條件下細胞內的分子運動速度減慢甚至停止細胞代謝降低，處于休眠狀態(tài)一般認為-196℃

的液氮是安全的

第4頁,共23頁，2024年2月25日，星期天精液冷凍的原理（二）二、冷凍對精子的損傷機理

1、溶質損傷效應：（慢速冷凍損傷）

溫度降低至冰點細胞外液中的水分先形成冰晶細胞外液電解質濃度增加，滲透壓增高水分從細胞內流向細胞外，細胞發(fā)生收縮胞外冰晶的不斷形成使高滲狀態(tài)和細胞收縮持續(xù)進行過度暴露在高濃度溶質環(huán)境或過度收縮，引起損傷第5頁,共23頁，2024年2月25日，星期天精液冷凍的原理（三）2、冰晶的機械損傷效應：（快速冷凍損傷）溫度降低達到細胞內冰點未能轉移至胞外的水分形成冰晶破壞胞內的超微結構，引起死亡Wolley等人的研究顯示，超微結構的變化是發(fā)生在融化期間或融化之后第6頁,共23頁，2024年2月25日，星期天精液冷凍的原理（四）三、精液冷凍的基本原理冷凍損傷是肯定的在兩種損傷之間尋找平衡點，即最佳的降溫速率使兩種損傷的總和達到最小，得到最大的冷凍生存率實現(xiàn)起來非常困難冷凍保護劑的出現(xiàn)是一大突破第7頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍保護劑的作用機理（一）一、冷凍保護劑的分類1.根據(jù)化學結構分類：醇類、酰胺類、高分子多糖類、單糖類、蛋白質類、無機鹽類等2.根據(jù)作用機理分類：（1）滲透性冷凍保護劑：丙三醇、DMSO、乙二醇等（2）非滲透性冷凍保護劑：右旋糖酐、羥乙基淀粉、卵黃等第8頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍保護劑的作用機理（二）二、滲透性冷凍保護劑的作用機理1、滲入細胞內，降低細胞內外滲透壓的差距。當細胞外凍結時，減輕細胞皺縮的程度和速度2、細胞外保護劑的存在，可以降低細胞外液中溶質的濃度，減少高濃度溶質對細胞的損壞3、能與細胞內水分及電解質結合的特性，導致水合結構蛋白的穩(wěn)定，發(fā)揮抗凍作用4、僅對慢速冷凍有保護作用第9頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍保護劑的作用機理（三）三、非滲透性冷凍保護劑的作用機理此類物質不能進入細胞，冷凍時促進細胞內水分外溢，細胞發(fā)生皺縮，從而減少了細胞內的冰晶形成

對快速冷凍和慢速冷凍都有保護作用

卵黃的作用：卵磷脂能穩(wěn)定精子的細胞膜，阻止頂體膜破裂，抵抗“溫度休克”第10頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍保護劑的作用機理（四）四、冷凍保護劑的聯(lián)合作用1.冷凍保護劑劑量增加，其低溫保護作用增強2、冷凍保護劑的毒性作用3、兩種毒性機理不同的冷凍保護劑合用，可以達到相同的效果，而減少毒性作用4.滲透性冷凍保護劑與非滲透性冷凍保護劑聯(lián)合使用第11頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍的程序和方法（一）一、冷凍過程中精子通過的溫度階段溫度休克階段室溫~+5℃

冰晶的潛熱階段+5℃~-5℃

冰晶的形成階段-5℃~-15℃

再結晶階段-15℃~-80℃

儲存階段-80℃~-196℃

第12頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍的程序和方法（二）1、溫度休克階段溫度休克：指細胞不是由于直接的冷卻作用，而是由于溫度急劇變化而造成的損害。許多種屬的細胞比較明顯，如牛精子在2℃/分的降溫速率下，就可能死亡人類精子對溫度休克有相當?shù)牡挚沽Γ?℃/分的降溫速率比較合適2、冰晶的潛熱階段在通過+5℃~-5℃

的溫度階段時，由于冰晶形成放出熱量，溫度突升高。為了減少潛熱釋放、溫度升高對精子的損傷，應快速通過。第13頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍的程序和方法（三）3、冰晶形成階段精液作為一個整體從液相轉變成固體相，伴隨冰晶形成及由此產生的急驟溫度變化。在添加冷凍保護劑后，以5-7℃/分的速率通過，能獲得理想的生存率4、再結晶階段溫度低于-30℃

時，由于冰晶的生長和相互結合，產生溫度波動，再結晶改變了細胞內的電解質平衡，造成了進一步損傷，這種現(xiàn)象稱為遷移性再結冰。一般認為，這種現(xiàn)象一直維持至-80℃?？焖偻ㄟ^能避免這種損傷。第14頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍的程序和方法（四）5.儲存階段雖然低于-80℃細胞內已無結冰現(xiàn)象，但經(jīng)研究證實，即使在-100℃下儲存，精子生存率仍會逐步的下降，因為某些酶類還具備一定的活性，使細胞進行簡單、緩慢的代謝。一般認為，在-196℃液氮中保存是安全的。第15頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍的程序和方法（五）二、冷凍的程序和方法根據(jù)精子冷凍時需要通過的溫度階段，冷凍程序設計的原理基本相同，但在實現(xiàn)的方法上卻有很多種，主要有以下幾種：1、二步法將精液置于液氮水平面上一個固定距離一定時間，然后浸入液氮中儲存。第16頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍的程序和方法（六）2、三步法將精液分別置于液氮水平面上兩個不同的距離一定時間，然后浸入液氮中儲存。3、多步法利用程序降溫儀來實現(xiàn)4、其它方法顆粒法、一步法、冰箱預冷等第17頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍的程序和方法（七）三、精液的凍貯方式顆粒法：設備簡單，易污染，難標記安瓿法：易標記，封口后不易污染，火焰熔封較繁瑣，易爆炸或破裂麥管法：易標記，降溫均勻，可直接授精，封口較繁瑣，儲存管理不便塑料凍存管法：易標記，易封口，易儲存管理，復溫偶有爆炸注射器法：可直接授精，儲存管理不便，不宜大量凍貯第18頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍保護劑的種類與配制（一）一、冷凍保護劑的種類1、單純甘油型2、甘油復合型甘油-卵黃-枸櫞酸鈉型（G-Y-C型）甘油-Tyrode液型TEST-Tris-甘油-卵黃-枸櫞酸鈉型甘油-蔗糖-HEPES-HTF型3、無甘油復合型第19頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍保護劑的種類與配制（二）二、甘油-卵黃-枸櫞酸鈉型冷凍保護劑的配制冷凍保護劑配方(總量=20ml)CPM：SEMEN甘油(ml)卵黃(ml)枸椽酸鈉(mg)葡萄糖(mg)純水(ml)

1：1

2.8

4.0

377

169

13.2

1：2

4.2

6.0

565

250

9.8

1：3

5.6

8.0

754

338

6.4第20頁,共23頁，2024年2月25日，星期天影響精液冷凍質量的因素關鍵因素：冷凍程序、冷凍保護劑其他因素：禁欲時間：３-５天精液取出至冷凍時間：１小時之內冷凍保護劑的添加方式：室溫，緩慢添加復溫方式與時間：３７℃水浴１０分鐘精液分析的標準化第21頁,共23頁，2024年2月25日，星期天精液冷凍技術的新進展

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