隱地疫霉菌檢疫鑒定方法

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了進(jìn)出境植物檢疫中隱地疫霉菌的檢疫和鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于進(jìn)出境植物及介質(zhì)土中隱地疫霉菌的檢疫和鑒定。2.1分類地位隱地疫霉菌(PhytophthoracryptogeaPethybridge&.Lafferty)屬藻菌界(Chromista),(Oomyeota),腐霉目(Pythiales),腐霉科(Pythiaceae),疫霉屬(Phytophthora)。2.2檢疫原理隱地疫霉菌的寄主植物很廣，為害上百種經(jīng)濟(jì)作物，是非淵菊、翠菊、麝香石竹、圣誕花、番茄等植物的重要病原菌(參見附錄A)。主要以抗逆性很強(qiáng)的卵孢子在介質(zhì)土中及寄主殘體內(nèi)越冬并長期生存，當(dāng)田間溫度和濕度適宜時，卵孢子打破休眠萌發(fā)，產(chǎn)生孢子囊。孢子囊在雨后或灌溉后有積水時，根快釋放出大量游動孢子，最終通過幼根或傷口侵入寄主，可造成根、莖部腐爛，致使植物受侵染后葉片迅速萎鳶枯死，2.3鑒定依據(jù)隱地疫霉菌在寄主植物上的癥狀，病原菌形態(tài)學(xué)特征、生物學(xué)特征是鑒定該菌的依據(jù)。3儀器設(shè)備及實驗用具3.1儀器設(shè)備生物顯微鏡、體視顯微鏡、高壓滅菌器、干熱滅菌器、普通天平、分析天平、超凈工作臺、生物培養(yǎng)箱。3.2實驗用具(carbendaxim)、硝酸鈣[Ca(NO,),].磷酸二氧鉀(KH?PO?),硝酸鎂[Mg(NO):].氯化鈣(CaCl),利福平(rifampirin)、碳酸鈣(CaCO.)、無水乙醇(ethanel)。5培養(yǎng)基5.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基用于隱地疫毒菌的保存和培養(yǎng)性狀的觀察，測定。采用胡蘿卜培養(yǎng)基(CA),V,培養(yǎng)基(V?A)或利馬豆培養(yǎng)基(LBA),其配制方法及步驟見第B.1章。5.2選擇性培養(yǎng)基用于隱地疫霉菌游動孢子的萌發(fā)，病原菌的分離和純化。1000mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基經(jīng)常規(guī)滅菌并冷卻到55℃左右時加入下列抗菌素(均為有效成分);氨下青霉素50mg,利福平20mg、多菌靈25mg、五氯硝基苯25mg,據(jù)勻，制成平皿。在缺乏五氯硝基苯時可用相同藥量的苯來特替代。邊緣明顯，在無菌水或皮氏培養(yǎng)液中，可產(chǎn)生少量的孢子囊，加入葉則誘導(dǎo)大量孢子囊產(chǎn)生。7.2形態(tài)特征7.2.1菌絲和菌絲體在CA培養(yǎng)基上，菌絲體大量產(chǎn)生。菌絲無色無隔、粗細(xì)均勻；粗4ym～6.5pm,可產(chǎn)生球形、角形或不規(guī)則形菌絲膨大體，串生或交織成網(wǎng)狀。7.2.2無性生殖階段特征(參見附錄C)在皮氏培養(yǎng)液中，孢囊梗直接來源于菌絲，不分枝，粗3.0μm～6μm。孢子囊橢圓形，罕卵形，有時中部縊縮，(34gm～64pm)×(17pm～36pm),平均46.4pm×27,8μm,長寬比值為1.4～2.2,平均1.66,頂部平展，無乳突，排抱孔寬10pm～17pm,不脫落，內(nèi)部層出3次～6次。游動抱子囊在冷涼條件下釋放游動泡子，游動孢子腎形，(10μm～13pm)×(8pm～10gm),鞭毛長21pm～34μm,體止孢子球形，直徑8μm~13μm。厚垣抱子未見。7.2.3有性生殖階段特征(參見附錄C)有性繁殖為異宗配合。藏卵器球形，壁薄，褐色，21μm～31pm,柄棍樺狀或圓錐狀；維器球形或圓簡形，圍生，(10pm～15pm)×(7pm~18μm),具1個~2個細(xì)胞。卵抱子球形，直徑17pm~27pm,7.3菌絲最高溫度測定從新鮮培養(yǎng)的菌落邊緣挑取直徑2mm左右的菌絲塊，移至基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上，菌絲塊等距離接種于培養(yǎng)皿周緣，每培養(yǎng)皿(直徑9cm)4塊～6塊，置于35℃培養(yǎng)，設(shè)三個重復(fù)，5d后測量菌落直徑。隱地疫毒菌絲在35℃不能生長。7.4致病性試驗接種15d內(nèi)，非洲菊出現(xiàn)典型的萎海癥狀，番茄猝倒死亡，而黃瓜，西瓜不發(fā)病。必要時，在病健交界處但遠(yuǎn)離接種點(diǎn)的部位，切取數(shù)段發(fā)病植株的莖桿，直接放在選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)，觀察分離到菌株的形態(tài)特征(參見7.2)。7.5隱地疲霉菌與其近似種的主要區(qū)別隱地疫霉菌與其近似種據(jù)代疫霉菌的主要區(qū)別參見附錄D。8結(jié)果評定以隱地疫霉菌在非洲菊上產(chǎn)生的癥狀，分離物的培養(yǎng)特征，無性及有性階段特征，致病性特征及菌絲生長最高溫度等作為鑒定依據(jù)，進(jìn)行綜合判定。若以上特征與第7章鑒定特征吻合，則鑒定為隱地疫霉菌。9菌株保存隱地疫毒的菌株應(yīng)移到試管斜面上，經(jīng)登記后量于10℃~15℃黑暗條件下保存，并定期(每3個月)轉(zhuǎn)管，防止因斜面干燥面造成病原菌死亡。菌襪至少保存6個月，保存期滿后，需經(jīng)滅菌處理。(資料性附錄)隱地疫霉菌的寄主與地理分布隱地疫霉菌的寄主范圍很廣，寄主包括23科近百種植物，其中主要的經(jīng)濟(jì)作物有：非淵菊(Gerbera(MatthiolaincanaR.Br.)、雪蘭(FreesiarefractaKlatt.),瓜葉菊(CinerariacrwentaMasson),矮牽牛(PetwniahybridaVilm.)、圣誕花(EuporbiapulcherrimaWilld.)、麒麟(CarthamustinctariusLL),冷杉(AbiesfabriCraih),山松(PimusmuntecamaeLamb,)等。A.2地理分布大洋州：澳大利亞、新西蘭。俄羅斯。(資料性附錄)培養(yǎng)基及配制方法B.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基B.1.1胡蘿卜培養(yǎng)基(CA)將200g新鮮胡蘿卜切成小片，加去離子水500ml.,用組織搗碎機(jī)搗碎約40s,用4層紗布過能去渣，補(bǔ)足水至1000mL,加入瓊脂粉15g～20g,121℃高壓蒸汽滅菌15min~20min。5mLV;計加去離子水90mL,碳酸鈣0.02g,瓊脂粉2g,補(bǔ)足水至100mL。121℃高壓燕汽滅菌B.1.3剩馬豆培養(yǎng)基(LBA)干利馬豆粉60g,瓊脂粉20g,蒸餾水1000mL.。利馬豆粉60g加水1000mL,在60℃下水浴1h,雙層紗布過濾去渣。上清液補(bǔ)足水至1000mL,加入瓊脂粉20g,煮沸后持續(xù)沸騰數(shù)分鐘。121℃高壓燕汽滅菌15min~20min。B.2皮氏(Petri)培養(yǎng)液在121℃下高壓蒸汽滅菌15min~20min。(資料性附錄)隱地疫霉的形態(tài)特征圖圖C.1隱地疫霉的形態(tài)特征圖(仿余永年，1998)(資料性附錄)隱地疫霉及近似種的主要區(qū)別大于35℃仍可生長。最高達(dá)36℃~37℃。