GB-T基因表達的測定 蛋白印跡法征求意見稿

ICS07.080

A21

中華人民共和國國家標準

GB/TXXXXX—XXXX

基因表達的測定蛋白印跡法

Determinationofgeneexpression-Westernblot

（征求意見稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

GB/TXXXXX—XXXX

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GB/TXXXXX—XXXX

基因表達的測定蛋白印跡法

1范圍

本標準規(guī)定了蛋白印跡（Westernblot）法檢測目的基因表達的原理、試劑或材料、儀器設(shè)備、測

定步驟和結(jié)果分析。

本標準適用動植物組織或體外培養(yǎng)細胞目的基因表達的檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3術(shù)語、定義和縮略語

下列術(shù)語、定義和縮略語適用于本文件。

3.1術(shù)語和定義

3.1.1

基因表達geneexpression

將儲存在DNA分子中的遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子的過程。

3.2縮略語

3.2.1Tris：三羥甲基氨基甲烷。

3.2.2SDS：十二烷基磺酸鈉（sodiumdodecylsulfate）。

3.2.3SDS：十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegel

electrophoresis）。

3.2.4ECL：電化學(xué)發(fā)光（electrogeneratedchemiluminescence）。

3.2.5BSA：牛血清白蛋白（bullserumalbumin）。

4原理

SDS分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)印膜上后，先用抗目的蛋白質(zhì)的第一抗體（一抗）與轉(zhuǎn)印膜上的蛋

白質(zhì)反應(yīng)，然后利用帶標記的抗一抗的第二抗體（二抗）與一抗反應(yīng)，最根據(jù)二抗標記物的特性，檢測

出微量蛋白質(zhì)的方法，即蛋白印跡法（Westernblot）。

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5試劑或材料

除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。

5.1水：GB/T6682二級。

5.2RIPA裂解液（適用于動物組織或細胞）：見附錄A中A.1。

5.3植物提取液

將10mLTCA和70μLβ-巰基乙醇加入到70mL丙酮中，并定容至100mL。

5.4植物裂解液（適用于植物組織或細胞）：見附錄A中A.2。

5.51.5mol/LTris-HCl，pH8.8

將18.15gTris-base加入80mL水溶解，用1mol/LHCl調(diào)pH至8.8，然后用水定容至100mL。

5.61mol/LTris-HCl，pH6.8

稱取12.1gTris-base加入80mL水溶解，用1mol/LHCl調(diào)pH至6.8，然后用水定容至100mL。

5.730%（m/v）丙烯酰胺貯存液

稱取29g丙烯酰胺單體和1gN,N’-甲叉雙丙烯酰胺，加水溶解并定容至100mL，過濾，置于棕

色瓶，4oC避光保存，2個月內(nèi)使用。

5.810%（m/v）SDS

稱取10gSDS，加水溶解并定容至100mL，室溫保存。

5.910%（m/v）過硫酸銨

稱取1g過硫酸銨，加水溶解并定容至10mL。

5.10考馬斯亮藍溶液

稱100mg考馬斯亮蘭G250，溶于50mL95%的乙醇后，再加入120mL85%的磷酸，用水稀釋至1L，

濾紙過濾，4℃保存。

5.11BSA溶液

稱量干燥的BSA10mg，用生理鹽水配制成1.0mg/mL的標準蛋白質(zhì)溶液。

5.125×SDS上樣緩沖液

取5mL1mol/LTris-HCl（pH6.8）緩沖液、2gSDS、1.2mLβ-巰基乙醇、8mL甘油、0.02g

溴酚藍加入水中溶解，加水定容至40mL。

5.135×SDS電泳緩沖液貯存液

稱取23.5g甘氨酸和3.775gTris-base，加水溶解，定容至250mL。使用時按如下比例稀釋至使

用濃度：取133mL5×SDS電泳緩沖液，7mL10%SDS溶液，水定容至700mL。

5.14轉(zhuǎn)膜緩沖液貯存液

稱取5.82gTris-base，2.93g甘氨酸，0.375gSDS，加水溶解，定容至800mL，再加200mL甲醇混

勻，4°C保存。

5.152mol/LNaCl溶液

將117gNaCl加入水溶解，定容至1000mL。

5.161mol/LTris-HCl，pH7.5

將12.1gTris-base加入水溶解，用1mol/LHCl調(diào)pH至7.5，然后用水定容至100mL，然后高壓滅

菌后常溫保存。

5.17TBS溶液

量取75mL2mol/LNaCl溶液和10mL1mol/LTris-HCl（pH7.5）緩沖液，加水定容至1L。

5.18TBST溶液

量取75mL2mol/LNaCl溶液、10mL1mol/LTris-HCl（pH7.5）緩沖液和1mLTween-20，加

水定容至1L。

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6儀器設(shè)備

6.1電泳儀。

6.2轉(zhuǎn)膜儀。

6.3垂直電泳槽。

6.4天平：感量0.001g。

6.5脫色搖床。

6.6冷凍離心機：最大離心力12000rpm以上。

6.7化學(xué)發(fā)光儀/紅外熒光成像系統(tǒng)。

6.8振蕩器。

6.9真空干燥器。

7測定步驟

7.1總蛋白的提取

7.1.1動物總蛋白的提取

將20mg體外培養(yǎng)的細胞或研碎的組織轉(zhuǎn)移至1.5mL的Eppendorf管中，加150~250μL預(yù)冷的RIPA

細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），振蕩器震蕩15s，冰浴5min，重復(fù)震蕩-冰浴30min后，4°C，12000

rpm離心10min，上清液即為細胞總蛋白。

7.1.2植物總蛋白的提取

在液氮中研磨植物材料/細胞，加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過夜，4℃，8000rpm

離心20min，棄上清；加入等體積的冰浴丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇），搖勻，4℃，8000rpm離心

20min，然后真空干燥沉淀，備用；上樣前加入裂解液，室溫放置30min，使蛋白充分溶解，15℃，

8000rpm離心1h或更長時間，以沒有沉淀為標準。

7.2蛋白定量

7.2.1標準曲線

準確吸取適量1.0mg/mL的BSA標準蛋白質(zhì)溶液，加水逐級稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0mg/mL、

0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.06mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的系列標準工作溶液。準確

移取標準工作溶液0.1mL于試管中，加入考馬斯亮蘭G250溶液5.0mL，振蕩混勻，靜置2min。分光

光度計測定標準工作溶液在595nm處光吸收值A(chǔ)595。用標準工作溶液蛋白質(zhì)量（mg）為橫坐標，用

吸光度值A(chǔ)595為縱坐標，繪制標準曲線。

7.2.2樣品檢測

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準確移取樣品溶液0.1mL于試管中，加入考馬斯亮藍G250溶液5.0mL，振蕩混勻，室溫放置2min。

分光光度計上測定樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595。超出標準工作溶液質(zhì)量濃度上限的樣品應(yīng)稀釋后測

定。根據(jù)測定的樣品A595值，在標準曲線上查出樣品的蛋白質(zhì)含量。

7.3SDS

7.3.1變性

測完蛋白濃度后，計算含100μg總蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品于Eppendorf管中，

加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×，將樣品于沸水中煮3~5min使蛋白質(zhì)變性。

7.3.2制膠

根據(jù)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小選擇相應(yīng)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠濃度，見附錄A中A.3和A.4。

7.3.3上樣

取8.3.1的蛋白樣品上樣，相鄰齒道加上預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標準。

7.3.4電泳

凝膠上所加電壓為8V/cm，當染料進入分離膠后，把電壓提高到15V/cm，繼續(xù)電泳直到溴酚藍達

到分離膠底部，然后關(guān)閉電源。

7.4轉(zhuǎn)膜

7.4.1聚丙烯酰胺凝膠的準備

將進行完SDS后的凝膠浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中15min~60min。

7.5.2半干法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)

將轉(zhuǎn)印膜和兩張與轉(zhuǎn)印膜相同尺寸的濾紙于轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5min。由下至上安裝轉(zhuǎn)移裝置：陽

極板-濾紙-轉(zhuǎn)印膜-凝膠-濾紙-陰極板，根據(jù)凝膠面積按0.65mA/cm2接通電流，轉(zhuǎn)移1.5h～2h。

7.5封閉

用封閉液于平板搖床上搖動封閉1h。

7.6一抗結(jié)合

按0.1mL/cm2的量加入適當比例稀釋的第一抗體，在室溫下持續(xù)搖動1h以上或4oC緩慢搖動過夜。

棄去一抗工作液，用TBST洗滌轉(zhuǎn)印膜5min，更換TBST后再洗滌20min，再次更換TBST后洗滌5min，最

后用TBS洗滌濾膜5min。

7.7二抗結(jié)合

加入二抗工作液室溫下持續(xù)搖動1~3h。棄去二抗工作液，以TBST漂洗轉(zhuǎn)印膜三次，每次10min，

最后用TBS漂洗濾膜5min。

7.8成像

7.8.1辣根過氧化物酶標記二抗的成像

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取ECL化學(xué)發(fā)光液A、B等量混勻，加在轉(zhuǎn)印膜上，避光顯色1min~5min，化學(xué)發(fā)光儀成像。

7.8.2熒光標記二抗的成像

利用熒光成像系統(tǒng)的相應(yīng)光源激發(fā)后，接收發(fā)射光成像。

8結(jié)果分析

成像圖片本底干凈，能看到印跡膜均勻的輕微背景輪廓，目的條帶清晰且不過曝，即可判為目的蛋

白表達。

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AA

附錄A

試劑配制

A.1RIPA裂解液

A.1.1成分

A.1.1.1NaCl

A.1.1.2Tris

A.1.1.3EDTA

A.1.1.4TritonX-100

A.1.1.5Deoxycholate

A.1.1.6SDS

A.1.1.7水

A.1.1.8Aprotinin

A.1.1.9Leupeptin

A.1.1.10PMSF

A.1.1.11釩酸鈉

A.1.1.12氟化鈉

A.1.2制法

A.1.2.1溶液A：將Tris-base0.158g、NaCl0.18g、0.1gDeoxycholate、0.02gSDS和0.2mL

TritonX-100加入10mL水溶解，用1mol/LHCl調(diào)pH至7.4。

A.1.2.2溶液B：0.93gEDTA·2Na溶于4mL水中，再加入NaOH直至完全溶解，并定容至5mL，終濃度

為0.5mol/L。

A.1.2.3溶液C：取40uL溶液B加入溶液A中并定容至20mL，4℃保存。

A.1.2.4溶液D：取1mgAprotinin溶于1mL水中，-20℃保存

A.1.2.5溶液E：取1mgLeupeptin溶于1mL水中，-20℃保存

A.1.2.6溶液F：取34.84mgPMSF溶于1mL水中，4℃保存

A.1.2.7溶液G：取36.78mg釩酸鈉溶于1mL水中，4℃保存

A.1.2.8溶液H：取8.4g氟化鈉溶于1mL水中，4℃保存

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A.1.2.9溶液I：取20μL溶液D，20μL溶液E，100μL溶液F，100μL溶液G，100μL溶液G加入到溶液

C中，即為最終溶液。

A.2植物裂解液

A.2.1成分

A.2.1.1CHAPS

A.2.1.2尿素

A.2.1.3DTT

A.2.1.4水

A.2.2制法

A.2.2.1溶液A：將2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3mL滅菌的水中。

A.2.2.2溶液B：3.09gDTT溶于20mL水中。

A.2.2.3取325μL溶液B加入溶液A中，并定容至5mL。

A.3SDS分離膠

根據(jù)所需濃度不同，按照表A.1配置。

表A.1SDS分離膠配制

溶液成分（mL）

凝膠濃度1.5mol/LTris-HCl

30%丙烯酰胺溶液10%SDS溶液10%過硫酸銨溶液TEMED水

（pH8.8）

6%2.52.00.10.10.0085.3

8%2.52.7