熒光分光光度法測定藥液維生素B的含量專家講座

熒光分光光度法測定藥液維生素B2含量試驗目標學習熒光分光光度法測定藥液中維生素B2分析原理。掌握熒光分光光度計操作技術和測定藥液中維生素B2方法。熒光分光光度法測定藥液維生素B的含量專家講座第1頁試驗原理熒光分析法

常溫下，處于基態(tài)分子吸收一定紫外可見光輻射能成為激發(fā)態(tài)分子，激發(fā)態(tài)分子經(jīng)過無輻射躍遷至第一激發(fā)態(tài)最低振動能級，再以輻射躍遷形式回到基態(tài)，發(fā)出比吸收光波長長光而產(chǎn)生熒光。在稀溶液中，熒光強度IF與物質(zhì)濃度c有以下關系：當試驗條件一定時，熒光強度與熒光物質(zhì)濃度成線性關系：這是熒光光譜法定量分析理論依據(jù)。熒光分光光度法測定藥液維生素B的含量專家講座第2頁a.與紫外-可見分光度法比較，熒光分析法含有更高靈敏度。b.選擇性好。熒光法既能依據(jù)發(fā)射光譜，又能依據(jù)吸收光譜來判定物質(zhì)。c.所需試樣量少、操作方法簡便。熒光分析法特點熒光分光光度法測定藥液維生素B的含量專家講座第3頁激發(fā)光譜：固定測量波長(選最大發(fā)射波長)，化合物發(fā)射熒光強度與照射光波長關系曲線。激發(fā)光譜曲線最高處，處于激發(fā)態(tài)分子最多，熒光強度最大。發(fā)射光譜：固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射熒光強度與發(fā)射光波長關系曲線。固定發(fā)射光波長進行激發(fā)光波長掃描，找出最大激發(fā)光波長，然后固定激發(fā)光波長進行熒光發(fā)射波長掃描，找出最大熒光發(fā)射波長。激發(fā)光波長和發(fā)射熒光波長選擇是本試驗關鍵。熒光光譜激發(fā)光譜發(fā)射光譜熒光分光光度法測定藥液維生素B的含量專家講座第4頁熒光分析儀器

慣用熒光分析儀器由激發(fā)光源、單色器、液槽、檢測器和顯示統(tǒng)計器五部分組成，以下列圖所表示：熒光分析儀器與分光光度計比較主要差異有兩點：a.熒光分析儀器采取垂直測量方式，以消除透射光影響；b.熒光分析儀器有兩個單色器，能夠取得單色性很好激發(fā)光并消除其它雜散光干擾。液槽顯示器單色器檢測器I0IIf光源單色器熒光分光光度法測定藥液維生素B的含量專家講座第5頁a.光源：在熒光計中慣用鹵鎢燈作光源；熒光分度計常采取高壓汞燈或氙弧燈做光源。b.單色器：熒光計單色器是濾光片，只能用于定量分析；熒光分光光度計采取兩個光柵單色器，可取得激發(fā)光譜和熒光光譜。c.檢測器：熒光計采取光電管作檢測器；熒光分光光度計采取光電倍增管作檢測器。儀器部件熒光分光光度法測定藥液維生素B的含量專家講座第6頁

維生素B2（又叫核黃素，VB2）是橘黃色無臭針狀結晶，其結構式為：維生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有機溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對熱穩(wěn)定。藥液維生素B2含量測定熒光分光光度法測定藥液維生素B的含量專家講座第7頁

維生素B2溶液在430～440nm藍光照射下，發(fā)出綠色熒光，其峰值波長為525nm。VB2熒光在pH=6～7時最強，在pH=11時消失。維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射會發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，光黃素熒光比核黃素熒光強多，故測VB2熒光時溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進行。

光黃素熒光分光光度法測定藥液維生素B的含量專家講座第8頁試驗預習預習熒光分光光度法測定維生素B2分析原理。了解熒光光度計操作步驟和測定維生素B2方法。熒光分光光度法測定藥液維生素B的含量專家講座第9頁F96型熒光光度計（上海棱光分析儀器有限企業(yè)）5mL吸量管1只，2mL吸量管1只，50mL容量瓶7只10.0μg·mL-1VB2標準溶液（置陰暗處保留），冰乙酸（AR），藥用VB2試樣儀器與試劑熒光分光光度法測定藥液維生素B的含量專家講座第10頁1.打開氙燈，再打開主機，然后打開計算機啟開工作站并初始化儀器。2.儀器初始化完成后，在工作界面上選擇測量項目，設置適當儀器參數(shù)：激發(fā)波長=440nm（本儀器只有356nm），發(fā)射波長=540nm。3.樣品測定。4.退出主程序，關閉計算機，先關主機，最終關氙燈?；静僮鳠晒夥止夤舛确y定藥液維生素B的含量專家講座第11頁1.標準系列溶液配制及標準溶液熒光強度測定：在六個潔凈50mL容量瓶中，分別吸收0.50、1.00、1.50，2.00、2.50和3.00mLVB2標準溶液，各加入2.00mL冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。從稀到濃測量系列標準溶液熒光強度。2.未知試樣測定:

移取0.1mL試樣,用少許水溶解后轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，加2.00mL冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。用測定標準系列時相同條件，測量其熒光強度。試驗步驟熒光分光光度法測定藥液維生素B的含量專家講座第12頁1.用標準系列溶液熒光強度繪制標準工作曲線。2.依據(jù)待測液熒光強度，從標準工作曲線上求得其濃度，計算出試樣中VB2含量。數(shù)據(jù)處理熒光分光光度法測定藥液維生素B的含