培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察和計數(shù)專家講座

試驗用具一、材料和標本

培養(yǎng)中幾個細胞。二、器材和儀器

倒置顯微鏡、細胞計數(shù)板、普通光學顯微鏡、乳頭吸管。三、試

劑

0.3%臺盼蘭染液等培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察和計數(shù)專家講座第1頁試驗內(nèi)容

一、培養(yǎng)細胞形態(tài)觀察(一)原理體外培養(yǎng)細胞主要有兩種狀態(tài)。一個是能貼附在培養(yǎng)支持物上細胞,如內(nèi)皮細胞,叫貼壁型細胞。體外培養(yǎng)細胞絕大多數(shù)都屬于這種細胞。另一個細胞-并不貼附在容器壁上，而是懸浮在培養(yǎng)液中生長，如HL-60,叫做懸浮型細胞,這類細胞主要是血液原性或癌原性細胞。

培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察和計數(shù)專家講座第2頁培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察和計數(shù)專家講座第3頁培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察和計數(shù)專家講座第4頁培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察和計數(shù)專家講座第5頁培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察和計數(shù)專家講座第6頁(二)操作1.從培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)瓶,注意觀察細胞培養(yǎng)液顏色和清澈度。然后,將細胞培養(yǎng)瓶平穩(wěn)地放在倒置顯微鏡載物臺上。2.打開倒置鏡光源,經(jīng)過雙筒目鏡將視野調(diào)到適當亮度。3.調(diào)整載物臺高度進行對焦,在看到細胞層之后,再用細調(diào)整器將物像調(diào)清楚,注意觀察細胞輪廓、形狀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。在觀察時，最經(jīng)常使用是10×物鏡。培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察和計數(shù)專家講座第7頁（三）結(jié)果貼壁細胞一般有兩種形狀,即上皮細胞形和成纖維細胞形細胞。上皮細胞形細胞呈扁平不規(guī)則多角形,圓形核位于中央,生長時常彼此緊密連接成單層細胞片,如HeLa細胞。成纖維細胞形細胞形態(tài)與體內(nèi)成纖維細胞形態(tài)相同,胞體呈梭形或不規(guī)則三角形,中央有圓核,胞質(zhì)向外伸出2～3個長短不一樣突起,細胞群常借原生質(zhì)突連接成網(wǎng),如

NIH3T3。培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察和計數(shù)專家講座第8頁貼壁細胞在生長狀態(tài)良好時,細胞內(nèi)顆粒少,看不到有空泡,細胞邊緣清楚,培養(yǎng)基內(nèi)看不到懸浮細胞和碎片,培養(yǎng)液清澈透明,而當細胞內(nèi)顆粒較多,透明差,空泡多時,表明生長較差。當瓶內(nèi)培養(yǎng)基混濁時，應(yīng)想到細菌或真菌污染可能。懸浮細胞當邊緣清楚,透明發(fā)亮時,生長很好；反之,則較差或已死亡。培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察和計數(shù)專家講座第9頁因為培養(yǎng)基內(nèi)有pH指示劑存在,所以它顏色往往能夠間接地表明細胞生長狀態(tài)。呈橙黃色，細胞普通生長狀態(tài)很好；呈淡黃色時,則可能是培養(yǎng)時間過長,營養(yǎng)不足,死亡細胞過多；如呈紫紅色,則可能是細胞生長狀態(tài)不好,或已死亡。一個細胞在培養(yǎng)中形態(tài)并不是永恒不變,它隨營養(yǎng)、pH、生長周期而改變,但在比較穩(wěn)定條件下形態(tài)基本是一致。在貼壁細胞培養(yǎng)中,鏡下折光率高,圓而發(fā)亮普通被認為是分裂期細胞。腫瘤細胞有重合生長特征。培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察和計數(shù)專家講座第10頁培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察和計數(shù)專家講座第11頁二、培養(yǎng)細胞計數(shù)及活細胞判定（一）原理細胞生物學試驗中,往往要進行活細胞判定和細胞計數(shù)、調(diào)整細胞密度,是進行試驗必不可少一個基本技能。培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察和計數(shù)專家講座第12頁（二）操作1.將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液倒人潔凈試管中,向培養(yǎng)瓶中加入

0.25%胰蛋白酶

/0.02%EDTA混合消化液1.0m1,靜置3～5分鐘,待見到細胞變圓,彼此不連接為止。2.將試管中培養(yǎng)液倒回培養(yǎng)瓶中,并輕輕進行吹打,制成細胞懸液。培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察和計數(shù)專家講座第13頁3.取細胞懸液0.5m1,加入0.3%臺盼蘭染液0.5ml時,混合后染色

3～5分鐘。4.滴加少許已染色細胞懸液于放有蓋片細胞計數(shù)板斜面上,使液體自然充滿計數(shù)板小室。注意不要使小室內(nèi)有氣泡產(chǎn)生,不然要重新滴加。在普通光鏡10×物鏡下計數(shù)四個大格內(nèi)

(如圖1，2示)細胞數(shù),壓線者數(shù)上不數(shù)下,數(shù)左不數(shù)右。培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察和計數(shù)專家講座第14頁培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察和計數(shù)專家講座第15頁（三）結(jié)果細胞濃度計數(shù)4大格細胞總數(shù)×104×稀釋倍數(shù)/4=細胞數(shù)／ml（4大格中細胞總數(shù)－染色細胞）×104×稀釋倍數(shù)/4=活細胞數(shù)／ml懸液

注①

4大格中每一大格體積為0.lmm3。

1ml＝10000大格，所以，1大格細胞數(shù)×104＝細胞數(shù)／ml。

注②

染色標本在15分鐘內(nèi)檢驗計數(shù)，因為臺盼蘭染液能夠快速地使死細胞染上蘭色，延長時間活細胞也將著色，用此方法來分辨死活細胞。

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