微生物的選擇培養(yǎng)與計(jì)數(shù)課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修32

微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)選擇培養(yǎng)基微生物的選擇培養(yǎng)

0102微生物的數(shù)量測(cè)定探究·實(shí)驗(yàn)0304目錄CONTENTS選擇培養(yǎng)基1973年，科學(xué)家從美國(guó)黃石國(guó)家公園的熱泉中篩選出水生棲熱菌(Thermusaquaticus)，進(jìn)而從這種菌中提取出耐高溫的DNA聚合酶。這種酶目前已被廣泛用于體外擴(kuò)增DNA片段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選，也可以應(yīng)用同樣的原理，即人為提供有利于目的菌生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度和pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物的生長(zhǎng)。1.為什么水生棲熱菌能從熱泉中被篩選出來(lái)呢？這是因?yàn)樗鷹珶峋茉?0~80℃的高溫條件下生存，而絕大多數(shù)微生物在此條件下不能生存。2.如何從眾多的微生物中篩選出單一菌種？實(shí)驗(yàn)室篩選微生物原理：人為提供_______________的條件（包括_____、_____和_____等），同時(shí)_______________________選擇培養(yǎng)基根據(jù)微生物對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。有利于目的菌生長(zhǎng)抑制或阻止其他微生物的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)溫度pH耐熱微生物耐寒微生物石油分解菌選擇培養(yǎng)基允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。1.概念：2.方法：分離得到酵母菌、霉菌等分離固氮菌分離自養(yǎng)型微生物不加含碳有機(jī)物的培養(yǎng)基不加氮源的培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基（1）在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)。分離得到金黃色葡萄球菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基（2）改變培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分。（3）改變微生物的培養(yǎng)條件。耐高溫微生物高溫環(huán)境下培養(yǎng)厭氧型微生物兼性厭氧型無(wú)氧環(huán)境下培養(yǎng)怎樣選擇出抗氨芐青霉素能力的細(xì)菌?培養(yǎng)基中加氨芐青霉素具有氨芐青霉素抗性的菌落沒(méi)有氨芐青霉素抗性的細(xì)菌培養(yǎng)基應(yīng)有菌落沒(méi)有氨芐青霉素抗性的細(xì)菌被淘汰思考·討論--培養(yǎng)基配方的設(shè)計(jì)

尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種重要的氮肥。尿素施入土壤后，會(huì)被土壤中的某些細(xì)菌分解成NH3，再被轉(zhuǎn)化為NO3-、NH4+等被植物吸收。而這些細(xì)菌之所以能分解尿素，是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕?，脲酶催化尿素分解產(chǎn)生NH3，NH3可以作為細(xì)菌生長(zhǎng)的氮源。(細(xì)菌生長(zhǎng)的氮源)尿素NH3脲酶尿素分解菌思考·討論--培養(yǎng)基配方的設(shè)計(jì)1.如果讓你配制一種培養(yǎng)基，讓土壤稀釋液中能分解尿素的細(xì)菌分離出來(lái)，培養(yǎng)基的配方該如何設(shè)計(jì)？培養(yǎng)基的配方中應(yīng)含有微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)要素——碳源、氮源、水、無(wú)機(jī)鹽等。由于絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，分解尿素的細(xì)菌也能利用葡萄糖，可以用葡萄糖作為碳源，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，在培養(yǎng)基中加入尿素提供氮源，使培養(yǎng)基具有了選擇作用。該培養(yǎng)基以尿素作為唯一氮源，只允許能以尿素作為氮源的微生物生長(zhǎng)。思考·討論--培養(yǎng)基配方的設(shè)計(jì)2.該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點(diǎn)和不同點(diǎn)？該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基相比較，共同點(diǎn)是都認(rèn)有機(jī)碳（如葡萄糖）作為碳源，都有水和無(wú)機(jī)鹽；不同點(diǎn)是該培養(yǎng)基以尿素作為唯一氮源，使只有能以尿素作為氮源的微生物生長(zhǎng)。微生物的選擇培養(yǎng)分解尿素細(xì)菌鑒定原理：CO(NH2)2+H2O2NH3+CO2

脲酶呈堿性，遇酚紅指示劑呈

色。紅

在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果pH升高，指示劑將變紅，說(shuō)明該細(xì)菌能夠分解尿素。鑒別培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品(不影響微生物正常生長(zhǎng))，使微生物的某種代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基中的特定指示劑或化學(xué)藥品發(fā)生反應(yīng)。從而達(dá)到鑒定的作用。細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解為氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH升高，因此可以通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基pH的變化來(lái)判斷是否發(fā)生了該化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而判斷該菌是否為尿素分解細(xì)菌。①鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中。90mL無(wú)菌水9mL無(wú)菌水稀釋10倍菌液②將10g土樣加入盛有90mL無(wú)菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL無(wú)菌水的試管中，依次等比稀釋。梯度稀釋微生物的選擇培養(yǎng)③取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布。⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻。瀝干移液槍涂布平板微生物的選擇培養(yǎng)微生物的計(jì)數(shù)方法比較內(nèi)容直接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法主要用具顯微鏡、細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板涂布器計(jì)數(shù)依據(jù)菌株本身培養(yǎng)基上菌落數(shù)優(yōu)點(diǎn)計(jì)數(shù)方便、操作簡(jiǎn)單計(jì)數(shù)的是活菌計(jì)算公式每毫升原液含菌株數(shù)＝每小格平均菌株數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)每克樣品中的菌株數(shù):(C÷V)×M

C:某稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù);V:涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(mL);M:稀釋倍數(shù)缺點(diǎn)不能區(qū)分死菌與活菌操作復(fù)雜，有一定誤差，比如當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)菌體連在一起時(shí),平板上觀察到的只是一個(gè)菌落結(jié)果比實(shí)際值偏大比實(shí)際值偏小土壤中分離尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)土壤中含有能分解尿素的細(xì)菌，我們?nèi)绾畏蛛x它們？每克土壤樣品究竟含有多少這樣的細(xì)菌？提出問(wèn)題作出假設(shè)實(shí)施實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果利用以尿素作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以分離。1.土壤取樣2.制備培養(yǎng)基（尿素為自變量）3.樣品稀釋與取樣涂布4.微生物的培養(yǎng)與觀察土壤中分離尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)①原理：絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌。1.培養(yǎng)基的制備②配方：制備選擇培養(yǎng)基（尿素為唯一氮源）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對(duì)照組，用以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基做實(shí)驗(yàn)組，用來(lái)判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用。①提供無(wú)機(jī)鹽；②調(diào)節(jié)pH。葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g瓊脂15.0g蒸餾水1000ml土壤中分離尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)土壤取樣①要求：富含有機(jī)質(zhì)、酸堿度接近______且潮濕的土壤②取樣土層：鏟去_________，在距地表3~8cm的土壤層制備培養(yǎng)基①實(shí)驗(yàn)組：以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基②對(duì)照組：樣品的稀釋牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(普通培養(yǎng)基）目的：作為對(duì)照組用以判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用涂布平板中性表層土①稀釋原因：樣品的稀釋程度直接影響平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)②稀釋標(biāo)準(zhǔn)：測(cè)定土壤中的細(xì)菌的數(shù)量，一般選用_______________________倍稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)1×104、1×105和1×106③初次實(shí)驗(yàn)，可以將稀釋的范圍放寬一點(diǎn)，例如可以將_________________倍稀釋液分別涂布培養(yǎng)，以保證___________________________________________。1×103~1×107能從中選擇出菌落數(shù)為30~300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)測(cè)細(xì)菌數(shù)：一般用104、105、106稀釋液測(cè)放線菌：一般用103、104、105稀釋液測(cè)真菌數(shù)：一般用102、103、104稀釋液土壤中分離尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)①細(xì)菌：一般用104、105、106稀釋液。②放線菌：一般用103、104、105稀釋液。③真菌：一般用102、103、104稀釋液。以保證獲得菌落數(shù)在30～300之間適于計(jì)數(shù)的平板。在初次實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于稀釋的范圍沒(méi)有把握，怎樣做才能保證從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)？

選擇一個(gè)比較寬的范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養(yǎng)，以保證能從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。涂布平板土壤中分離尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)菌落計(jì)數(shù)當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)在30~300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，同一稀釋度下至少計(jì)數(shù)3個(gè)平板，求出平均值，并根據(jù)所對(duì)應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。設(shè)計(jì)如下表格記錄并計(jì)數(shù)。稀釋度104105106123平均值123平均值123平均值每個(gè)平板的菌落數(shù)培養(yǎng)與觀察將平板____于______℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2天。每隔24小時(shí)統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目,選取________________時(shí)的記錄做結(jié)果倒置30~37菌落數(shù)目穩(wěn)定為什么？防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。結(jié)果分析與評(píng)價(jià)如果是用同一土樣進(jìn)行的操作，數(shù)據(jù)應(yīng)該比較接近。如果差異很大，就需要從操作是否規(guī)范、培養(yǎng)基配制是否合理等方面查找原因。如果沒(méi)有接種的培養(yǎng)基上沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基沒(méi)有被雜菌污染。如果接種后的完全培養(yǎng)基上的菌落數(shù)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，說(shuō)明選擇培養(yǎng)基篩選出了一些尿素分解菌。1.結(jié)合對(duì)照組，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。如果得到了兩個(gè)或多個(gè)菌落數(shù)為30-300的平板，說(shuō)明稀釋度合適，操作比較成功，能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。2.你是否獲得了某一稀釋度下菌落數(shù)為30～300的平板？在這一稀釋度下，是否至少有2個(gè)平板的菌落數(shù)接近？3.你統(tǒng)計(jì)的每克土樣中能分解尿素的細(xì)菌的菌落數(shù)是多少？與其他同學(xué)統(tǒng)計(jì)的結(jié)果接近嗎？如果差異很大，可能是什么原因引起的？課堂小結(jié)微生物的數(shù)量測(cè)定選擇培養(yǎng)基的作用微生物選擇培養(yǎng)獲取純培養(yǎng)物的方法-稀釋涂布平板法微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)選擇培養(yǎng)基微生物的選擇培養(yǎng)科學(xué)實(shí)例篩選原則選擇培養(yǎng)基的概念及舉例稀釋涂布平板法的操作過(guò)程間接計(jì)數(shù)法—稀釋涂布平板法直接計(jì)數(shù)—計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的制備實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（1）土壤取樣（2）樣品的稀釋（3）稀釋涂布平板法接種（4）微生物的培養(yǎng)與觀察實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)隨堂訓(xùn)練1.用稀釋涂布平板法來(lái)統(tǒng)計(jì)樣品中尿素分解菌的數(shù)目時(shí)，為了提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度，往往要設(shè)置對(duì)照，對(duì)于對(duì)照組的要求可以不包括哪項(xiàng)()A.對(duì)照組培養(yǎng)基也嚴(yán)格滅菌，且不接觸任何微生物B.對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基放在相同的條件下培養(yǎng)C.所用培養(yǎng)基成分及pH完全與實(shí)驗(yàn)組一致D.培養(yǎng)基的量的大小與實(shí)驗(yàn)組必須完全相同答案：D解析：設(shè)置對(duì)照組時(shí)，對(duì)照組培養(yǎng)基也應(yīng)嚴(yán)格滅菌，且不接觸任何微生物，和實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基放在相同的條件下培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基成分及pH與實(shí)驗(yàn)組完全一致，A、B、C不符合題意；設(shè)置對(duì)照組是為了檢測(cè)滅菌是否合格，故對(duì)照組培養(yǎng)基的量的大小與實(shí)驗(yàn)組可不相同，D符合題意。隨堂訓(xùn)練2.某實(shí)驗(yàn)小組完成了“土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)”實(shí)驗(yàn)，下列關(guān)于實(shí)驗(yàn)的敘述正確的是()A.利用以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)土壤微生物，其上生長(zhǎng)的均是能分解尿素的細(xì)菌B.培養(yǎng)一段時(shí)間后，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)減少，有害成分積累，pH會(huì)升高C.觀察培養(yǎng)24h時(shí)的培養(yǎng)基，其菌落特征往往不穩(wěn)定，最可能的原因是稀釋倍數(shù)不當(dāng)D.用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，獲得的個(gè)數(shù)就是該體積樣品中活菌數(shù)與死菌數(shù)之和答案：B解析：培養(yǎng)基以尿素為唯一氮源，其上生長(zhǎng)的都是能合成脲酶的微生物，某些固氮菌不需要培養(yǎng)基提供氮源，A錯(cuò)誤；分解尿素的細(xì)菌大多是異養(yǎng)生物，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)因代謝而減少，脲酶能將尿素分解成氨，氨是一種堿性物質(zhì)，pH會(huì)升高，B正確；培養(yǎng)24h，培養(yǎng)基中的菌落特征往往不穩(wěn)定，可能是由于培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)不足，也可能是由于稀釋倍數(shù)不當(dāng)菌落重疊造成的，C錯(cuò)誤；用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，獲得的個(gè)數(shù)再經(jīng)計(jì)算一定體積樣品中的數(shù)量才是該體積樣品中活菌數(shù)與死菌數(shù)之和，D錯(cuò)誤。隨堂訓(xùn)練4.下列敘述中不正確的是()A.因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量不同，所以，為獲得不同類型的微生物要按不同的稀釋倍數(shù)進(jìn)行分離B.測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍不同C.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目明顯少于選擇培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目，說(shuō)明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌種D.如果得到了3個(gè)或3個(gè)以上菌落數(shù)目在30~300的平板，則說(shuō)明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)答案：C解析：分解尿素的細(xì)菌是異養(yǎng)型，不能以CO2作為碳源，A錯(cuò)誤