超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)

超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第1頁(yè)

超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第2頁(yè)一.SOD概況二.SOD利用三.SOD生產(chǎn)四.SOD活力測(cè)定超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第3頁(yè)一.SOD概況1.SOD概念超氧物歧化酶（SuperoxideDismutase簡(jiǎn)稱SOD）是一個(gè)新型酶制劑。它在生物界分布極廣，幾乎從動(dòng)物到植物，甚至從人到單細(xì)胞生物，都有它存在。SOD被視為生命科技中最具神奇魔力酶、人體內(nèi)垃圾清道夫。SOD是氧自由基自然天敵，是機(jī)體內(nèi)氧自由基頭號(hào)殺手，是生命健康之本。全球118位科學(xué)家發(fā)表聯(lián)合申明：自由基是百病之源，SOD是健康之本。體內(nèi)SOD活性越高，壽命就越長(zhǎng)。

超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第4頁(yè)2、SOD分類超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第5頁(yè)3、作用原理⑴基礎(chǔ)原理

SOD屬于金屬蛋白酶，按照結(jié)合金屬離子種類不一樣，該酶有以下三種：含銅與鋅超氧化物歧化酶（Cu-ZnSOD）、含錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和含鐵超氧化物歧化酶（Fe-SOD）。三種SOD都催化超氧化物陰離子自由基，將之歧化為過(guò)氧化氫與氧氣。超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第6頁(yè)超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第7頁(yè)⑵人體內(nèi)自由基在細(xì)胞因?yàn)樽杂苫浅；顫?，化學(xué)反應(yīng)性極強(qiáng)，參加一系列連鎖反應(yīng)，能引發(fā)細(xì)胞生物膜上脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞了膜結(jié)構(gòu)和功效。它能引發(fā)蛋白質(zhì)變性和交聯(lián)，使體內(nèi)許多酶及激素失去生物活性，機(jī)體免疫能力、神經(jīng)反射能力、運(yùn)動(dòng)能力等系統(tǒng)活力降低，同時(shí)還能破壞核酸結(jié)構(gòu)和造成整個(gè)機(jī)體代謝失常等，最終使機(jī)體發(fā)生病變。超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第8頁(yè)4.SOD理化性質(zhì)

3.1SOD對(duì)氰化物和H2O2敏感性

3.2SOD吸收光譜特征3.3SOD穩(wěn)定性及影響原因超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第9頁(yè)5.SOD作用它催化超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2和O2反應(yīng)，即催化超氧陰離子自由基O2-·發(fā)生歧化反應(yīng)，從而去除O2-·，2O2-·+2H+→H2O2+O2，在生命體自我保護(hù)系統(tǒng)中起著極為主要作用，在免疫系統(tǒng)中也有主要功，因而它能防御氧毒性，增強(qiáng)機(jī)體抗輻射損傷能力，防衰老。超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第10頁(yè)超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第11頁(yè)6、測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）催化底物是O2，普通多以一定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物生成量或底物消耗量作為酶活性單位。因?yàn)镺2本身很不穩(wěn)定，且不易制備，測(cè)定SOD方法除少數(shù)采取直接法外，普通多為間接法。常見(jiàn)有：⑴鄰苯三酚自氧化法⑵細(xì)胞色素C還原法（McCord法）⑶化學(xué)發(fā)光法⑷免疫學(xué)方法

⑸電泳法超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第12頁(yè)3.1SOD對(duì)氰化物和H2O2敏感性長(zhǎng)時(shí)間用過(guò)氧化氫處理可使CuZn-SOD和Fe-SOD失活，而Mn-SOD不受影響超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第13頁(yè)3.2SOD吸收光譜特征CuZn-SOD含有獨(dú)特紫外吸收光譜。因?yàn)樯彼岷屠野彼岷枯^低，它在280nm處并沒(méi)有最大吸收峰。CuZn-SOD可見(jiàn)光最大吸收波長(zhǎng)都在680nm左右，這反應(yīng)了酶分子中Cu2+光學(xué)特征。超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第14頁(yè)3.3SOD穩(wěn)定性及影響原因PH、熱、蛋白酶影響：SOD在pH5.3～9.6間催化性能良好，在pH4.5～pH11間能穩(wěn)定存在。pH3.6時(shí)，CuZn-SOD中95%Zn要脫落，在pH12.2時(shí)，SOD構(gòu)象會(huì)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)變而使酶失活。

SOD對(duì)熱穩(wěn)定性與溶液中離子強(qiáng)度相關(guān)。當(dāng)離子強(qiáng)度很低時(shí),即使加熱到95℃,其活性損失也極少其它原因：SOD活性受飲料色澤、成份、酸堿度、乙醇含量等各種原因影響，只有在無(wú)色、近中性、無(wú)乙醇飲料中SOD活性較穩(wěn)定。另外還發(fā)覺(jué)有機(jī)溶劑和Cl對(duì)SOD活性具抑制作用超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第15頁(yè)二SOD利用1.藥品SOD是一個(gè)新型抗炎癥藥，依據(jù)SOD作用機(jī)制和毒性試驗(yàn)，它對(duì)治療因O2-·引發(fā)各種疾病都有一定療效。為此，SOD可作為抗衰老、抗炎癥、本身免疫疾病患者廣泛應(yīng)用醫(yī)藥品。另外，SOD對(duì)治療貝切特氏癥、心肌梗塞等血虛性心臟病、膠原病、新生兒呼吸困難綜合癥、防御放射性傷害等也可望有效。

超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第16頁(yè)二SOD利用2.添加劑國(guó)外不少高級(jí)化裝品都添加SOD，我國(guó)也有數(shù)家工廠或企業(yè)在開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)SOD化裝品，如大寶SOD密，康妮SOD、SOD康舒達(dá)霜?jiǎng)┑?。SOD作為化裝品添加劑主要有3個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（1）有顯著防曬效果（2）可防皮膚衰老，阻止紫褐質(zhì)（老年斑）形成（3）有顯著抗炎效果，對(duì)防治皮膚病有一定效果。國(guó)外把SOD作為食品添加劑例子是加在口香糖和飲料中。我國(guó)貴州農(nóng)學(xué)院已開(kāi)發(fā)出刺梨SOD飲料。SOD及修飾過(guò)SOD還可作為外用藥膏、眼藥及牙膏等添加劑

超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第17頁(yè)二SOD利用3.生化試劑國(guó)外已經(jīng)有數(shù)家企業(yè)如Sigma企業(yè)等出售SOD試劑，我國(guó)也有廠家批量生產(chǎn)SOD試劑，如中科院上海生化所東風(fēng)試劑廠、南京建成生物工程研究所等。另外，SOD有可能作為一些疾病探針，如郭彥等人認(rèn)為腦瘤組織線粒體Mn-SOD降低是轉(zhuǎn)化細(xì)胞可靠生化指標(biāo)之一，并可作為評(píng)定腦瘤分化程度參考。

總而言之，伴隨大家對(duì)SOD更廣泛深入研究，不一樣類型SOD、SOD修飾物及人工有機(jī)合成SOD模擬酶將在醫(yī)療、保健、食品、農(nóng)業(yè)增產(chǎn)等方面發(fā)揮出更大作用。

超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第18頁(yè)三.SOD生產(chǎn)

1.SOD酶提取稱取5克大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎細(xì)胞后，加入pH7.8,0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.8）15ml，繼續(xù)研磨20min,使SOD酶充分溶解到緩沖液中，然后6000r/min冰凍離心15min，放棄沉淀，取上清液。

2.去除雜蛋白上清液中加入0.25倍體積氯仿——乙醇混合液攪拌15min,6000r/min離心15min，放棄沉淀，得到上清液即是粗酶液

3.SOD酶沉淀分離粗酶液在攪拌下遲緩加入固體硫酸銨至飽和濃度60%，連續(xù)攪拌15min，6000r/min離心15min，得到SOD酶沉淀超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第19頁(yè)三.SOD生產(chǎn)4.將沉淀溶入pH7.8，0.05mol/L磷酸緩沖液5mL中，然后6000r/min離心15min，放棄沉淀，取上清液，用凝膠sephacylS-200進(jìn)行純化，然后超濾濃縮。5.用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃液蛋白含量6.將濃縮冷凍干燥后即得成品。超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第20頁(yè)四、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定原理連苯三酚在堿性條件下，能快速自氧化，釋放出O2-,生成帶色中間產(chǎn)物。在自氧化過(guò)程初始階段，黃色中間產(chǎn)物積累在滯后30-45s后就與時(shí)間展現(xiàn)性關(guān)系。中間產(chǎn)物在325nm處有強(qiáng)烈光吸收，在有SOD存在時(shí)能催化生成O2和H2O2，從而阻止了中間產(chǎn)物積累，經(jīng)過(guò)計(jì)算就能夠求出SOD活力。超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第21頁(yè)儀器紫外分光光度計(jì)、pH計(jì),離心機(jī)超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第22頁(yè)試劑⑴0.05mol/L連苯三酚溶液：稱取3.15g連苯三酚用0.01mol/L鹽酸溶液溶解并定容至500ml⑵pH=8.3Tris-HCl緩沖溶液①0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液:NH2C(CH2OH)3121.14取12.114g,溶解，定容至100ml②0.1mol/L鹽酸:取8.6(9)ml濃鹽酸，稀釋至1000ml③50毫升0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液19.9_毫升0.1mol/L鹽酸混勻并稀釋至100毫升。(保留溫度:常溫密封避光保留)超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第23頁(yè)測(cè)定步驟酶液制備稱取6g樣品，加于現(xiàn)在冰箱中放置緩沖液60ml(樣品10倍，視情況定)，在冰浴中研磨成勻漿，四層紗布過(guò)濾，濾液經(jīng)4000r/min離心20min,取上清液用于酶活測(cè)定。超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第24頁(yè)連苯三酚自氧化速率測(cè)定取4.5ml緩沖液，在25℃水浴中保溫15min,加入10連苯三酚液，快速搖勻空白：取4.5ml緩沖液，在25℃水浴中保溫15min,加入10緩沖液，快速搖勻倒入光徑1cm比色杯中，在325nm波長(zhǎng)下于恒溫池中每隔30s測(cè)A值一次計(jì)算線形范圍內(nèi)，每1minA增值，此即連苯三酚自氧化速率，要求自氧化速率控制在0.07OD/min超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第25頁(yè)酶活測(cè)定測(cè)定方法與測(cè)連苯三酚自氧化速率相同，取1.5ml緩沖液，在25℃水浴中保溫15min,加入3ml酶液，加入10連苯三酚液，快速搖勻空白：取1.5ml緩沖液，在25℃水浴中保溫15min,加入3ml酶液，加入10緩沖液，快速搖勻計(jì)算加酶后連苯三酚自氧化速率超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第26頁(yè)結(jié)果計(jì)算樣品酶活單位表示，SOD酶活單位（U）/g鮮重樣品酶活單位=式中——酶樣品在325nm處每分鐘光密度改變值

V——反應(yīng)液體積

n——酶液稀釋倍數(shù)（若酶液足夠多，可不稀釋即n為1）超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)第27頁(yè)五.SOD使用及生產(chǎn)時(shí)注意事項(xiàng)1.SOD安全性大量試驗(yàn)和臨床應(yīng)用表明，不論何種給藥方式