凝膠電泳及分配層析

關(guān)于凝膠電泳及分配層析一概念

分配層析是利用各組分在兩相中分配系數(shù)的不同，而使各組分分離的層析方法。二原理

由于不同溶質(zhì)有不同的分配系數(shù)，移動(dòng)速率不同因此可以達(dá)到分離的效果。分配系數(shù)與溶劑和溶質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，同時(shí)受溫度、壓力等條件的影響，所以不同的物質(zhì)在不同的條件下，其分配系數(shù)各不相同。在層析條件確定后，某溶質(zhì)在確定的層析系統(tǒng)中的分配系數(shù)是一常數(shù)。分配系數(shù)

分配色譜的狹義分配系數(shù)表達(dá)式如下：

K=Cs╱Cm=（Xs/Vs）╱（Xm/Vm）式中Cs代表組分分子在固定相液體中的溶解度，Cm代表組分分子在流動(dòng)相中的溶解度。第2頁,共16頁，2024年2月25日，星期天三過程在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸附一種溶劑為固定相，這種溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上；另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相向流動(dòng)，稱為流動(dòng)相。當(dāng)某溶質(zhì)在流動(dòng)相的帶動(dòng)下流經(jīng)固定相時(shí)，該溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行連續(xù)的動(dòng)態(tài)分配。第3頁,共16頁，2024年2月25日，星期天四應(yīng)用分配層析包括紙層析、薄層層析和分配氣相層析等方法。一紙層析

在紙層析中的流動(dòng)相是指層析液，在毛細(xì)拉力作用下，層析液能不斷由下向上流動(dòng)。固定相是指被吸附在濾紙纖維之間的水分。由于纖維素上的羥基具親水性使這部分水束縛在纖維素周圍，不易擴(kuò)散而成為固定相。在層析過程中，當(dāng)層析液在毛細(xì)拉力作用下，上升流經(jīng)色素濾液細(xì)線時(shí)，濾液細(xì)線上的色素就相繼融入層析液，隨著層析液上升，并發(fā)生在分配，即有一部分色素從層析液分配溶解到固定相中，直到平衡。由于分配系數(shù)的不同，那些分配系數(shù)大的色素分子，隨層析液向上移動(dòng)得快，形成的色素帶集中在濾紙的上部；而分配系數(shù)小的色素分子，隨層析向上移動(dòng)得慢，形成的色素帶集中在濾紙的下面。

第4頁,共16頁，2024年2月25日，星期天

紙層析設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，所需樣品少，分辨能力一般能達(dá)到要求，在實(shí)驗(yàn)室用于各種組分的分離并進(jìn)行定性定量分析。但是其展開時(shí)間長(zhǎng)，分離量小，不適用于大量組分的工業(yè)劃分離生產(chǎn)，而且作為流動(dòng)相的有機(jī)溶劑可能引起酶的變性失活。二薄層層析

薄層層析是將作為固定相支持物均勻的鋪在支持板（一般用玻璃板）上，成為薄層。把樣品點(diǎn)到薄層上，用適宜的溶劑展開，利用各種組分的移動(dòng)距離不同，而使各組分分離。如果支持物是固定吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酰胺等，層析時(shí)是依據(jù)吸附力的不同使組分分離，則稱吸附薄層層析；如果支持物是纖維素、硅藻土等，層析時(shí)主要依據(jù)分配系數(shù)的不同而使組分分離，則稱分配薄層層析。薄層層析的展開時(shí)間段，分辨率比紙層析高10~100倍，既可作分析用分離0.01ug的微量樣品又能做制備用分離500mg甚至更多的樣品，因此薄層可以規(guī)格化制備。然而薄層層析的重現(xiàn)性比紙層析差，對(duì)酶等生物大分子的分離效果不理想。第5頁,共16頁，2024年2月25日，星期天凝膠電泳

概念凝膠電泳（Gelelectrophoresis）

是以凝膠為載體，以電流為驅(qū)動(dòng)，用于分離不同大小、形狀、等電點(diǎn)等分子的技術(shù)。凝膠電泳通常用于分析用途。但也可以作為制備技術(shù)，如在使用質(zhì)譜(MS)、PCR、克隆、DNA測(cè)序、免疫印跡等檢測(cè)之前用于提純分子。

基本原理及過程

第6頁,共16頁，2024年2月25日，星期天瓊脂糖凝膠電泳原理：

瓊脂糖是從瓊脂中提純出來的，主要是由D－半乳糖和3,6脫水L－半乳糖連接而成的一種線性多糖。瓊脂糖凝膠的制作是將干的瓊脂糖懸浮于緩沖液中，通常使用的濃度是1％－3％，加熱煮沸至溶液變?yōu)槌吻澹⑷肽０搴笫覝叵吕鋮s凝聚即成瓊脂糖凝膠。瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)。瓊脂糖之間以分子內(nèi)和分子間氫鍵形成較為穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，這種交聯(lián)的結(jié)構(gòu)使瓊脂糖凝膠有較好的抗對(duì)流性質(zhì)。瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過瓊脂糖的最初濃度來控制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。盡管瓊脂糖本身沒有電荷，但一些糖基可能會(huì)被羧基、甲氧基特別是硫酸根不同程度的取代，使得瓊脂糖凝膠表面帶有一定的電荷，引起電泳過程中發(fā)生電滲以及樣品和凝膠間的靜電相互作用，影響分離效果。

瓊脂糖凝膠可以用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳支持介質(zhì)，尤其適合于核酸的提純、分析。如濃度為1％的瓊脂糖凝膠的孔徑對(duì)于蛋白質(zhì)來說是比較大的，對(duì)蛋白質(zhì)的阻礙作用較小，這時(shí)蛋白質(zhì)分子大小對(duì)電泳遷移率的影響相對(duì)較小，所以適用于一些忽略蛋白質(zhì)大小而只根據(jù)蛋白質(zhì)天然電荷來進(jìn)行分離的電泳技術(shù)，如免疫電泳、平板等電聚焦電泳等。瓊脂糖也適合于DNA、RNA分子的分離、分析，由于DNA、RNA分子通常較大，所以在分離過程中會(huì)存在一定的摩擦阻礙作用，第7頁,共16頁，2024年2月25日，星期天這時(shí)分子的大小會(huì)對(duì)電泳遷移率產(chǎn)生明顯影響。例如對(duì)于雙鏈DNA，電泳遷移率的大小主要與DNA分子大小有關(guān)，而與堿基排列及組成無關(guān)。另外，一些低熔點(diǎn)的瓊脂糖（62C時(shí)熔化，因此其中的樣品如DNA可以重新溶解到溶液中而回收。

由于瓊脂糖凝膠的彈性較差，難以從小管中取出，所以一般瓊脂糖凝膠不適合于管狀電泳，管狀電泳通常采用聚丙烯酰胺凝膠。瓊脂糖凝膠通常是形成水平式板狀凝膠，用于等電聚焦、免疫電泳等蛋白質(zhì)電泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式電泳應(yīng)用得相對(duì)較少。

目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳，其優(yōu)點(diǎn)如下：

1）瓊脂糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。

2）瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大（約占98%~99%），近似自由電泳，樣品擴(kuò)散較自由電流，對(duì)樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。

3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測(cè)及定量測(cè)定。

4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測(cè)定。制成干膜可長(zhǎng)期保存。

第8頁,共16頁，2024年2月25日，星期天操作流程準(zhǔn)備干凈的配膠板和電泳槽

注意DNA酶污染的儀器可能會(huì)降解DNA，造成條帶信號(hào)弱、模糊甚至缺失的現(xiàn)象。選擇電泳方法一般的核酸檢測(cè)只需要瓊脂糖凝膠電泳就可以；如果需要分辨率高的電泳，特別是只有幾個(gè)bp的差別應(yīng)該選擇聚丙烯酰胺凝膠電泳；用普通電泳不合適的巨大DNA鏈應(yīng)該使用脈沖凝膠電泳。注意巨大的DNA鏈用普通電泳可能跑不出膠孔導(dǎo)致缺帶。

正確選擇凝膠濃度對(duì)于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.5～2%之間，低濃度的用來進(jìn)行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進(jìn)行小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質(zhì)量好的瓊脂糖是解決辦法。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現(xiàn)象。

適合的電泳緩沖液

第9頁,共16頁，2024年2月25日，星期天常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳時(shí)使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。

電泳的合適電壓和溫度電泳時(shí)電壓不應(yīng)該超過20V/cm，電泳溫度應(yīng)該低于30℃，對(duì)于巨大的DNA電泳，溫度應(yīng)該低于15℃。注意如果電泳時(shí)電壓和溫度過高，可能導(dǎo)致出現(xiàn)條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。特別是電壓太大可能導(dǎo)致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象

DNA樣品的純度和狀態(tài)是電壓太大可能導(dǎo)致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象DNA樣品的純度和狀態(tài)注意樣品中含鹽量太高和含雜質(zhì)蛋白均可以產(chǎn)生條帶模糊和條帶缺失的現(xiàn)象。乙醇沉淀可以去除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。注意變性的DNA樣品可能導(dǎo)致條帶模糊和缺失，也可能出現(xiàn)不規(guī)則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對(duì)DNA樣品加熱，用20mMNaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性。第10頁,共16頁，2024年2月25日，星期天DNA的上樣

正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。注意太多的DNA上樣量可能導(dǎo)致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導(dǎo)致帶信號(hào)弱甚至缺失。TIANGEN公司DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)每次上樣6ul即可得到清晰均勻的條帶。Marker的選擇

DNA電泳一定要使用DNAMarker或已知大小的正對(duì)照DNA來估計(jì)DNA片段大小。Marker應(yīng)該選擇在目標(biāo)片段大小附近ladder較密的，這樣對(duì)目標(biāo)片段大小的估計(jì)才比較準(zhǔn)確。TIANGEN公司的DNAMarker條帶清晰，亮度均勻，質(zhì)量穩(wěn)定，是您實(shí)驗(yàn)的首選。需要注意的是Marker的電泳同樣也要符合DNA電泳的操作標(biāo)準(zhǔn)。如果選擇λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要預(yù)先65℃加熱5min，冰上冷卻后使用。從而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接頭導(dǎo)致的片段連接不規(guī)則或條帶信號(hào)弱等現(xiàn)象。第11頁,共16頁，2024年2月25日，星期天凝膠的染色和觀察實(shí)驗(yàn)室常用的核酸染色劑是溴化乙啶（EB），染色效果好，操作方便，但是穩(wěn)定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBRGreen，GelRed，雖然毒性小，但價(jià)格昂貴。TIANGEN公司的GeneGreen相比則是性價(jià)比高的低毒替代染料，其靈敏度比傳統(tǒng)EB染料高10倍以上。注意觀察凝膠時(shí)應(yīng)根據(jù)染料不同使用合適的光源和激發(fā)波長(zhǎng)，如果激發(fā)波長(zhǎng)不對(duì)，條帶則不易觀察，出現(xiàn)條帶模糊的現(xiàn)象。從瓊脂糖中回收DNA片段電泳洗脫法低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳挖塊法凍融回收法玻璃奶回收法柱回收法

膠回收注意事項(xiàng)：將電泳槽用ddH2O反復(fù)清洗干凈，倒入新鮮配制的滅菌電泳緩沖液；根據(jù)點(diǎn)樣量制備合適厚度的瓊脂糖凝膠板；切膠時(shí)盡可能切掉不含DNA片段的凝膠；要盡量減少DNA在紫外下的照射時(shí)間以減少對(duì)DNA的損傷；熔膠要完全。第12頁,共16頁，2024年2月25日，星期天聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：

聚丙烯酰胺凝膠電泳簡(jiǎn)稱為PAGE（Polyacrylamidegelelectrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2Acrylamide）和甲叉雙丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2)2N,N’-methylenebisacrylamide）聚合而成，這一聚合過程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有兩種：化學(xué)聚合和光聚合?；瘜W(xué)聚合通常是加入催化劑過硫酸銨（AP）以及加速劑四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基。溶液的pH對(duì)聚合作用是重要的，因?yàn)檫^低pH沒有足夠的堿基加速催化反應(yīng)，同樣過多的氧分子存在，會(huì)使聚合作用很快停止。所以制備凝膠時(shí)，在加過硫酸銨之前，混合物必須抽去空氣。核黃素催化的聚合作用，常用于制備濃縮膠，因?yàn)檫@樣制得的凝膠孔度要大些。核黃素在光照射下及有微量氧存在時(shí)，產(chǎn)生自由基使Acr發(fā)生聚合作用。第13頁,共16頁，2024年2月25日，星期天操作流程1.配制SDS聚丙烯酰胺凝膠所需的各種試劑2．SDS聚丙烯酰胺凝膠的灌制3．用考馬斯亮藍(lán)對(duì)SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行染色經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)樣品可用考馬斯亮藍(lán)R250染色。染色1～2小時(shí)或過夜。4.換脫色液脫色，需3～10小時(shí)，其間更換多次脫色液至背景清楚。注意事項(xiàng)制備膠所使用的玻璃板或玻璃管均需要潔凈并經(jīng)過干燥方能使用制備膠時(shí)，小心避免混入氣泡，為此再將各種所需比例的貯存混合后，應(yīng)進(jìn)行抽氣處理。第14頁,共16頁，2024年2月25日，星期天應(yīng)用

凝膠電泳被廣泛用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和生物化學(xué)：

1.大的DNA或者RNA分子通常利用瓊脂糖凝膠電泳（agarosegelelectrophoresis）分離，也