GB-T水產(chǎn)源致敏性蛋白快速檢測 毛細管電泳法征求意見稿

ICS07.080

A21

中華人民共和國國家標準

GB/TXXXXX—201X

水產(chǎn)源致敏性蛋白快速檢測毛細管電泳

法

Rapiddeterminationoftheallergenicproteinfromaquaticanimalsorigin—

Capillaryelectrophoresis

（征求意見稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實施

國家市場監(jiān)督管理總局

發(fā)布

中國國家標準化管理委員會

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GB/T××××—201×

GB/T××××—201×

水產(chǎn)源致敏性蛋白快速檢測毛細管電泳法

1范圍

本標準規(guī)定了水生動物源水產(chǎn)食品原料典型致敏性蛋白含量的高效毛細管電泳快速測定的原理、試

劑或材料、儀器設(shè)備、測定步驟、結(jié)果計算。

本標準適用于甲殼類水生動物源原肌球蛋白和精氨酸激酶和魚類水生動物源小清蛋白含量的快速

檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

食物過敏foodAllergy

免疫機制介導(dǎo)的食物不良反應(yīng)，即致敏性蛋白引起的異?；蜻^強的免疫反應(yīng)，可由IgE或非IgE介導(dǎo)。

3.2

致敏性蛋白allergenicprotein

能夠使機體產(chǎn)生過敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)。

4原理

毛細管電泳以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為的

差異而實現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。通過致敏性蛋白在毛細管中的不同遷移行為，對被測樣品中致敏

性蛋白的遷移時間進行檢測，實現(xiàn)對致敏性蛋白的定性檢測。毛細管電泳中致敏性蛋白的響應(yīng)強度與致

敏性蛋白的含量呈線性關(guān)系，將響應(yīng)強度與致敏性蛋白含量建立標準曲線，以致敏性蛋白的譜峰面積代

表過敏原的實際量，通過標準曲線計算得到被測水生動物源水產(chǎn)原料致敏性蛋白的含量。

5試劑或材料

除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純.

5.1GB/T6682一級。

5.2甲醇（CH3OH）：色譜純。

GB/T××××—201×

5.30.01mol/LTris-鹽酸緩沖液,pH7.5

Tris(三羥甲基氨基甲烷)1.21g，加900mL雙蒸水溶解，用6MHCl調(diào)pH至7.5，用蒸餾水定

容至1000mL，用0.45μm濾膜過濾，超聲震蕩30min，室溫保存。

5.40.5mol/LNaCl溶液

NaCl14.61g，適量去離子水溶解，定容至500mL，用0.45μm濾膜過濾，超聲震蕩30min，室

溫保存。

5.5PBS緩沖液

NaCl8.00g，KCl0.20g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，將上列試劑加入定量容器中，蒸餾

水溶解后定容至1000mL，用鹽酸調(diào)pH值至7.4，用0.45μm濾膜過濾，超聲震蕩30min，室溫保

存。

5.6標準品儲備液配制

致敏蛋白標準品（蝦原肌球蛋白、蝦精氨酸激酶、魚小清蛋白）1mg，加入1mLPBS于1.5mL塑料

離心管中，漩渦震蕩混勻，制得1mg/mL蛋白標準儲備液，每100μL分裝凍存于-20℃。

5.70.1mol/LNaOH溶液

NaOH4.00g，適量雙蒸水溶解后定容至100mL，用0.45μm濾膜過濾，超聲震蕩30min，室溫

保存。

5.825mmol/L硼酸-硼砂緩沖溶液，pH9.2

精密稱取0.9525g四硼酸鈉，加入80mL雙蒸水溶解，用1mol/LNaOH調(diào)pH至9.2，用雙蒸水

定容至100mL，用0.45μm濾膜過濾，超聲震蕩30min，室溫保存。

6儀器設(shè)備

6.1高效毛細管電泳儀，配有紫外檢測器。

6.2冷凍離心機：12000r/min，4℃。

6.3渦旋振蕩器。

6.4酶標儀。

6.5pH計：精密度0.01。

6.6微孔濾膜：0.45μm，水相。

6.7分析天平：感量0.01g和0.0001g。

6.8蛋白純化儀。

7測定步驟

7.1試樣制備

水生動物源樣本用液氮研磨至粉末狀。

GB/T××××—201×

7.2提取

蛋白提取液配制：在預(yù)冷的1mLLysisBuffer中分別加入1μL蛋白酶抑制劑、10μL磷酸酶抑

制劑及5μL100mM苯甲基磺酰氟，混勻后置冰上保存數(shù)分鐘待用。

快速稱取研磨后的樣品（0.100±0.001）g放入1.5mL預(yù)冷離心管內(nèi)，加入1.0mL蛋白提取液，

漩渦混勻后4℃靜置2h，10000r/min，4℃離心5min，取上清液，分裝保存于-80℃，應(yīng)避免反復(fù)

凍融。提取蛋白浸液后，再用陰離子交換層析純化蛋白浸液，2mL蛋白浸液以0.5mL/min的流速上樣，

再用40mL0.01mol/LTris-鹽酸緩沖液和0.5mol/LNaCI溶液線性洗脫，洗脫速度為1mL/min，收集

蝦蛋白洗脫液第1~5管，用以測定蝦精氨酸激酶；收集蝦蛋白洗脫液第10~15管，用以測定蝦原肌球蛋

白；收集魚蛋白洗脫液第1~5管，用以測定魚小清蛋白，所得樣品冷藏備用（-80℃）。

7.3毛細管電泳參考條件

7.3.1毛細管沖洗方法

選用未涂層石英毛細管柱（45cm×75μm），新毛細管柱先依次用甲醇沖洗10min，蒸餾水沖洗5

min，0.1MNaOH溶液沖洗30min，蒸餾水沖洗5min，最后再用運行緩沖液沖洗20min；進樣前運行緩

沖液沖洗5min。

7.3.2實驗參數(shù)及條件

檢測波長是214nm，進樣方式為壓力進樣（0.5psi，5s），25℃；魚小清蛋白和蝦原肌球蛋白的

最佳分離條件為分離電壓15kV，運行緩沖液為25mmol/L硼酸-硼砂緩沖液；蝦精氨酸激酶的最佳分離

條件為分離電壓18kV，運行緩沖液為25mmol/L硼酸-硼砂緩沖液。

7.4測定

本方法采用外標校準曲線法定量測定。以系列致敏蛋白標準溶液濃度為橫坐標，毛細管電泳峰面積

為縱坐標，作標準曲線線性回歸方程（如附錄A），樣品的峰面積與標準曲線比較定量。標準溶液和樣

品提取液中致敏性蛋白的響應(yīng)值應(yīng)在儀器測定的線性范圍內(nèi)。標準溶液毛細管電泳圖參見附錄A。

8結(jié)果計算

致敏性蛋白含量按式（1）計算：

………（1）

?i×?

?式_中i=：?

M_i——致敏蛋白的含量（mg/g）；

C_i——樣品液中致敏蛋白含量（μg/mL）；

V——樣品液體積（mL）；

m——樣品質(zhì)量（g）。

計算結(jié)果以平行測定值的算術(shù)平均值表示，保留兩位有效數(shù)字。

GB/T××××—201×

附錄A

（資料性附錄）

標準溶液毛細管電泳圖

A.1原肌球蛋白毛細管電泳圖