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文檔簡介

ICS65.150

B51

中華人民共和國國家標準

GB/TXXXXX—XXXX

螺旋藻種質(zhì)資源鑒定評價技術規(guī)范

TheidentificationofArthrospiramaximaandArthrospiraplatensis

在提交反饋意見時,請講您知道的相關專利連同支持性文件一并附上

(征求意見稿)

(本稿完成日期:2018年11月2日)

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

GB/TXXXXX—XXXX

螺旋藻種質(zhì)資源鑒定評價技術規(guī)范

1范圍

本標準規(guī)定了螺旋藻種質(zhì)資源鑒定評價術語與定義、評價要求、試驗方法和結果判定。

本標準適用于鈍頂螺旋藻(Arthrospiraplatensis)和極大螺旋藻(Arthrospiramaxima)種質(zhì)資源鑒

定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。

GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3術語與定義

下列術語和定義適用于本文件:

3.1

螺旋藻spirulina

一種光合放氧、呈規(guī)則螺旋形的原核絲狀微藻。

4要求

4.1樣本采集

應采集培養(yǎng)成熟的新鮮螺旋藻。樣本量分別按各類試驗項目的標準規(guī)定執(zhí)行。

4.2評價內(nèi)容

4.2.1應包括螺旋藻的形態(tài)學特征和分子遺傳學特征。

4.2.2鈍頂螺旋藻藻絲應呈螺旋狀,無橫隔壁,在橫隔處有明顯的收縊,藍綠色,藻絲寬4~5微米,長

400~600微米,藻絲的頂端細胞鈍圓,無異形胞。

4.2.3極大螺旋藻藻絲應呈灰綠色,細胞寬7~9μm,長小于寬,螺間距70~80μm,頂端微尖,橫

壁不收縊,橫壁兩邊有顆粒。

4.2.3鈍頂螺旋藻和極大螺旋藻應具有數(shù)目可變串聯(lián)重復序列(見附錄A)。

5試驗方法

5.1形態(tài)學特征

采用目視法和顯微鏡檢測。

1

GB/TXXXXX—XXXX

5.2分子遺傳學特征

5.2.1DNA提取

DNA提取步驟如下:

1)取0.5g鮮重的絲狀體或葉狀體,用蒸餾水洗滌3遍,液氮研磨后分別轉(zhuǎn)入含有5倍于藻體積

的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)緩沖液(含2%(v/w)CTAB,1.4MNaCL,20mMEDTA,100mMTris-HCL

(pH8.0),2%巰基乙醇)的離心管中;

2)65℃溫浴2h,期間每10min顛倒混勻2-3次;

3)離心管用臺式高速離心機12000rpm離心10min,把上清液加入到另一離心管中;

4)冷卻至室溫后,輕柔加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1),輕輕顛倒混勻,重復3次;

5)用離心機12000rpm離心10min,取上清液至另一離心管中;

6)加入等體積的-20℃預冷異丙醇,輕輕顛倒混勻,于-20℃冰箱放置1h;

7)用離心機12000rpm離心10min;

8)棄上清液后,加入1mL的70%乙醇,洗兩次,再用無水乙醇洗一次;

9)倒去乙醇,再將DNA沉淀在超凈工作臺上吹干后;

10)加入100μL的TE緩沖液,完全溶解后,加5μLRNaseA(10mg/mL)至50μg/mL,37℃

溫浴1h;

11)加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1),顛倒混勻;

12)用離心機12000rpm離心10min,取上清液至另一離心管中;

13)重復步驟(11)和(12);加蛋白酶K至200μg/mL,37℃溫浴1h;

14)重復步驟11、12;加2倍體積的無水乙醇、1/2體積的NaCl,混勻后在-20℃放置1h;

15)重復步驟(7)~(9),加100μL的TE緩沖液,室溫下放置1h~2h,直至DNA完全溶解;

16)取2μLDNA溶液,稀釋50倍,用核酸蛋白分析儀檢測其濃度與純度;

17)用0.8%的瓊脂糖凝膠檢測所提取的基因組DNA片段的完整性;將DNA溶液用TE緩沖液稀釋至100

ng/μL的濃度,置于-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

5.2.2PCR擴增與檢測

擴增正向引物為5’-GAACATTTACGGTTTTAC-3’,反向引物為5’-CCTTACCAGTCCCACACC-3’。

PCR擴增反應體系為25μL,含2.5μL10×PCRBuffer,10ng模板DNA,2.5mmol/LMg2+,1.5UTaq

酶,200nmol/L引物,200μmol/LdNTP,最后添加無菌ddH2O至總體積為25μL。

PCR擴增具體程序為94℃預變性5min,94℃變性30s,60℃復性30s,72℃延伸1min,35個

循環(huán)后,72℃延伸10min,PCR擴增結束后對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測。

5.2.3測序

PCR擴增完畢,取7μL擴增產(chǎn)物加3μL溴酚藍后在1%瓊脂糖凝膠中電泳1h,經(jīng)EB染色后在紫外燈

下觀察結果。使用DNA片段膠回收試劑盒回收并純化目的片段。

2

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將回收的目的片段同PMD18-T載體進行連接(目的片段和載體的摩爾比為5:1,所用的連接酶為高

活性的T4連接酶),然后通過熱激轉(zhuǎn)化法進行細菌轉(zhuǎn)化。

用質(zhì)粒純化試劑盒從細菌克隆中提取和純化質(zhì)粒DNA。

純化后的質(zhì)粒DNA在DNA測序儀上采用Sanger雙脫氧鏈終止法原理在兩端同時進行測序。

6結果判定

具備形態(tài)學特征和分子遺傳學特征的樣品為合格種質(zhì)資源。

3

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AA

4

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BB

附錄A

(規(guī)范性附錄)

數(shù)目可變串聯(lián)重復序列

A.1鈍頂螺旋藻VNTR序列

AAGCGATCGCATCTCAACTTCCATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTTCCGTCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACT

TCCATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTTCCATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTCCAATCCCAGAGTCAAGCGATCG

CATCTCAACTCCAATCCCAGAGTCAAGTGATCGCATCTCAACTCCAATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTCCAATCCCAGAGT

CAAGTGATCGCATCTCAACTCCAATCCCAGAGTCAAGTGATCGCATCTCAACTCCAATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAATCCCA

ATTGCTATCACGCCTAGAATCCCAGGTAGAAGCGATCGCATTTCAACTCCCATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAATCCCAATTGC

TATCACGCCTAGAATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTCCCATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTCCCGTCCCAGAGT

CAAGCGATCGCATCTCAACTCCCATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTCCCATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTCCC

ATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTCGACGAGTCGATAACTGAAGCCGTGGCAGACATTACTTCCATCGTGTC

A.2極大螺旋藻VNTR序列

AAGCGATCGCATCTCAGCTTCCATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAAATCCAATCCCAGAGTCAAGCGATACGCATCTCAAC

TCCAATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTCCAATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTCCAATCCCAGAGTCAAGCGATC

ACATCTCAACTCCAATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAATCCCAATTGCTATCACGCCTAGAATCCCAGGTAGAAGCGATCGCATC

TCAACTCCAATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTCCAATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATTTCAACTCCCATCCCAGAGTCAAG

CGATCGCATCTCAACTCCCATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATC

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