分生大實(shí)驗(yàn)須知(1)課件

分子生物學(xué)綜合大實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心課程安排時(shí)間安排實(shí)驗(yàn)題目實(shí)驗(yàn)室條件實(shí)驗(yàn)室要求報(bào)告上交時(shí)間綠色熒光蛋白（EGFP）的基因克隆

EGFP

Enhanced

Green

Fluorescent

Protein

課程安排1．學(xué)生分組（4~5人/小組），選定組長(zhǎng)，分配好實(shí)驗(yàn)室。GFP實(shí)驗(yàn)安排在第1、2、5、6、7、8實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。2．開題，學(xué)生仔細(xì)查詢研讀資料，自主設(shè)計(jì)方案，無(wú)需提交報(bào)告。3．老師講解注意事項(xiàng)等之后，學(xué)生按分組自主進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4.實(shí)驗(yàn)分四部分：質(zhì)粒提取——PCR——連接、轉(zhuǎn)化——挑菌、提質(zhì)粒、酶切鑒定5．全部實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，完成報(bào)告。6．用學(xué)術(shù)論文的格式來(lái)完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告提交（參考學(xué)術(shù)雜志）。7．實(shí)驗(yàn)報(bào)告提交地址：50/rar/實(shí)驗(yàn)題目：綠色熒光蛋白（EGFP）的基因克隆技術(shù)路線：

1.獲取EGFP的基因2.克隆EGFP基因（注意：使用T克隆法，不要求表達(dá))重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為分分離目的基因切限制酶切割目的基因與載體接連接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩篩選重組體、轉(zhuǎn)化子重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交

以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程切連轉(zhuǎn)篩PCRT連轉(zhuǎn)篩轉(zhuǎn)表達(dá)切連轉(zhuǎn)篩轉(zhuǎn)表達(dá)PCR鑒定實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程:實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路分---PCR分離目的基因切接---目的基因與載體相連轉(zhuǎn)---轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞篩---篩選陽(yáng)性重組體實(shí)驗(yàn)室提供條件-材料質(zhì)粒：pEGFP-N1T載體：pUCm-T菌種：DH5(克隆菌)PCR引物：F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA

R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCTm=56實(shí)驗(yàn)室提供條件-試劑藍(lán)白T載體（天恩澤）快速DNA連接試劑盒（碧云天）限制性內(nèi)切酶：EcoRI（Fermentas）質(zhì)粒提取試劑盒（百泰克或BioEASY）抗生素：氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)X-gal、IPTG等實(shí)驗(yàn)室提供條件-儀器超凈工作臺(tái)，恒溫?fù)u床，高壓滅菌鍋，恒溫培養(yǎng)箱臺(tái)式高速離心機(jī)，大容量冷凍離心機(jī)PCR儀，紫外分光光度計(jì)水平電泳槽，垂直電泳槽，電泳儀凝膠成像系統(tǒng)，制冰機(jī)、超低溫冰箱等實(shí)驗(yàn)室要求進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室前要經(jīng)過培訓(xùn)。進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室需簽名及出入時(shí)間，當(dāng)日實(shí)驗(yàn)結(jié)束須將物品歸位并清潔。遵守實(shí)驗(yàn)室開放時(shí)間，防止無(wú)故拖延時(shí)間，影響進(jìn)度。節(jié)省實(shí)驗(yàn)室一切資源。試劑盒須分裝使用（如T載體、內(nèi)切酶），避免多次凍融失效。共用試劑材料須統(tǒng)一配制準(zhǔn)備（如感受態(tài)細(xì)胞，平板培養(yǎng)基板、電泳緩沖液儲(chǔ)液等）節(jié)省試劑耗材（如將內(nèi)切酶做成混合液，避免多次吸取造成浪費(fèi)）。實(shí)驗(yàn)儀器盡量集中使用或者共用，以減少儀器設(shè)備損耗（如高壓滅菌鍋、制冰機(jī)、恒溫?fù)u床等）。報(bào)告上交時(shí)間實(shí)驗(yàn)報(bào)告提交時(shí)間：2014-7-5交電子版（每位同學(xué)一份）。電子版文件名：學(xué)號(hào)后3位-學(xué)生姓名-實(shí)驗(yàn)名稱-年級(jí)專業(yè)-實(shí)驗(yàn)室電子版文件上傳地址：

插入740bpDNA片段重組質(zhì)粒大小為:3038bp+74