高三生物一輪復習課件第十單元第36講考點二基因工程的基本操作程序

第十單元生物技術與工程第36講

基因工程重組DNA技術的基本工具01基因工程的基本操作程序02DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴增及電泳鑒定(實驗)03基因工程的應用和蛋白質工程04目錄考點二基因工程的基本操作程序02在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等相關的基因。目的基因主要是指編碼蛋白質的基因既可來自生物體本身，也可來自不同生物體目的基因來源：與生物抗逆性相關的基因與生產藥物相關的基因與毒物降解相關的基因與工業(yè)用酶相關的基因實例與優(yōu)良品質相關的基因（1）篩選合適的目的基因1、目的基因的篩選與獲?、倌康幕颍簭南嚓P的已知結構和功能清晰的基因中篩選，是較為有效的方法之一。遺傳序列數(shù)據(jù)庫和序列比對工具給篩選提供更多條件。Bt基因是培育轉基因抗蟲棉較為合適的目的基因掌握了Bt基因的序列信息對Bt基因的表達產物——Bt抗蟲蛋白有了較為深入的了解蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花害蟲已有多年歷史（1）篩選合適的目的基因1、目的基因的篩選與獲?、诤Y選目的基因的方法：（2）利用PCR獲取和擴增目的基因PCR：即聚合酶鏈式反應，它是一項根據(jù)DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。①解旋：解旋酶催化（氫鍵斷裂）模板(母鏈)②以母鏈為模板進行堿基互補配對③形成兩個子代DNA原理：DNA半保留復制1、目的基因的篩選與獲?、俜磻h(huán)境：緩沖溶液，提供合適的酸堿度和某些離子（如Mg2+）。

②DNA母鏈：含目的基因，提供DNA復制的模板。

③引物：2種，使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸，是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。

④原料：四種脫氧核苷酸。⑤酶：耐高溫的DNA聚合酶，催化合成子鏈，如Taq酶。注：PCR中解旋用高溫代替。PCR反應條件激活真核細胞和細菌的DNA聚合酶單鏈DNA或單鏈RNA（2）利用PCR獲取和擴增目的基因1、目的基因的篩選與獲取變性：溫度超過90℃時，雙鏈DNA解聚為單鏈。復性：當溫度下降到50℃左右，引物與單鏈DNA結合，形成局部雙鏈。延伸：溫度上升到72℃左右，脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶作用下合成新的DNA鏈。PCR的流程可以在PCR擴增儀（PCR儀）中自動完成。（2）利用PCR獲取和擴增目的基因1、目的基因的篩選與獲取使用瓊脂糖凝膠電泳法電泳：DNA分子在電場作用下發(fā)生遷移，越小的DNA片段距離出發(fā)點越遠。片段相同的DNA分子會停留在相同的條帶，因此可以鑒別PCR的產物是否為目的基因。PCR結果檢測（2）利用PCR獲取和擴增目的基因1、目的基因的篩選與獲取

將含有某物種不同基因的許多DNA片段，結合質粒導入到受體菌群體中儲存，這個受體菌群就是該生物的基因文庫?；蚪M文庫≈國家博物館包括某種生物的全部基因部分基因文庫≈市博物館包括某一種生物的部分基因1、目的基因的篩選與獲?。?）通過構建基因文庫獲取目的基因①讓基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代；②同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。重組DNA分子目的基因標記基因（抗性基因）終止子復制原點一段有特殊序列結構的DNA片段，位于基因上游，緊挨轉錄的起始位點，是RNA聚合酶識別和結合的部位。能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質。啟動子一段有特殊序列結構的DNA片段，位于基因下游，使轉錄在所需要的地方停下來?；虮磉_載體自我復制起始的一段序列。2、基因表達載體的構建（1）構建基因表達載體的目的（2）基因表達載體的組成和功能（3）基因表達載體的構建過程首先用一定的限制酶切割載體，使它出現(xiàn)一個切口；然后用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處，這樣就形成了一個重組DNA分子。2、基因表達載體的構建

方法一：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。

方法二：也可以在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。①花粉管通道法——我國科學家獨創(chuàng)3、將目的基因導入受體細胞（1）受體細胞為植物細胞

當植物體到損傷時，傷口處分泌酚類吸引農桿菌，這時農桿菌中的Ti質粒上的T-DNA（提前已經(jīng)把目的基因嵌入）轉移至受體細胞，并整合到受體細胞染色體DNA上。②農桿菌轉化法3、將目的基因導入受體細胞（1）受體細胞為植物細胞▌顯微注射法將含有目的基因的表達載體采用顯微注射儀顯微注射到受精卵(卵細胞也還行)；受精后經(jīng)胚胎早期培養(yǎng)，再移植到雌性動物的輸卵管或子宮內，使其發(fā)育成為具有新性狀的動物。3、將目的基因導入受體細胞（2）受體細胞為動物細胞Ca2+處理法（感受態(tài)細胞法）使得細胞處于一種能夠吸收周圍環(huán)境DNA的生理狀態(tài)。▌原核生物適合作為受體細胞的原因：結構簡單，繁殖快，易于培養(yǎng)，遺傳物質相對少3、將目的基因導入受體細胞（3）受體細胞為原核細胞（1）分子水平的檢測①檢測轉基因生物染色體的DNA中是否插入了目的基因。②檢測轉基因生物的DNA中的目的基因是否轉錄出了mRNA。③檢測目的基因是否翻譯出了蛋白質。方法：核酸分子雜交、PCR技術方法：抗原－抗體雜交技術方法：核酸分子雜交、PCR技術（2）個體水平的鑒定4、目的基因的檢測與鑒定抗蟲接種實驗或病原體感染法【概念辨析】1．目的基因就是指編碼蛋白質的基因。()2．用PCR方法擴增目的基因時需要設計兩種引物。()3．用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列。()4．抗蟲基因即使成功地插入植物細胞染色體DNA上也未必能正常表達。()5．應用PCR技術，可以檢測轉基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其是否完成表達。()√××√√1、PCR技術和DNA復制的比較2、啟動子、終止子與起始密碼子、終止密碼子的區(qū)別位置作用啟動子起始密碼子終止子終止密碼子位于DNA分子上RNA聚合酶識別和結合位點，啟動轉錄過程位于mRNA分子上決定翻譯的開始位于DNA分子上決定轉錄的結束位于mRNA分子上決定翻譯的結束3、如何篩選出含有目的基因的受體細胞（1）原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，若目的基因插入某種抗生素抗性基因內部，則會導致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環(huán)素抗性基因內部，則四環(huán)素抗性基因失活。（2）被轉化的細菌有3種：含環(huán)狀目的基因的細菌、含重組質粒的細菌、含質粒的細菌。3、如何篩選出含有目的基因的受體細胞（3）篩選方法：將細菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組質粒的細菌和含質粒的細菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如圖能生長的菌落為2、3、4,則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進行培養(yǎng)?？挤?結合PCR技術的應用，考查科學思維能力1．(2022·河北石家莊期末)RT-PCR是將RNA逆轉錄(RT)和cDNA的PCR相結合的技術，可利用此技術獲取目的基因，具體過程如圖所示。下列說法錯誤的是(

)CA．設計擴增目的基因的引物時需已知一段目的基因序列B．GC含量高的引物在與模板鏈結合時，需要更高的溫度C．過程Ⅰ需要加入緩沖液、原料、耐高溫的DNA聚合酶和引物A等D．過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進行n次循環(huán)的擴增，理論上需要2n－1個引物BA．耐高溫的DNA聚合酶總將游離的脫氧核苷酸連接到3′端B．在第三輪循環(huán)產物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段C．引物之間或引物自身發(fā)生堿基互補配對，則不能有效擴增目的基因D．從理論上推測，第五輪循環(huán)產物中含有引物A的DNA片段占15/16考法1結合PCR技術的應用，考查科學思維能力2．(2022·海南模擬)如圖表示利用PCR技術擴增目的基因的部分過程，其原理與細胞內DNA復制類似。下列敘述錯誤的是(

)DA．轉化是指將hGC基因導入煙草細胞，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程B．過程③一般采用顯微注射將農桿菌導入煙草細胞C．從含重組Ti質粒的農桿菌中獲取hGC基因的表達產物可直接用于疾病治療D．從愈傷組織中提取蛋白質作為抗原進行抗原—抗體雜交檢測hGC基因是否轉錄考法2圍繞基因工程的基本操作程序，考查科學思維能力3．(2022·福建城廂期末)人葡萄糖腦苷脂酶(hGC)缺乏癥是一種常染色體隱性遺傳病，患者因缺乏hGC基因而不能合成hGC，導致脾臟腫大、梗死和破裂，所以通?；畈贿^10歲。傳統(tǒng)的治療方法是從人的胎盤中提取hGC后注入人體，治療價格十分昂貴。科學家現(xiàn)已將hGC基因通過農桿菌轉化法成功轉入煙草中，并高效表達，其過程如圖所示。下列說法正確的是(

)A1、在基因工程的基本操作程序中，目的基因的獲取的途徑不包括()A．從基因文庫中獲取目的基因B．利用PCR技術擴增目的基因C．人工合成目的基因D．利用DNA分子雜交技術，獲取目的基因D2、下列關于基因工程的敘述，正確的是()A．只能用同一種限制酶處理含目的基因的DNA和載體B．細菌質粒、動植物病毒等是基因工程常用的載體C．培育抗除草劑的作物新品種，導入目的基因時只能以受精卵為受體D．可用PCR檢測目的基因是否成功表達B作業(yè)3、PCR是一種體外迅速擴增DNA片段的技術，下列有關PCR過程的敘述，不正確的是()A．變性過程中破壞的是DNA分子內堿基對之間的氫鍵B．復性過程中引物與DNA模板鏈的結合依靠堿基互補配對原則完成C．延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸D．PCR與細胞內DNA復制相比所需要酶的最適溫度較高C作業(yè)4、下列關于PCR擴增DNA片段和電泳檢測擴增產物實驗的敘述，錯誤的是()A．PCR過程需要耐高溫的DNA聚合酶B．PCR過程需要DNA連接酶C．PCR擴增區(qū)域由2個引