櫟樹猝死病菌檢疫鑒定方法

1范圍英文名：pathogenofsudde櫟樹猝死病菌(Phytophthorsramorum).也稱多枝疫霉，屬真菌界(Fungi),卵菌菌燜(Oomycetes),腐霉目(Pythiales),腐霉科(Pythiaceae),疫霉屬(PhytophthoradeBary)。3.1.4高速離心機(jī)。24.2培養(yǎng)基4.2.1選擇性培養(yǎng)基PARP-V850ml.過濾后的V8液，17g瓊脂，950ml.燕餾水，滅菌后冷卻到50℃,加入在50%的西馬霉素0.01g、氨芐青霉素鈉鹽0.25g.利福平鈉鹽0.01g和五氧硝基苯0.05g《可按比例在二甲基亞砜中溶解后加入)。4.2.2胡蘿卜絲培養(yǎng)基CPA50g胡蘿卜切絲，22g瓊脂，1000ml.燕餾水，滅菌。4.2.3V8培養(yǎng)基V8液體100mL,加入2.5g碳酸鈣，15g瓊脂，蒸餾水900mL,滅菌。5鑒定方法5.1癥狀檢查檢驗(yàn)苗木時(shí)，主要查驗(yàn)枝梢和葉部。杜鵑花等花卉植物癥狀為葉片上有黑褐色病斑，莖部有凹陷潰瘍斑，枝梢和葉常出現(xiàn)枯萎。檢驗(yàn)標(biāo)樹等原木木材時(shí)，重點(diǎn)查驗(yàn)潰瘍斑。流瘍凹陷或平坦，常有暗紅至黑色的粘性流膠滲出，樹皮內(nèi)部組織褪色，壞死區(qū)域的邊緣有照環(huán)圍繞。取有疑似癥狀的植物的葉、枝、樹皮、根等植物部分做分離培養(yǎng)。土壤和栽培介質(zhì)也是傳播病菌的主要途徑，檢驗(yàn)時(shí)收集被攜帶進(jìn)境的土壤和栽培介質(zhì)，做誘集試驗(yàn)。5.2分離培養(yǎng)和誘集5.2.1植物組織和木材的分離培養(yǎng)取植物組織或木材上的病健交界處(無明顯癥狀的取靠近地下部的組織)5mm～10mm,0.5%次氯酸鈉消毒2min~5min.在選擇性培養(yǎng)基PARPV8和胡蘿卜絲培養(yǎng)基CPA上，20℃~22℃黑暗培養(yǎng)1周~2周。如有白色真菌菌落出現(xiàn)，可轉(zhuǎn)入V8培養(yǎng)基上20℃12h光照/12h黑暗培養(yǎng)。5.2.2土壤和裁培介質(zhì)的誘集塑料盒中放入土壤或介質(zhì)，加入2倍體積的無菌雙蒸水，將數(shù)張健康的杜鵑葉片(國內(nèi)市場(chǎng)上杜鵬品種即可)流水沖洗干凈，濾紙吸干水分，葉面朝上漂放在水上，蓋上盒蓋，15℃12h光照/12h黑暗培養(yǎng)。3d后開始檢查，取有失綠或水浸狀斑的葉片，切取病健交界處，在胡蘿卜絲培養(yǎng)基20℃~22℃黑5.3分子生物學(xué)鑒定將有疑似癥狀的植物葉片、枝條、鑒，以及分離出的菌絲，按CTAB法提取DNA(參見附錄C)。P.ramornwt首輪PCR特異性引物Phytol和Phyto4序列分別為5'-CATGGCGAGCGCTTGA-3',5'GAAGCCGCCAACACAAG-3',第2輪引物Phyto2和Phyto3的序列分別為5'AAAGCC兩輪PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件相同，第2輪DNA樣品為稀釋500倍的首輪PCR產(chǎn)物。25pl的反應(yīng)體系有樣品DNA5pL.10XPCRbuffer2.5μL.25mmol/1.氯化鎂Apl.10mmol/LdNTPs0,5μL,5pmol/1.Primers1.25pl./1.25pL,5U/gL.Tag聚合酶0.25pl.,雙蒸水10.25pl.。反應(yīng)條件為94℃85g→93℃35s,62℃55s、72℃50s.35個(gè)循環(huán)→72℃10min。在0.5×TBE電泳緩沖液中，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，5V/cm,0,5%EB染色20min,凝膠成像儀分析結(jié)果。必要時(shí)做熒光PCR檢測(cè)(參見附錄D)。5.4菌種保藏將分離菌接在V8培養(yǎng)基上，待菌落長(zhǎng)滿后，切成邊長(zhǎng)1cm小塊，放在有無菌水的試管中，封好，室溫保存。6鑒定標(biāo)準(zhǔn)6.1菌落特征和病菌形態(tài)P.ramurnm的生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢·在PARPV8和CPA上為2mm/d~3mm/d。PARP-V8上的菌落稀薄，菌絲在培養(yǎng)基間生長(zhǎng)，珊瑚狀，氣生菌絲極少；CPA上菌落呈同心環(huán)，稍稀疏，氣生菌絲不多。V8培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好，菌落致密，平鋪。P.ramorwm在生長(zhǎng)3d后開始產(chǎn)生大量的厚垣孢子，分生孢子囊在有光照時(shí)可大量生成。P.ramwrmm的菌絲多節(jié)，高度分枝，彎曲，成樹枝狀結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生孢子囊，厚垣孢子和卵孢子。孢子囊大多為桶圓形、紡錘體形或長(zhǎng)卵形，有半乳突，易脫落，無柄或具有短柄，長(zhǎng)×寬范圍值為(25gm~97μm)×(14pm~34pm),平均24pm×52μm,長(zhǎng)寬比范圍為1,8~2,4,P,ramorum孢子囊較長(zhǎng)的特征是它與其他近似種區(qū)分的重要特性。厚垣孢子由菌絲端產(chǎn)生，球形，壁薄，在培養(yǎng)基上先為透明，然后發(fā)展至淺褐色，揭色，形態(tài)很大，直徑一般為46,4μm～60,1gm,最大可達(dá)88μm,P.ramorum的厚垣孢子大，產(chǎn)生豐盛也是它的主要特征之一。病菌為異宗配合，卵孢子大小為27.2pm～31.4μm。6.2PCR特異性產(chǎn)物巢式PCR的首輪特異性擴(kuò)增片段為687bp,第2輪特異性擴(kuò)增片段為291bp。7結(jié)果判定根據(jù)櫟樹猝死病菌的鑒定標(biāo)準(zhǔn)(見第6章),對(duì)分離菌和核酸提取物進(jìn)行判定。如分離菌的形態(tài)特征或PCR產(chǎn)物與鑒定指標(biāo)吻合，可鑒定為櫟樹猝死病菌，否則，不視為標(biāo)樹猝死病菌。(資料性附錄)1白冷杉23456789WesternmaidenhairfernCaliforniamaidenhsirfAexnlashippuxastanAretusfaphylinswuvsaxtMyrtle-leafedDistyli表B.1(續(xù))EuonywusbirufsrkucFrangalucallforuku(=RhaFringalaparkiama(=RheSalal,OregonwinterHuwuwrlisintrrmediu(H,mol日本毛木蘭Muianthewuwracemosnm(=Sm表B.1(續(xù))Rublebeoch,SouthernbOsmuarhwsderru(-PhiOomuarheshereraph日本常綠標(biāo)Rog(sperifiecultivHybridrose,Rayalbon