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關(guān)于細(xì)胞重組與細(xì)胞融合細(xì)胞重組與細(xì)胞融合細(xì)胞重組:從活細(xì)胞中分離出細(xì)胞器及其組份,在體外進(jìn)行重新裝配成為具有生物活性的細(xì)胞的一種技術(shù)。細(xì)胞融合:人工方法使2個或2個以上的細(xì)胞合并形成1個細(xì)胞的技術(shù)。第2頁,共50頁,2024年2月25日,星期天核體與胞質(zhì)體核體:與細(xì)胞質(zhì)分離后得到的帶有少量細(xì)胞質(zhì)并包有質(zhì)膜的細(xì)胞核,也成為小型細(xì)胞。核體能夠重生其胞質(zhì)部分,繼續(xù)生長分裂。胞質(zhì)體:除去細(xì)胞核后由質(zhì)膜包裹的無核細(xì)胞。細(xì)胞松弛素B處理細(xì)胞能誘發(fā)細(xì)胞排核反應(yīng),此時通過離心的方法可以將核體與胞質(zhì)體分離。第3頁,共50頁,2024年2月25日,星期天微細(xì)胞微細(xì)胞:又稱微核體,含有一條或幾條染色體,外有一薄層細(xì)胞質(zhì)和一個完整質(zhì)膜的核質(zhì)體。秋水仙素和長春新堿等有絲分離阻斷劑能干擾微管的合成與裝配,導(dǎo)致細(xì)胞分裂后期染色體產(chǎn)生發(fā)散運動,發(fā)散開的染色體各自裝配出自己的核膜,形成微細(xì)胞。秋水仙胺細(xì)胞松弛素B細(xì)胞松弛素B離心第4頁,共50頁,2024年2月25日,星期天胞質(zhì)體與完整細(xì)胞的重組形成胞質(zhì)雜種;微細(xì)胞與完整細(xì)胞的重組形成微細(xì)胞核異體;胞質(zhì)體與核體重新組合形成重組細(xì)胞。細(xì)胞重組的方式第5頁,共50頁,2024年2月25日,星期天細(xì)胞重組技術(shù)將細(xì)胞融合技術(shù)與細(xì)胞核質(zhì)分離技術(shù)相結(jié)合,為重新構(gòu)建不同類型的雜種細(xì)胞提供可能;細(xì)胞重組技術(shù)可以人為的將染色體或者基因進(jìn)行轉(zhuǎn)移,使重組細(xì)胞產(chǎn)生新的性狀和新的特性。細(xì)胞重組的意義第6頁,共50頁,2024年2月25日,星期天細(xì)胞質(zhì)工程細(xì)胞質(zhì)工程:是研究真核細(xì)胞的核-質(zhì)關(guān)系以及細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)。細(xì)胞質(zhì)工程是進(jìn)行細(xì)胞重組的重要基礎(chǔ)。細(xì)胞質(zhì)工程涉及的技術(shù)有:1、細(xì)胞破碎2、細(xì)胞器及細(xì)胞組分分離3、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移4、胞質(zhì)雜種第7頁,共50頁,2024年2月25日,星期天一、細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁,使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來的技術(shù)。細(xì)胞破碎方法包含:1、超聲波破碎法2、反復(fù)凍融法3、高速組織搗碎法4、化學(xué)裂解法5、生物酶解法第8頁,共50頁,2024年2月25日,星期天超聲波破碎法利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液,由發(fā)生器和換能器組成。反復(fù)凍融法將細(xì)胞放在低溫下冷凍,然后在室溫中融化,反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。第9頁,共50頁,2024年2月25日,星期天高速組織搗碎法借助高速組織搗碎機(jī)使細(xì)胞被高速旋轉(zhuǎn)的葉片打碎。化學(xué)裂解法通過化學(xué)藥品改變細(xì)胞膜的通透性,使其裂解。生物酶解法利用溶解細(xì)胞壁的酶處理細(xì)胞,破壞細(xì)胞壁,使細(xì)胞內(nèi)含組分釋放。第10頁,共50頁,2024年2月25日,星期天二、細(xì)胞器及細(xì)胞組分分離細(xì)胞內(nèi)不同組份的密度和大小都不相同,在同一離心場內(nèi)的沉降速度也不同,因此,常用不同轉(zhuǎn)速的離心法將細(xì)胞內(nèi)各種組份分級分離出來。細(xì)胞器及細(xì)胞組份分離過程包括組織細(xì)胞勻漿、分級分離和分析三步。細(xì)胞勻漿要在低溫條件、等滲緩沖液(等滲勻漿介質(zhì),如0.25mol/L的蔗糖)中進(jìn)行。細(xì)胞器及細(xì)胞組份分離方法包含:1、差速離心法2、密度梯度分離法第11頁,共50頁,2024年2月25日,星期天第12頁,共50頁,2024年2月25日,星期天沉降系數(shù):顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。沉降系數(shù)是以時間表示的。蛋白質(zhì),核酸等生物大分子的S實際上時常在10的-13次方秒左右,故把沉降系數(shù)10的-13次方秒稱為一個Svedberg單位,簡寫S,即10的-13方秒=1S。大多數(shù)蛋白質(zhì)和核酸的沉降系數(shù)在4S和40S之間,核糖體及其亞基在30S和80S之間,多核糖體在100S以上。第13頁,共50頁,2024年2月25日,星期天離心方式離心運動是指物體有遠(yuǎn)離中心運動的現(xiàn)象。根據(jù)離心機(jī)的類型分為水平離心、角離心(偏水平)和垂直離心三種。根據(jù)離心方式分為差速離心和密度梯度離心兩種。第14頁,共50頁,2024年2月25日,星期天差速離心:在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心,用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。速度逐漸提高,樣品按大小先后沉降第15頁,共50頁,2024年2月25日,星期天在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為:細(xì)胞核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。由于各種細(xì)胞器在大小和密度上相互重疊,而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中,一般重復(fù)2~3次效果會好一些。差速離心只用于分離密度和大小懸殊的細(xì)胞,更多用于分離細(xì)胞器。對于精細(xì)的分離,則是密度梯度離心效果更好。第16頁,共50頁,2024年2月25日,星期天密度梯度離心:用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度,將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部,通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。第17頁,共50頁,2024年2月25日,星期天密度梯度離心又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種1、速度沉降主要用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。這種沉降方法所采用的介質(zhì)密度較低,介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。生物顆粒(細(xì)胞或細(xì)胞器)在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。2、等密度沉降適用于分離密度不等的顆粒。細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和足夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處,并停留在那里達(dá)到平衡,從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度,而且介質(zhì)的梯度要求較高的陡度,不能太平緩。這種方法適于分離細(xì)胞器,而不太適于分離和純化細(xì)胞。第18頁,共50頁,2024年2月25日,星期天速度沉降等密度沉降第19頁,共50頁,2024年2月25日,星期天三、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移細(xì)胞器轉(zhuǎn)移是將一個物種的細(xì)胞器轉(zhuǎn)移到另一個物種細(xì)胞中的技術(shù)。細(xì)胞器轉(zhuǎn)移類似細(xì)胞核移植技術(shù)。不同的是操作對象為細(xì)胞器,不是細(xì)胞核。最常見的是線粒體和葉綠體的細(xì)胞器轉(zhuǎn)移。細(xì)胞器轉(zhuǎn)移方法有微注射、載體轉(zhuǎn)移、胞吞胞飲等方式。第20頁,共50頁,2024年2月25日,星期天四、胞質(zhì)雜種概念一:將兩種不同來源的核外遺傳物質(zhì)(線粒體和葉綠體)與一個特定的細(xì)胞核組合在一起得到的細(xì)胞稱為胞質(zhì)雜種。概念二:來自兩個原生質(zhì)體融合產(chǎn)生的細(xì)胞,其中一個細(xì)胞的細(xì)胞核消失后,兩個親代原生質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)雜交得到的個體成為胞質(zhì)雜種。核心概念是細(xì)胞質(zhì)的雜交,不是細(xì)胞核,其中細(xì)胞質(zhì)中存在不同來源的細(xì)胞器,尤其是線粒體和葉綠體。第21頁,共50頁,2024年2月25日,星期天細(xì)胞融合細(xì)胞融合(Cellfusion):又稱體細(xì)胞雜交,是指使用人工方法使兩個或兩個以上的體細(xì)胞合并形成一個細(xì)胞,使之分化再生,形成新物種或新品種的技術(shù)。細(xì)胞融合方法包含人工方法和無性方法1、人工方法:是指在外力使用誘導(dǎo)劑或促融劑、電場、磁場、超聲波、重力、激光等因素的作用。2、無性方式:是區(qū)別于有性方式而言的,有自然條件下,生殖細(xì)胞卵子和精子相互接觸會發(fā)生細(xì)胞融合的現(xiàn)象。第22頁,共50頁,2024年2月25日,星期天1838-1875年:在血液組織中發(fā)現(xiàn)有多核細(xì)胞;20世紀(jì)50年代:日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)仙臺病毒可以引起細(xì)胞的融合;1965年:英國的科學(xué)家海利斯成功得到了融合細(xì)胞;1964年:HAT(次黃嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidin))選擇培養(yǎng)基應(yīng)用于融合細(xì)胞的選擇;1974年:加拿大華裔科學(xué)家高國楠發(fā)現(xiàn)聚乙二醇(PEG)能夠促使植物的原生質(zhì)體融合;1982年:出現(xiàn)了電融合技術(shù);近20年:從細(xì)胞融合的理論和實踐兩個方面進(jìn)行了大量研究,細(xì)胞融合的方法不斷更新和完善,融合率逐步提高。細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展史第23頁,共50頁,2024年2月25日,星期天生物種類細(xì)胞來源成功年代煙草兩個種間苷藍(lán)——青菜大豆——馬唐草矮牽?!埫婊ù篼湣ㄉ篼湣蠖剐←湣珷颗S筒恕蠖褂衩住蠖勾蠖埂巴愣勾篼湣Q豆大豆——草香木犀酵母菌——雞大豆——煙草大豆——秋水仙人——胡蘿卜番茄——馬鈴薯人——小鼠葉——葉葉——根愈傷組織——葉葉——花瓣種子——種子葉——懸浮細(xì)胞葉——花瓣葉——懸浮細(xì)胞葉——懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞——懸浮細(xì)胞葉——根懸浮細(xì)胞——葉原生質(zhì)體——血紅細(xì)胞懸浮細(xì)胞——葉懸浮細(xì)胞——葉腹水癌細(xì)胞——原生質(zhì)體葉——根尖纖維肉瘤細(xì)胞——畸胎瘤細(xì)胞197219721972197319741974197419741974197419751976197619761976197619781978幾種細(xì)胞融合成功的例子第24頁,共50頁,2024年2月25日,星期天細(xì)胞融合的類型異核體:來自兩個不同基因型的細(xì)胞融合成的融合細(xì)胞。同核體:基因型相同的細(xì)胞融合成的融合細(xì)胞。細(xì)胞融合包括對稱融合和不對稱融合。1、對稱融合:兩個完整的細(xì)胞間的融合。2、不對稱融合:其中一個細(xì)胞通過物理、化學(xué)或者生物的方法使該細(xì)胞的細(xì)胞核或者細(xì)胞質(zhì)失活后再與另一個完整的細(xì)胞進(jìn)行的融合。第25頁,共50頁,2024年2月25日,星期天細(xì)胞融合的過程1、兩原生質(zhì)體或者細(xì)胞彼此靠近;2、質(zhì)膜融合形成細(xì)胞橋;3、胞質(zhì)滲透;4、細(xì)胞核融合。第26頁,共50頁,2024年2月25日,星期天細(xì)胞橋的形成過程第27頁,共50頁,2024年2月25日,星期天植物細(xì)胞融合過程人造小鼠培育過程示意圖第28頁,共50頁,2024年2月25日,星期天細(xì)胞融合的意義改造細(xì)胞遺傳物質(zhì)生產(chǎn)抗腫瘤疫苗生產(chǎn)單克隆抗體用于基因定位用于動物育種有利于基礎(chǔ)理論研究第29頁,共50頁,2024年2月25日,星期天細(xì)胞融合基本原理1、細(xì)胞膜表面親水性結(jié)構(gòu)—糖蛋白細(xì)胞融合的關(guān)鍵是要脂雙層的接觸,就是要去除糖蛋白,露出無糖蛋白覆蓋的區(qū)域,使兩個細(xì)胞的脂雙層能緊密結(jié)合。第30頁,共50頁,2024年2月25日,星期天2、病毒促進(jìn)細(xì)胞融合很多病毒都具有凝集細(xì)胞的能力,其原理大致如下:病毒的一邊黏接在一個細(xì)胞表面,病毒的另一邊黏接在另一個細(xì)胞表面,從而使兩個細(xì)胞在病毒的作用下靠近發(fā)生凝結(jié)。仙臺病毒促進(jìn)細(xì)胞融合的有效部位在于它的膜,病毒被膜上的兩種糖蛋白(HA、NA和F蛋白)可和細(xì)胞膜表面的糖蛋白發(fā)生作用,相互結(jié)合,在電鏡下觀察到在相接觸的相鄰細(xì)胞表面之間產(chǎn)生一些微小的細(xì)胞質(zhì)橋。第31頁,共50頁,2024年2月25日,星期天3、化學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞融合(聚乙二醇PEG)PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的兩種方式:PEG含有醚鍵、帶負(fù)電性可與細(xì)胞表面正的極性集團(tuán)相連,引起細(xì)胞膜表面的蛋白起作用,使細(xì)胞相互凝集,膜蛋白質(zhì)分子重排,脂類分子重排,打開質(zhì)膜,細(xì)胞融合。PEG和水之間的氫鍵相結(jié)合,使溶液中的自由水消失,導(dǎo)致細(xì)胞脫水而發(fā)生膜結(jié)構(gòu)的變化,使細(xì)胞相互凝集,膜蛋白質(zhì)分子重排,脂類分子重排,打開質(zhì)膜,細(xì)胞融合。第32頁,共50頁,2024年2月25日,星期天4、電場誘導(dǎo)細(xì)胞融合低壓交流電場中,細(xì)胞聚集成串珠狀緊密排列,相互接觸的細(xì)胞膜之間會出現(xiàn)無蛋白顆粒的脂質(zhì)區(qū),當(dāng)受到電擊時,這個區(qū)域就會被擊穿,產(chǎn)生脂雙層膜孔,導(dǎo)致細(xì)胞之間的細(xì)胞質(zhì)連通,發(fā)生細(xì)胞融合。細(xì)胞置于非常高的電場中,細(xì)胞膜就變得具有通透性,能讓外界的分子擴(kuò)散進(jìn)細(xì)胞內(nèi),這一現(xiàn)象稱為電穿孔。第33頁,共50頁,2024年2月25日,星期天動物細(xì)胞融合1、細(xì)胞種類和性質(zhì)細(xì)胞表面性質(zhì)細(xì)胞種類2、環(huán)境條件的影響溫度:
pH:最適為7.4-7.8
氧氣含量:耗氧量較大,一般大于20%3、離子強(qiáng)度及離子種類細(xì)胞融合時需要Ca2+,最適為0.1mol/L細(xì)胞融合的影響因素第34頁,共50頁,2024年2月25日,星期天植物或微生物細(xì)胞融合1、PEG誘導(dǎo)融合的時間2、PEG純度3、融合密度一般為2x104-8x104個/ml4、融合液中加入少量的CaCI25、其他添加組份第35頁,共50頁,2024年2月25日,星期天互補作用:親本細(xì)胞的性狀同時在雜種細(xì)胞中表現(xiàn)。激活作用:親本細(xì)胞的不活動基因在雜種細(xì)胞表達(dá)。如只能合成RNA而不能合成DNA的小鼠巨噬細(xì)胞,與Hela細(xì)胞融合,融合后的細(xì)胞則可以合成兩種核酸。消失作用:親本細(xì)胞的性狀在雜種細(xì)胞中消失。如金黃倉鼠的黑色素瘤細(xì)胞可產(chǎn)生黑色素,小鼠的成纖維細(xì)胞不能產(chǎn)生黑色素,它們的雜種細(xì)胞不能產(chǎn)生黑色素。同時具有激活和消失作用如小鼠的胸腺細(xì)胞具有t12抗原基因和h2抗原基因,在胚胎發(fā)育早期t12基因表達(dá),h2基因不表達(dá),在成年小鼠中h2基因表達(dá),t12基因不表達(dá),而在成年小鼠的胸腺細(xì)胞與小鼠胚胎性瘤細(xì)胞融合的雜種細(xì)胞中,h2基因不表達(dá),卻激活了t12基因,使其表達(dá)。融合細(xì)胞特性的表現(xiàn)形式第36頁,共50頁,2024年2月25日,星期天融合細(xì)胞篩選有兩大類:一類是根據(jù)遺傳和生理生化特性的互補選擇法;一類是根據(jù)可見標(biāo)記形狀的機(jī)械選擇法。抗藥性篩選系統(tǒng)如親本A對氨芐青霉素敏感,對卡那霉素不敏感,親本B對氨芐青霉素不敏感,對卡那霉素敏感,融合后的細(xì)胞對兩種抗生素都不敏感。營養(yǎng)互補篩選系統(tǒng)親本A為色氨酸缺陷型,親本B為蘇氨酸缺陷型,融合細(xì)胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)平板上生長。溫度敏感突變型融合細(xì)胞篩選親本A具有卡那霉素抗性但只能在37度生長,親本B為高溫敏感突變型,不具備卡那霉素抗性,融合細(xì)胞能在高溫和卡那霉素抗性平板生長。融合細(xì)胞的篩選第37頁,共50頁,2024年2月25日,星期天物理特性篩選利用細(xì)胞在形態(tài)、大小、顏色上的差別可以在顯微鏡下用微管將融合細(xì)胞吸取挑選出來,也可以用離心的方式。熒光表記法
利用發(fā)綠色熒光的異硫氰酸熒光素和發(fā)紅色熒光的堿性芯香紅熒光素分別標(biāo)記兩個親本細(xì)胞,融合后的細(xì)胞內(nèi)存在兩種熒光標(biāo)記物,利用流式細(xì)胞儀可進(jìn)行分選。第38頁,共50頁,2024年2月25日,星期天細(xì)胞融合的材料---原生質(zhì)體原生質(zhì)體(protoplast):去除細(xì)胞壁后裸露的球型細(xì)胞。原生質(zhì)體主要是植物細(xì)胞,植物細(xì)胞壁主要成份為纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)和少量蛋白質(zhì)。原生質(zhì)體雖然沒有細(xì)胞壁,但仍能進(jìn)行基本的生命活動,在離體培養(yǎng)下可再生細(xì)胞壁。第39頁,共50頁,2024年2月25日,星期天植物原生質(zhì)體的特點:1、吸收能力增強(qiáng):易于攝取外來遺傳物質(zhì)、細(xì)胞器、細(xì)菌、病毒等;易于吸收氧、養(yǎng)分;2、具有全能性:具有全套的遺傳物質(zhì),具有細(xì)胞壁再生并能進(jìn)行人工培養(yǎng)分化發(fā)育成完整植株的能力;3、在一定條件下可誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合,形成雜種細(xì)胞。4、分泌能力提高:去除了細(xì)胞壁的擴(kuò)散障礙,使細(xì)胞膜的透過性增強(qiáng),利于胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌。5、穩(wěn)定性較差:失去了細(xì)胞壁的保護(hù)作用,穩(wěn)定性較差,易于受到滲透壓等條件變化的影響。第40頁,共50頁,2024年2月25日,星期天原生質(zhì)體用途信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換細(xì)胞壁合成機(jī)理膜的結(jié)構(gòu)與功能核質(zhì)關(guān)系雜交或自交不親和的機(jī)理細(xì)胞間的相互作用植物激素的作用機(jī)理融合產(chǎn)生體細(xì)胞雜種分離各種細(xì)胞器引入各種細(xì)胞器導(dǎo)入外源基因誘發(fā)突變體第41頁,共50頁,2024年2月25日,星期天原生質(zhì)體的制備*植物葉片取材容易比較容易用酶解法分離*植物根尖組織可由各種植物的種子萌發(fā)后取得*植物花粉產(chǎn)生單倍體原生質(zhì)體*愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)胞壁容易解離材料來源第42頁,共50頁,2024年2月25日,星期天原生質(zhì)體制備的前提是去除細(xì)胞壁,通常使用機(jī)械法和生物酶法。機(jī)械法:細(xì)胞放入高滲糖溶液中,質(zhì)壁分離,剪碎組織,在這個過程中,有些質(zhì)壁分離的細(xì)胞只被切去了細(xì)胞壁,從而釋放出完整的原生質(zhì)體。產(chǎn)量低;方法繁瑣費力;局限性大。分生組織和其他液泡化程度不高的細(xì)胞中分離原生質(zhì)體時不能用此法。第43頁,共50頁,2024年2月25日,星期天生物酶法:利用酶處理細(xì)胞壁,從而釋放出原生質(zhì)體。條件溫和、原生質(zhì)體完整性好、活力高、收率高。纖維素酶類(Cellulase):從綠色木霉中提取。果膠酶
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