培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)專家講座

試驗(yàn)用具一、材料和標(biāo)本

培養(yǎng)中幾個(gè)細(xì)胞。二、器材和儀器

倒置顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、普通光學(xué)顯微鏡、乳頭吸管。三、試

劑

0.3%臺(tái)盼蘭染液等培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)專家講座第1頁(yè)試驗(yàn)內(nèi)容

一、培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)觀察(一)原理體外培養(yǎng)細(xì)胞主要有兩種狀態(tài)。一個(gè)是能貼附在培養(yǎng)支持物上細(xì)胞,如內(nèi)皮細(xì)胞,叫貼壁型細(xì)胞。體外培養(yǎng)細(xì)胞絕大多數(shù)都屬于這種細(xì)胞。另一個(gè)細(xì)胞-并不貼附在容器壁上，而是懸浮在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，如HL-60,叫做懸浮型細(xì)胞,這類細(xì)胞主要是血液原性或癌原性細(xì)胞。

培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)專家講座第2頁(yè)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)專家講座第3頁(yè)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)專家講座第4頁(yè)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)專家講座第5頁(yè)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)專家講座第6頁(yè)(二)操作1.從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶,注意觀察細(xì)胞培養(yǎng)液顏色和清澈度。然后,將細(xì)胞培養(yǎng)瓶平穩(wěn)地放在倒置顯微鏡載物臺(tái)上。2.打開(kāi)倒置鏡光源,經(jīng)過(guò)雙筒目鏡將視野調(diào)到適當(dāng)亮度。3.調(diào)整載物臺(tái)高度進(jìn)行對(duì)焦,在看到細(xì)胞層之后,再用細(xì)調(diào)整器將物像調(diào)清楚,注意觀察細(xì)胞輪廓、形狀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。在觀察時(shí)，最經(jīng)常使用是10×物鏡。培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)專家講座第7頁(yè)（三）結(jié)果貼壁細(xì)胞一般有兩種形狀,即上皮細(xì)胞形和成纖維細(xì)胞形細(xì)胞。上皮細(xì)胞形細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形,圓形核位于中央,生長(zhǎng)時(shí)常彼此緊密連接成單層細(xì)胞片,如HeLa細(xì)胞。成纖維細(xì)胞形細(xì)胞形態(tài)與體內(nèi)成纖維細(xì)胞形態(tài)相同,胞體呈梭形或不規(guī)則三角形,中央有圓核,胞質(zhì)向外伸出2～3個(gè)長(zhǎng)短不一樣突起,細(xì)胞群常借原生質(zhì)突連接成網(wǎng),如

NIH3T3。培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)專家講座第8頁(yè)貼壁細(xì)胞在生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),細(xì)胞內(nèi)顆粒少,看不到有空泡,細(xì)胞邊緣清楚,培養(yǎng)基內(nèi)看不到懸浮細(xì)胞和碎片,培養(yǎng)液清澈透明,而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)顆粒較多,透明差,空泡多時(shí),表明生長(zhǎng)較差。當(dāng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基混濁時(shí)，應(yīng)想到細(xì)菌或真菌污染可能。懸浮細(xì)胞當(dāng)邊緣清楚,透明發(fā)亮?xí)r,生長(zhǎng)很好；反之,則較差或已死亡。培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)專家講座第9頁(yè)因?yàn)榕囵B(yǎng)基內(nèi)有pH指示劑存在,所以它顏色往往能夠間接地表明細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。呈橙黃色，細(xì)胞普通生長(zhǎng)狀態(tài)很好；呈淡黃色時(shí),則可能是培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),營(yíng)養(yǎng)不足,死亡細(xì)胞過(guò)多；如呈紫紅色,則可能是細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不好,或已死亡。一個(gè)細(xì)胞在培養(yǎng)中形態(tài)并不是永恒不變,它隨營(yíng)養(yǎng)、pH、生長(zhǎng)周期而改變,但在比較穩(wěn)定條件下形態(tài)基本是一致。在貼壁細(xì)胞培養(yǎng)中,鏡下折光率高,圓而發(fā)亮普通被認(rèn)為是分裂期細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞有重合生長(zhǎng)特征。培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)專家講座第10頁(yè)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)專家講座第11頁(yè)二、培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)及活細(xì)胞判定（一）原理細(xì)胞生物學(xué)試驗(yàn)中,往往要進(jìn)行活細(xì)胞判定和細(xì)胞計(jì)數(shù)、調(diào)整細(xì)胞密度,是進(jìn)行試驗(yàn)必不可少一個(gè)基本技能。培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)專家講座第12頁(yè)（二）操作1.將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液倒人潔凈試管中,向培養(yǎng)瓶中加入

0.25%胰蛋白酶

/0.02%EDTA混合消化液1.0m1,靜置3～5分鐘,待見(jiàn)到細(xì)胞變圓,彼此不連接為止。2.將試管中培養(yǎng)液倒回培養(yǎng)瓶中,并輕輕進(jìn)行吹打,制成細(xì)胞懸液。培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)專家講座第13頁(yè)3.取細(xì)胞懸液0.5m1,加入0.3%臺(tái)盼蘭染液0.5ml時(shí),混合后染色

3～5分鐘。4.滴加少許已染色細(xì)胞懸液于放有蓋片細(xì)胞計(jì)數(shù)板斜面上,使液體自然充滿計(jì)數(shù)板小室。注意不要使小室內(nèi)有氣泡產(chǎn)生,不然要重新滴加。在普通光鏡10×物鏡下計(jì)數(shù)四個(gè)大格內(nèi)

(如圖1，2示)細(xì)胞數(shù),壓線者數(shù)上不數(shù)下,數(shù)左不數(shù)右。培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)專家講座第14頁(yè)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)專家講座第15頁(yè)（三）結(jié)果細(xì)胞濃度計(jì)數(shù)4大格細(xì)胞總數(shù)×104×稀釋倍數(shù)/4=細(xì)胞數(shù)／ml（4大格中細(xì)胞總數(shù)－染色細(xì)胞）×104×稀釋倍數(shù)/4=活細(xì)胞數(shù)／ml懸液

注①

4大格中每一大格體積為0.lmm3。

1ml＝10000大格，所以，1大格細(xì)胞數(shù)×104＝細(xì)胞數(shù)／ml。

注②

染色標(biāo)本在15分鐘內(nèi)檢驗(yàn)計(jì)數(shù)，因?yàn)榕_(tái)盼蘭染液能夠快速地使死細(xì)胞染上蘭色，延長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞也將著色，用此方法來(lái)分辨死活細(xì)胞。

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