一種溫度敏感型肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料及其制備方法

一種溫度敏感型肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料及其制備方法專利名稱：一種溫度敏感型肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明涉及一種智能型組織工程支架材料及技術(shù)，特別涉及一種溫度敏感型肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料以及方法技術(shù)。背景技術(shù)：我國是肝病的高發(fā)區(qū)，其中重型肝炎/肝衰竭是病情最重、死亡率最高的肝臟疾病之一。治療重型肝炎/肝衰竭的三種常用方法為內(nèi)科治療、肝移植和人工代用品治療。由于肝供體的缺乏及手術(shù)費(fèi)用的昂貴，在我國肝移植難以得到普遍應(yīng)用，而人工代用品由于不能完全替代人體器官的所有功能，不能根據(jù)人體自身要求進(jìn)行相應(yīng)的自動調(diào)節(jié)，所以不能治愈疾病，只能暫時(shí)緩解癥狀或者短期延續(xù)病人的生命。組織工程概念的提出，為解決這一難題提供了寶貴的理論依據(jù)。組織工程學(xué)的方法是將特定的組織細(xì)胞“種植”于一種生物相容性良好、可被人體逐步降解吸收的生物材料(組織工程材料)上，形成細(xì)胞-生物材料復(fù)合物；生物材料為細(xì)胞的增長繁殖提供三維空間和營養(yǎng)代謝環(huán)境；隨著材料的降解和細(xì)胞的繁殖，形成新的具有與自身功能和形態(tài)相應(yīng)的組織或器官；這種具有生命力的活體組織或器官能對病損組織或器官進(jìn)行結(jié)構(gòu)、形態(tài)和功能的重建，并達(dá)到永久替代。其中生物材料在組織工程中占據(jù)非常重要的地位，它不僅影響細(xì)胞的生物學(xué)行為和培養(yǎng)效率，而且還決定著移植后能否與機(jī)體很好的適應(yīng)、結(jié)合和修復(fù)，是限制組織工程能否真正應(yīng)用于臨床的一個(gè)關(guān)鍵因素。目前組織工程支架材料有兩類一類是天然基質(zhì)材料，如膠原、纖維連接蛋白、層連蛋白、透明質(zhì)酸、海藻酸鹽、殼聚糖等，它們均具有較好的生物相容性，但所形成的支架材料穩(wěn)定性和機(jī)械性能較差；一類是合成高分子聚合物，如聚ε"己內(nèi)酯乙烷基乙烯基磷酸鹽共聚物(PCLEEP)、聚乙酰內(nèi)酯(PVLA)、聚乳酸一羥基乙酸共聚物(PLGA)等，它們具有良好的力學(xué)性能和生物降解性能，但在生物相容性方面仍有一定的缺陷。為了解決以上材料問題，當(dāng)前的研究多采用復(fù)合修飾和改性的方法，用于揚(yáng)長避短，以獲得一種良好的生物材料。如馬祖?zhèn)?，高長友等發(fā)表的文章1型膠原在聚-L-乳酸(PLLA)表面的化學(xué)接枝和涂層及其對軟骨細(xì)胞生長的促進(jìn)作用；雜志為.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)(2004，25(4):749-752)。采用接枝一涂層技術(shù)，在聚-L-乳酸(PLLA)膜表面接枝聚甲基丙烯酸(PMAA)，利用水溶性碳化二亞胺作為縮合劑，使表面的羧基和膠原分子中的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，從而將I型膠原接枝在PLLA表面，并對軟骨細(xì)胞在其表面的生長行為進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，改性表面有效地提高了細(xì)胞在材料表面的粘附、增殖和鋪展。浦鳴，計(jì)劍等發(fā)表的文章反應(yīng)性梳狀聚乙二醇改性聚酯薄膜表面及其內(nèi)皮細(xì)胞相容性的研究。雜志為高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)(2006，27(5):951-955)。將高密度梳狀PEG(CPEG)端羥基轉(zhuǎn)化為反應(yīng)活性較高的醛基，通過表面接枝方法對氨基化的聚酯膜進(jìn)行表面改性，用整合素配體多肽片段(RGD)和氨基酸修飾CPEG，獲得了細(xì)胞相容性優(yōu)良的功能化仿生表面。半乳糖由于具有與肝細(xì)胞表面去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)進(jìn)行特異性結(jié)合的功能，多被引入材料以增加肝細(xì)胞的粘附率。Inn-kyuKang等發(fā)表的文章Graftingoflactose-carringstyreneontopolystyrenedishesusingplasmaglowdischargeandtheirinteractionwithhepatocytes.雜志為J.Mater.Sci.:Mater.M(2003,14:611-616)通過輝光放電等離子體方法將半乳糖基苯乙烯類化合物(VLA)接枝到聚苯乙烯板表面，并對肝細(xì)胞在此載體表面的培養(yǎng)情況作了研究。Yoon等發(fā)表的文章Surfaceimmobilizationofgalactoseontoaliphaticbiodegradablepolymersforhepatocyteculture.雜志為BiotechnolBioeng(2002，78:1_10)將半乳糖引入聚乳酸乙醇酸(PLGA)膜，將之用于肝細(xì)胞培養(yǎng)研究，結(jié)果表明，隨膜表面半乳糖濃度的增加，肝細(xì)胞的吸附能力和活性增強(qiáng)οHigashiyama等發(fā)表的文章:Mixed-ligandmodificationofpolyamidoaminedendrimerstodevelopaneffectivescaffoldformaintenanceofhepatocytespheroids.雜志為J.Biomed.Mater.Res(2003,64A475-82)將果糖和半乳糖的復(fù)合配體修飾到聚苯乙烯表面，制備了能保持肝細(xì)胞球形結(jié)構(gòu)的改性表面°卓仁禱等發(fā)表了文章Immobilizationofgalactoseligandsonacrylicacidgraft-copolymerizedpoly(ethyleneterephthalate)filmanditsapplicationtohepatocyteculture.雜志為Biomacromolecules(2003，4:157-165)將半乳糖修飾到PET表面，研究了肝細(xì)胞在此改性表面的吸附能力和細(xì)胞功能等。關(guān)于肝組織工程支架材料方面雖然取得很多有意義的研究成果，但按照傳統(tǒng)的組織工程方法，當(dāng)細(xì)胞在體外培養(yǎng)擴(kuò)增后形成細(xì)胞片層或組織，要連同支架材料一起移植入主體，這樣會引起很多復(fù)雜的問題(1)支架材料在體內(nèi)降解后，其先前所占據(jù)的空間會被細(xì)胞外基質(zhì)充滿，從而使細(xì)胞不能緊密聚集，肝臟是一種細(xì)胞緊密聚集的器官，這樣就使移植入主體的細(xì)胞在體內(nèi)的生長不能很好的模擬本體組織；(2)對于較大的結(jié)構(gòu)，在支架材料周圍，移植細(xì)胞會健康成長且與本體組織很相似，但由于是被動傳輸，營養(yǎng)物質(zhì)的輸送和代謝廢物的排出較慢，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)中心部位的細(xì)胞活性喪失，從而形成一個(gè)壞死的中心；(3)一些支架材料，如聚乳酸(PLA)、甲殼素等的降解產(chǎn)物的酸堿會對細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性；(4)一些支架材料，如聚乳酸(PLA)、聚乙酸醇(PGA)等，降解成小分子碎片，會引起主體內(nèi)巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞的聚集，這些免疫細(xì)胞也會吞噬植入細(xì)胞。OkanoΤ.,etal..Biomaterials,2005,26=415-6422.這些問題的存在，大大限制了組織工程的發(fā)展。高分子材料表面改性方法包括化學(xué)法、輻射接枝法、等離子體方法、紫外光固定法，其中化學(xué)法接枝工藝復(fù)雜，試劑浪費(fèi)大，有的試劑還有毒，而且反應(yīng)時(shí)間長；輻射接枝法會將放射性引入反應(yīng)體系；等離子體方法需要真空、高溫條件，需要設(shè)備復(fù)雜，投資成本高。采用紫外光固定法對高聚物表面接枝改性的研究很多，但大多為對聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、滌綸(PET)等的改性，如李斌，周曉工等的文章聚丙烯表面接枝PNIPAAm膜I.光接枝反應(yīng)和表面形態(tài)結(jié)構(gòu)研究，雜志為高分子學(xué)報(bào)(2002,6:780-785)。通過紫外光照射法在聚丙烯薄膜上接枝PNIPAAm，研究了不同反應(yīng)條件對接枝反應(yīng)的影響。金朝鋒申屠寶卿等的文章高密度聚乙烯表面光接枝丙烯酸行為研究，雜志為化學(xué)反應(yīng)工程與工藝(2004，20(2)146-150)，通過紫外光照，在高密度聚乙烯表面接枝丙烯酸，研究了光照時(shí)間、單體濃度、光敏劑濃度等因素對其接枝率和接枝效率的影響。而以紫外光固定法將異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)接枝到聚苯乙烯表面，且用于組織工程，幾乎未見報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種溫敏型肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料及其制備方法。本發(fā)明的溫敏型肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料，含有N-異丙基丙烯酰胺，在聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板上接枝N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和丙烯酸(AAc)，丙烯酸的羧基通過縮合連接胺基乳糖酸(L-NH2)的胺基。本發(fā)明溫敏型肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料具有如下特性37°C時(shí)表面相對疏水，適于細(xì)胞黏附/鋪展和增殖，但在32°C下呈現(xiàn)親水性，細(xì)胞自動從表面脫附。本發(fā)明的溫敏型肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料，以紫外光固定化法在聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板上接枝N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和丙烯酸(AAc)，然后以Sulf0-NHS(N-羥基硫代琥珀酰亞胺)和EDOHCL(l-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽)為活化劑和羧合劑，使胺基乳糖酸(L-NH2)的胺基與丙烯酸的羧基發(fā)生縮合作用，將具有肝細(xì)胞特異結(jié)合作用的L-NH2鍵合到聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板表面。本發(fā)明溫敏型肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料制備方法包括以下步驟(1)表面清洗將聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板(TCPS)用無水乙醇沖洗，蒸餾水沖洗數(shù)遍，55-65°C真空干燥備用。(2)TCPS表面的溫敏羧基化修飾將N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和丙烯酸(AAc)溶于二甲基亞砜(DMSO)，再加入蒽醌-2-磺酸鈉(AQS)做光敏劑，滴入幾滴異丙醇。將處理好的TCPS樣品放入上述反應(yīng)液中，通N215分鐘密封，高壓汞燈處理，然后依次以無水乙醇、蒸餾水沖洗接枝樣品，真空干燥ld，得TCPS溫敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。(3)制備胺基乳糖酸(L-NH2)將乳糖酸(LA)和乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分別溶于二甲基亞砜(DMSO)中，溫度為7080°C反應(yīng)24h，將混合物溶液傾入氯仿中沉析，然后將產(chǎn)物胺基乳糖酸真空干燥。(4)TCPS表面的糖化修飾將胺基乳糖酸(L-NH2)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)溶于pH=6.09.4的磷酸鹽緩沖溶液；將TCPS-NIPA-AAc樣品放入其中，置于搖床上室溫下震蕩13d，每天向反應(yīng)體系加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHCL)；以大量蒸餾水浸泡洗滌，真空干燥，得目標(biāo)肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料。所述步驟(1)中聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板(TCPS)為IcmXIcm或其他規(guī)格的表面積；所述步驟(2)中N-異丙基丙烯酰胺與丙烯酸摩爾比為10.1l，NIPAAm和丙烯酸在DMSO中的混合濃度為1020wt%；所述步驟(2)中蒽醌-2-磺酸鈉與N-異丙基丙烯酰胺的摩爾比為0.11；所述步驟(2)中高壓汞燈處理?xiàng)l件為所述高壓汞燈λ=360nm，功率為200W1000W,照射0.5h4.5h，高壓汞燈距離樣品3040cm，反應(yīng)液深度為12cm；所述步驟(2)中無水乙醇、蒸餾水沖洗接枝樣品，用以除去未反應(yīng)的小分子和沒有修飾上的聚合物；所述步驟(3)中乳糖酸和乙二胺質(zhì)量比為146，乳糖酸和乙二胺在DMSO中混合濃度為0.5lg/ml；所述步驟(4)中將胺基乳糖酸與N-羥基硫代琥珀酰亞胺質(zhì)量比為11，胺基乳糖酸與N-羥基硫代琥珀酰亞胺混合溶液濃度為0.5mg/ml2mg/ml。5所述步驟(4)中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC-HCL)每天添加濃度為1030mg/ml。有益效果本發(fā)明利用溫度敏感性材料N-異丙基丙烯酰胺(OTPAAm)的溫度響應(yīng)性，得到完整的細(xì)胞片層或組織，將細(xì)胞片層或組織植入體內(nèi)，不必將支架材料一同植入體內(nèi)，這樣就可以避免主體對支架材料性能的限制。OTPAAm的化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)，其水溶液的最低臨界溫度(Lowercriticalsolutiontemperature，LCST)為32°C。當(dāng)溫度低于32°C時(shí)，PNIPAAm高分子鏈伸展，親水基團(tuán)暴露，表現(xiàn)親水性；當(dāng)溫度高于32°C時(shí)，PNIPAAm高分子鏈?zhǔn)湛s，疏水基團(tuán)暴露，表現(xiàn)疏水性。將POTPAAm修飾到聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板(TCPS)表面，37°C時(shí)表面相對疏水，適于細(xì)胞黏附/鋪展和增殖，但在32°C下呈現(xiàn)親水性，細(xì)胞自動從表面脫附，用此溫度響應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)板可回收溶合細(xì)胞片層，不影響細(xì)胞與細(xì)胞間的連接和沉積，避免了傳統(tǒng)酶解法對細(xì)胞功能造成的損傷，得到了完整的細(xì)胞片層，此二維細(xì)胞片層可直接轉(zhuǎn)移至受損部位，無需將材料植入主體，這樣就避免了對支架材料免疫學(xué)等方面的要求。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的溫敏型肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料具有良好的綜合性能，一方面由于L-NH2中存在半乳糖基，半乳糖具有與肝細(xì)胞表面去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)進(jìn)行特異性結(jié)合的功能，它的引入增強(qiáng)了肝細(xì)胞在材料表面的吸附力，從而促進(jìn)肝細(xì)胞在材料表面的增殖分化；另一方面，溫敏性材料NIPAAm的引入，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞脫附智能化，通過控制環(huán)境溫度，達(dá)到了細(xì)胞的自然脫附，可以得到完整的細(xì)胞片層，避免了傳統(tǒng)酶解法對細(xì)胞功能造成的損傷，同時(shí)由于可將得到的細(xì)胞片層直接植入主體，不必連同支架材料植入主體，從而避免了支架材料必須可生物降解以及主體對材料的免疫學(xué)等方面的限制。由于所述的良好綜合特性，本發(fā)明溫敏型肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料在組織工程支架材料、細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)材料等方面可以得到廣泛應(yīng)用。本發(fā)明通過紫外光照射方法對TCPS進(jìn)行溫敏改性，以蒽醌-2-磺酸鈉(AQS)作光敏劑，AQS吸收光能后，成為激發(fā)態(tài)分子，它可以奪取TCPS大分子鏈上的氫，產(chǎn)生大分子自由基，大分子自由基攻擊不飽和單體NIPAAm(N-異丙基丙烯酰胺)和AAc，引發(fā)接枝聚合.AAc通過紫外光照接枝到TCPS表面，使其表面產(chǎn)生羧基，然后以Sulfo-NHS(N-羥基硫代琥珀酰亞胺)和EDC·Ηα(1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽)作活化劑和羧合劑，與L-NH2的胺基反應(yīng)，得糖化溫敏改性表面。選擇乳糖酸作為引入半乳糖基配體是因?yàn)槿樘撬岢杀竞侠?，毒性低，生物相容性良好；將丙烯酸作為含羧基成分引入，以便完成表面的糖化改性，是因?yàn)楸┧嵩诠庖l(fā)條件下容易形成自由基，可促進(jìn)光化反應(yīng)的進(jìn)行，且成本低廉，屬于常規(guī)藥品，反應(yīng)殘余物容易去除。本發(fā)明將與肝細(xì)胞具有特異結(jié)合性的半乳糖與OTPAAm共同修飾到TCPS表面，增強(qiáng)支架材料的生物相容性和細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)，增加細(xì)胞在材料表面的吸附率，得到一種新型適用于肝組織工程的智能型支架材料。紫外光接枝方法采用高壓汞燈或石英汞燈作為引發(fā)源，不需要特殊設(shè)備，投資成本低，工藝方法簡單，技術(shù)要求不太苛刻，反應(yīng)易于控制，可操作性強(qiáng)，適用范圍廣、安全，易在工業(yè)生產(chǎn)中普及應(yīng)用。具體實(shí)施例方式以下給出本發(fā)明的具體實(shí)施例，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制.實(shí)施例1(1)表面清洗將切割成IcmXIcm的聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板(TCPS)樣品，用無水乙醇沖洗，除去表面的雜質(zhì)，再用蒸餾水沖洗數(shù)遍，60°C真空干燥備用。(2)TCPS表面的溫敏羧基化修飾將0.OlmolN-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和0.Olmol丙烯酸(AAc)溶于6.8mL二甲基亞砜(DMSO)，再加入0.OOlmol蒽醌-2-磺酸鈉(AQS)做光敏劑，滴入幾滴異丙醇。將處理好的TCPS樣品放入所述反應(yīng)液中，通N215min密封，以高壓汞燈(λ=360nm,IOOOW)照射0.5h，高壓汞燈距離樣品40cm，反應(yīng)液深度為Icm.光照接枝完畢后，以無水乙醇、蒸餾水沖洗接枝樣品，以除去未反應(yīng)的小分子和沒有修飾上的聚合物，然后真空干燥ld，得TCPS溫敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。(3)制備胺基乳糖酸(L-NH2)將2g乳糖酸(LA)和IOg乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分別溶于20ml二甲基亞砜(DMSO)中，在溫度為70°C時(shí)反應(yīng)2h，將混合物溶液傾入氯仿中沉析，然后將產(chǎn)物L(fēng)-NH2真空干燥。(4)TCPS表面的糖化修飾將3mgL-NHdP3mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulf0-NHS)溶于pH=8.0的3mL磷酸鹽緩沖溶液，將TCPS-NIPA-Mc樣品放入其中，置于搖床上室溫下震蕩3d，每天向反應(yīng)體系加入30mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC-HCL)。反應(yīng)完畢，以大量蒸餾水浸泡洗滌，真空干燥，得目標(biāo)肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料。實(shí)施例2(1)表面清洗同實(shí)例1(1)。(2)TCPS表面的溫敏羧基化修飾將0.OlmolN-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和0.OOlmol丙烯酸(AAc)溶于6.8mL二甲基亞砜(DMSO)，再加入0.OOlmol蒽醌-2-磺酸鈉(AQS)做光敏劑，滴入幾滴異丙醇。將處理好的TCPS樣品放入所述反應(yīng)液中，通N215min密封，以高壓汞燈(λ=360nm,IOOOW)照射3h，高壓汞燈距離樣品40cm，反應(yīng)液深度為Icm.光照接枝完畢后，以無水乙醇、蒸餾水沖洗接枝樣品，以除去未反應(yīng)的小分子和沒有修飾上的聚合物，然后真空干燥ld，得TCPS溫敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。(3)制備胺基乳糖酸(L-NH2)將3g乳糖酸(LA)和18g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分別溶于30ml二甲基亞砜(DMSO)中，在溫度為80°C時(shí)反應(yīng)4h，將混合物溶液傾入氯仿中沉析，然后將產(chǎn)物L(fēng)-NH2真空干燥。(4)TCPS表面的糖化修飾將3mgL-NH2和3mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)溶于pH=9.4的3mL磷酸鹽緩沖溶液，將TCPS-NIPA-AAc樣品放入其中，置于搖床上室溫下震蕩3d，每天向反應(yīng)體系加入60mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCL)。反應(yīng)完畢，以大量蒸餾水浸泡洗滌，真空干燥，得目標(biāo)肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料。實(shí)施例3(1)表面清洗同實(shí)例1(1)。(2)TCPS表面的溫敏羧基化修飾將0.OlmolN-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和0.005mol丙烯酸(AAc)溶于6.8mL二甲基亞砜(DMSO)，再加入0.OOlmol蒽醌-2-磺酸鈉(AQS)做光敏劑，滴入幾滴異丙醇。將處理好的TCPS樣品放入所述反應(yīng)液中，通N215min密封，以高壓汞燈(λ=360nm,1000W)照射0.5h，高壓汞燈距離樣品40cm，反應(yīng)液深度為Icm.光照接枝完畢后，以無水乙醇、蒸餾水沖洗接枝樣品，以除去未反應(yīng)的小分子和沒有修飾上的聚合物，然后真空干燥ld，得TCPS溫敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。(3)制備胺基乳糖酸(L-NH2)將2g乳糖酸(LA)和8g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分別溶于20ml二甲基亞砜(DMSO)中，在溫度為70°C時(shí)反應(yīng)4h，將混合物溶液傾入氯仿中沉析，然后將產(chǎn)物L(fēng)-NH2真空干燥。(4)TCPS表面的糖化修飾將ImgL-NH2和ImgN-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)溶于pH=6.O的2mL磷酸鹽緩沖溶液，將TCPS-NIPA-AAc樣品放入其中，置于搖床上室溫下震蕩3d，每天向反應(yīng)體系加入20mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCL)。反應(yīng)完畢，以大量蒸餾水浸泡洗滌，真空干燥，得目標(biāo)肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料。實(shí)施例4(1)表面清洗同實(shí)例1(1)。(2)TCPS表面的溫敏羧基化修飾將0.0ImoIN-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和0.Olmol丙烯酸(AAc)溶于13.6mL二甲基亞砜(DMSO)，，再加入0.OOlmol蒽醌-2-磺酸鈉(AQS)做光敏劑，滴入幾滴異丙醇。將處理好的TCPS樣品放入所述反應(yīng)液中，通N215min密封，以高壓汞燈(λ=360nm,IOOOW)照射3h，高壓汞燈距離樣品40cm，反應(yīng)液深度為Icm.光照接枝完畢后，以無水乙醇、蒸餾水沖洗接枝樣品，以除去未反應(yīng)的小分子和沒有修飾上的聚合物，然后真空干燥ld，得TCPS溫敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。(3)制備胺基乳糖酸(L-NH2)將2g乳糖酸(LA)和8g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分別溶于20ml二甲基亞砜(DMSO)中，在溫度為80°C時(shí)反應(yīng)2h，將混合物溶液傾入氯仿中沉析，然后將產(chǎn)物L(fēng)-NH2真空干燥。(4)TCPS表面的糖化修飾將ImgL-NH2和ImgN-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)溶于pH=8.O的2mL磷酸鹽緩沖溶液，將TCPS-NIPA-AAc樣品放入其中，置于搖床上室溫下震蕩3d，每天向反應(yīng)體系加入30mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCL)。反應(yīng)完畢，以大量蒸餾水浸泡洗滌，真空干燥，得目標(biāo)肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料。實(shí)施例5(1)表面清洗同實(shí)例1(1)。(2)TCPS表面的溫敏羧基化修飾將0.OlmolN-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和0.OOlmol丙烯酸(AAc)溶于13.6mL二甲基亞砜(DMSO)，再加入0.OOlmol蒽醌-2-磺酸鈉(AQS)做光敏劑，滴入幾滴異丙醇。將處理好的TCPS樣品放入所述反應(yīng)液中，通N215min密封，以高壓汞燈(λ=360nm,200W)照射4.5h，高壓汞燈距離樣品40cm，反應(yīng)液深度為Icm.光照接枝完畢后，以無水乙醇、蒸餾水沖洗接枝樣品，以除去未反應(yīng)的小分子和沒有修飾上的聚合物，然后真空干燥ld，得TCPS溫敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。(3)制備胺基乳糖酸(L-NH2)將3g乳糖酸(LA)和15g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分別溶于30ml二甲基亞砜(DMSO)中，在溫度為80°C時(shí)反應(yīng)2h，將混合物溶液傾入氯仿中沉析，然后將產(chǎn)物L(fēng)-NH2真空干燥。(4)TCPS表面的糖化修飾將2mgL-NH2和2mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)溶于pH=7.4的ImL磷酸鹽緩沖溶液，將TCPS-NIPA-AAc樣品放入其中，置于搖床上室溫下震蕩3d，每天向反應(yīng)體系加入30mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCL)。反應(yīng)完畢，以大量蒸餾水浸泡洗滌，真空干燥，得目標(biāo)肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料。實(shí)施例6(1)表面清洗同實(shí)例1(1)。(2)TCPS表面的溫敏羧基化修飾將0.OlmolN-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和0.005mol丙烯酸(AAc)溶于13.6mL二甲基亞砜(DMSO)，再加入0.OOlmol蒽醌-2-磺酸鈉(AQS)做光敏劑，滴入幾滴異丙醇。將處理好的TCPS樣品放入所述反應(yīng)液中，通N215min密封，以高壓汞燈(λ=360nm,200W)照射4.5h，高壓汞燈距離樣品40cm，反應(yīng)液深度為Icm.光照接枝完畢后，以無水乙醇、蒸餾水沖洗接枝樣品，以除去未反應(yīng)的小分子和沒有修飾上的聚合物，然后真空干燥ld，得TCPS溫敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。(3)制備胺基乳糖酸(L-NH2)將3g乳糖酸(LA)和12g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分別溶于30ml二甲基亞砜(DMSO)中，在溫度為70°C時(shí)反應(yīng)4h，將混合物溶液傾入氯仿中沉析，然后將產(chǎn)物L(fēng)-NH2真空干燥。(4)TCPS表面的糖化修飾將2mgL-NH2和2mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)溶于pH=9.4的ImL磷酸鹽緩沖溶液，將TCPS-NIPA-AAc樣品放入其中，置于搖床上室溫下震蕩3d，每天向反應(yīng)體系加入20mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCL)。反應(yīng)完畢，以大量蒸餾水浸泡洗滌，真空干燥，得目標(biāo)肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料。實(shí)施例7(1)表面清洗同實(shí)例1(1)。(2)TCPS表面的溫敏羧基化修飾將0.OlmolN-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和0.Olmol丙烯酸(AAc)溶于6.8mL二甲基亞砜(DMSO)，再加入0.OOlmol蒽醌-2-磺酸鈉(AQS)做光敏劑，滴入幾滴異丙醇。將處理好的TCPS樣品放入所述反應(yīng)液中，通N215min密封，以高壓汞燈(λ=360nm,IOOOW)照射4.5h，高壓汞燈距離樣品40cm，反應(yīng)液深度為Icm.光照接枝完畢后，以無水乙醇、蒸餾水沖洗接枝樣品，以除去未反應(yīng)的小分子和沒有修飾上的聚合物，然后真空干燥ld，得TCPS溫敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。(3)制備胺基乳糖酸(L-NH2)將2g乳糖酸(LA)和12g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分別溶于20ml二甲基亞砜(DMSO)中，在溫度為70°C時(shí)反應(yīng)2h，將混合物溶液傾入氯仿中沉析，然后將產(chǎn)物L(fēng)-NH2真空干燥。(4)TCPS表面的糖化修飾將3mgL-NH2和3mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)溶于pH=7.4的3mL磷酸鹽緩沖溶液，將TCPS-NIPA-AAc樣品放入其中，置于搖床上室溫下震蕩ld，每天向反應(yīng)體系加入30mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCL)。反應(yīng)完畢，以大量蒸餾水浸泡洗滌，真空干燥，得目標(biāo)肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料。實(shí)施例8(1)表面清洗同實(shí)例1(1)。(2)TCPS表面的溫敏羧基化修飾將0.OlmolN-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和0.OOlmol丙烯酸(AAc)溶于13.6mL二甲基亞砜(DMSO)，再加入0.OOlmol蒽醌-2-磺酸鈉(AQS)做光敏劑，滴入幾滴異丙醇。將處理好的TCPS樣品放入所述反應(yīng)液中，通N215min密封，以高壓汞燈(λ=360nm,IOOOW)照射0.5h，高壓汞燈距離樣品40cm，反應(yīng)液深度為Icm.光照接枝完畢后，以無水乙醇、蒸餾水沖洗接枝樣品，以除去未反應(yīng)的小分子和沒有修飾上的聚合物，然后真空干燥ld，得TCPS溫敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。(3)制備胺基乳糖酸(L-NH2)將3g乳糖酸(LA)和18g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分別溶于30ml二甲基亞砜(DMSO)中，在溫度為70°C時(shí)反應(yīng)2h，將混合物溶液傾入氯仿中沉析，然后將產(chǎn)物L(fēng)-NH2真空干燥。(4)TCPS表面的糖化修飾將ImgL-NH2和ImgN-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)溶于pH=8.0的2mL磷酸鹽緩沖溶液，將TCPS-NIPA-AAc樣品放入其中，置于搖床上室溫下震蕩ld，每天向反應(yīng)體系加入30mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCL)。反應(yīng)完畢，以大量蒸餾水浸泡洗滌，真空干燥，得目標(biāo)肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料。實(shí)施例9(1)表面清洗同實(shí)例1(1)。(2)TCPS表面的溫敏羧基化修飾將0.OlmolN-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和0.Olmol丙烯酸(AAc)溶于13.6mL二甲基亞砜(DMSO)，再加入0.OOlmol蒽醌-2-磺酸鈉(AQS)做光敏劑，滴入幾滴異丙醇。將處理好的TCPS樣品放入所述反應(yīng)液中，通N215min密封，以高壓汞燈(λ=360nm,200W)照射0.5h，高壓汞燈距離樣品40cm，反應(yīng)液深度為Icm.光照接枝完畢后，以無水乙醇、蒸餾水沖洗接枝樣品，以除去未反應(yīng)的小分子和沒有修飾上的聚合物，然后真空干燥ld，得TCPS溫敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。(3)制備胺基乳糖酸(L-NH2)將2g乳糖酸(LA)和IOg乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分別溶于20ml二甲基亞砜(DMSO)中，在溫度為80°C時(shí)反應(yīng)4h，將混合物溶液傾入氯仿中沉析，然后將產(chǎn)物L(fēng)-NH2真空干燥。(4)TCPS表面的糖化修飾將2mgL-NH2和2mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)溶于pH=9.4的ImL磷酸鹽緩沖溶液，將TCPS-NIPA-AAc樣品放入其中，置于搖床上室溫下震蕩ld，每天向反應(yīng)體系加入30mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCL)。反應(yīng)完畢，以大量蒸餾水浸泡洗滌，真空干燥，得目標(biāo)肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料。實(shí)施例10(1)表面清洗同實(shí)例1(1)。(2)TCPS表面的溫敏羧基化修飾將0.OlmolN-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和0.OOlmol丙烯酸(AAc)溶于6.8mL二甲基亞砜(DMSO)，再加入0.OOlmol蒽醌-2-磺酸鈉(AQS)做光敏劑，滴入幾滴異丙醇。將處理好的TCPS樣品放入所述反應(yīng)液中，通N215min密封，以高壓汞燈(λ=360nm,200W)照射4.5h，高壓汞燈距離樣品40cm，反應(yīng)液深度為Icm.光照接枝完畢后，以無水乙醇、蒸餾水沖洗接枝樣品，以除去未反應(yīng)的小分子和沒有修飾上的聚合物，然后真空干燥ld，得TCPS溫敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。(3)制備胺基乳糖酸(L-NH2)將3g乳糖酸(LA)和12g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分別溶于30ml二甲基亞砜(DMSO)中，在溫度為80°C時(shí)反應(yīng)4h，將混合物溶液傾入氯仿中沉析，然后將產(chǎn)物L(fēng)-NH2真空干燥。(4)TCPS表面的糖化修飾將ImgL-NH2和ImgN-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)溶于pH=6.O的ImL磷酸鹽緩沖溶液，將TCPS_NIPA_AAc樣品放入其中，置于搖床上室溫下震蕩ld，每天向反應(yīng)體系加入30mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCL)。反應(yīng)完畢，以大量蒸餾水浸泡洗滌，真空干燥，得目標(biāo)肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料。權(quán)利要求一種溫度敏感型肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料，含有N異丙基丙烯酰胺，其特征在于聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板上接枝N異丙基丙烯酰胺和丙烯酸，丙烯酸的羧基通過縮合連接胺基乳糖酸的胺基；所述肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料具有如下特性37℃時(shí)表面相對疏水，適于細(xì)胞