GB-T動物源性I型膠原蛋白成分測定 聚丙烯酰胺凝膠電泳法征求意見稿

ICS07.080

A21

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—201X

動物源性I型膠原蛋白成分測定聚丙烯

酰胺凝膠電泳法

DeterminationofthetriplehelixstructuralofcreaturaltypeΙcollagen——

Polyacrylamidegelelectrophoresis

（征求意見稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實(shí)施

中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局

中國國家標(biāo)準(zhǔn)1化管理委員會

GB/T××××—201×

動物源性I型膠原蛋白成分測定聚丙烯酰胺凝膠電泳法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動物源性I型膠原蛋白成分測定聚丙烯酰胺凝膠電泳法的原理、試劑材料、儀器設(shè)備、

操作步驟、結(jié)果分析。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于動物源性I型膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T9695.23肉與肉制品羥脯氨酸含量測定

GB/T23527蛋白酶制劑

GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB601—1988標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的配制和標(biāo)定

NYT1663-2008乳與乳制品中β-乳球蛋白的測定聚丙烯酰胺凝膠電泳法

YY/T1453-2016組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品Ⅰ型膠原蛋白表征方法

YY/T0606.6—200*組織工程醫(yī)療產(chǎn)品第6部分：I型膠原蛋白

3術(shù)語與定義

本標(biāo)準(zhǔn)下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

I型膠原typeIcollagen

在廣泛存在于動物體中的一種結(jié)構(gòu)蛋白，起到支撐作用并能聚集成纖維，是膠原纖維組分中的一部

分。

4原理

I型膠原經(jīng)特異的膠原酶水解，經(jīng)電泳判斷三螺旋結(jié)構(gòu)。

5試劑材料

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GB/T××××—201×

除非另有說明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的數(shù)據(jù)；實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中一級水的規(guī)定。

5.14mol/L鹽酸溶液

量取36mL濃鹽酸（HCl）注入50mL水中，定容至100mL，混勻，按照GB601—1988標(biāo)準(zhǔn)滴定

溶液的配制和標(biāo)定中方法進(jìn)行標(biāo)定。

5.2蛋白酶溶液

精確稱取2800U/mg酶活力的胃蛋白酶，配制成胃蛋白酶量分別為10000~20000U/g的溶液。

5.30.5mol/L乙酸

取冰醋酸15mL，加水稀釋并定容到500mL。

5.41mol/L濃縮膠緩沖液貯備液，pH6.8

稱取6.06g三羥甲基氨基甲烷，加適量水溶解，用鹽酸調(diào)pH值至6.8，用水定容至50mL，4°C

下保存。

5.5分離膠緩沖液貯備液，1.5mol/L，pH8.8

稱取9.08g三羥甲基氨基甲烷，加適量水溶解，用鹽酸調(diào)pH值至8.8，用水定容至50mL，4°C

下保存。

5.6丙烯酰胺單體貯備液

稱取14.55g丙烯酰胺和0.45gN，N'-亞甲基雙丙烯酰胺，先用40mL水溶解，攪拌，直至溶液變

澄清透明，再用水稀釋至50mL，過濾，備用。該貯備液在4℃下棕色瓶中可保存一個(gè)月。

5.7100g/L十二烷基磺酸鈉溶液

準(zhǔn)確稱取5g十二烷基磺酸鈉，用水溶解定容至50mL，室溫保存；

5.810%（v/v）N,N,N’,N’-四甲基乙二胺溶液

量取0.10mLN,N,N’,N’-四甲基乙二胺，加水稀釋定容至1.00mL，貯存于4℃。

5.910%（w/v）過硫酸銨溶液

稱取0.1g過硫酸銨，加入1mL的去離子水，將固體粉末徹底溶解，貯存于4℃。另外，使用前

配制.

5.10電極緩沖液，pH8.3

稱取3.0g三羥甲基氨基甲烷，14.4g甘氨酸，1.0g十二烷基磺酸鈉，加入十二烷基磺酸鈉溶液10

mL，溶解，用鹽酸調(diào)pH值至8.3，加水定容至1000mL；

5.110.08mol/L樣品緩沖液

精確稱取4mg溴酚藍(lán)，溶解于5.00mL水中，分別量取1.60mL濃縮膠緩沖液貯備液、4.00mL

十二烷基磺酸鈉溶液、2.20mL丙三醇，全部混合后用水稀釋定容至20mL,4°C保存。此溶液用于非還

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原SDS。如用于還原SDS，則再加2mLβ-巰基乙醇；

5.122.5g/L考馬斯亮藍(lán)熱色液，

稱取0.25g考馬斯亮藍(lán)R-250和10g硫酸銨，分別加入20mL乙醇、10mL磷酸，溶解混勻，用

水定容至100mL。

5.13脫色液

用量筒分別量取50mL甲醇或者乙醇、75mL乙酸、875mL水，待溶液混和均勻后加入的廣口瓶；

備用。

5.14固定液

取量250mL乙醇，60mL冰醋酸，加水稀釋至500mL。

5.151.00mg/mLI型膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液

精確稱取0.0100gI型膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥90%），用樣品緩沖液定容至10mL，4°C下保存。

6儀器與設(shè)備

6.1天平，感量0.0001g

6.2電泳儀

6.3電泳槽，100mm×83mm

6.4微量注射器，10μL

6.5離心機(jī)，不低于8000r/min。

6.6凝膠成像儀

6.7薄層成像掃描儀

7操作步驟

7.1試樣制備

7.1.1膠原原樣試樣前處理

稱取1g樣品，精確到0.1mg，加適量0.5M乙酸溶解，定容至10mL。取10mL液體樣品，磁力攪

拌器攪拌4h，離心5min，取上清液分裝，在4℃保存，備用。

7.1.2膠原制品試樣前處理

支架材料：將膠原支架裁剪成尺寸為10mm×10mm×24mm的試樣，浸泡在PBS溶液中，以備實(shí)

驗(yàn)使用。按7.1.1操作。

補(bǔ)片：將膠原補(bǔ)片裁剪成尺寸為10mm×10mm×24mm的試樣；再將裁剪后的試樣清洗浸泡在

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0.1%~40%(W/V)的堿溶液中，浸泡0.5~24h。清洗至PH為5~8后生理鹽水浸泡約0.5-48h，瀝去多

余水分，2~8℃組織搗碎后分散進(jìn)酶解液中，2~40℃環(huán)境酶解1~72h；酶解完畢后調(diào)PH值至7~13，

2-40℃靜置2~24h；30~150目濾網(wǎng)過濾，去除未酶解物。20%-50%(W/V)鹽溶液鹽析，收集固形物，

截留分子量為4000~8000的透析袋透析，去除多余離子和雜質(zhì)，獲得多型膠原，最后將多型膠原混合物

分散至水中，調(diào)pH值至1~5，30~150目濾網(wǎng)過濾，去除析出物，將濾液鹽析后透析，即可得到膠原。

按7.1.1操作。

敷料：將膠原敷料裁剪成尺寸為10mm×10mm×24mm的試樣，浸泡在PBS溶液中，以備實(shí)驗(yàn)使

用。按7.1.1操作。

7.2前處理

將待測的7.1的樣品平均分成兩組，每組兩只試管。一組暫不做處理，稱A管，另一組于60℃水

浴進(jìn)行加熱30min，稱為B管。將兩組樣品中分別加入10000~20000U/g胃蛋白酶溶液，在20℃（酶

最適溫度）反應(yīng)5min后取出。取A、B反應(yīng)液，加入樣品制備液，100℃加熱5min以使蛋白質(zhì)變性，

制備電泳樣品。

7.3分離膠制備

按表1配制12%分離膠20mL，混勻后加入到長短玻璃間的縫隙中，約60mm~70mm高。沿長玻璃

板板壁緩慢注入約5mm高的水，進(jìn)行水封。約30min后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則

表示凝膠完全聚合，傾倒去水封層的水，再用濾紙條吸去多余水分。

表1不連續(xù)凝膠的凝膠配方

貯液3%濃縮膠12%分離膠

丙烯酰胺單體貯備液2.5mL12mL

濃縮膠緩沖液貯備液0.6mL/

分離膠緩沖液貯備液/7.5mL

十二烷基磺酸鈉溶液50μL300μL

水1.82mL10μL

N,N,N’,N’-四甲基乙二胺溶液5μL20μL

過硫酸銨溶液25μL200μL

7.4濃縮膠制備

按表1配制3%濃縮膠10mL，混勻后加入到已聚合的分離膠上方，直至距離短玻璃板上緣約5mm

處。輕輕將樣品槽模板插入濃縮膠內(nèi)，約30min后凝膠聚合，再放置20min~30min，使凝膠老化。

4

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7.5裝槽

取出已配好的凝膠板，夾于電泳裝置相應(yīng)的位置上，取出樣品梳，將電極緩沖液注滿電泳槽前后槽。

7.6上樣

在供試品孔中加入電泳樣品，標(biāo)注好各樣品位置。

7.7電泳

把電泳裝置和電泳儀正確連接，調(diào)電壓150V，開始電泳，待藍(lán)色條帶約泳動到濃縮膠與分離膠交

接處時(shí)，調(diào)電壓200V繼續(xù)電泳，等藍(lán)色條帶到底部時(shí)停止電泳。

7.8固定

電泳完畢，取出膠片，置固定液中30分鐘。

7.9染色

從固定液中取出膠片，置染色液中約0.5小時(shí)。

7.10脫色

用脫色液脫色至凝膠背景透明。

7.11保存

脫色完畢后，凝膠保存在保存液中。

7.12結(jié)果處理

待凝膠在保存液中完全透明后可使用凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進(jìn)行拍照，轉(zhuǎn)換成電子數(shù)據(jù)后再進(jìn)行進(jìn)一

步處理。結(jié)果分析：A、B兩組樣品，經(jīng)過電泳之后，如果