【HPV基因檢測技術探究進展綜述5800字】

IIIHPV基因檢測技術研究進展綜述摘要宮頸癌是威脅世界女性健康的第四大惡性腫瘤，近年來，它的高發(fā)病率及越來越年輕化的趨勢引起了人們的重視。目前預防宮頸癌發(fā)生的重點是宮頸癌的早期篩查，篩查目標在于識別和治療宮頸癌的先兆病變，并且要準確、高效的識別這種宮頸異常病變。目前宮頸癌篩查方法種類較多，HPV基因檢測技術是目前比較安全可靠的篩查選擇。目前比較前沿的的幾種HPV檢測技術，不但檢測率高，而且安全性也很好，但都各自存在著一定的局限性。本綜述將全面闡述HPV基因檢測技術的發(fā)展，以更好地輔助其應于臨床治療。關鍵詞：宮頸癌篩查；HPV基因檢測；細胞學檢測目錄TOC\o"1-3"\h\u6661前言 160522HPV及其致病機制 1321462.1HPV概述 1306182.2HPV流行病學 1300102.3HPV致病機制 2111643HPV基因檢測技術及其研究進展 3254403.1細胞學檢測方法 3126193.2基于DNA檢測方法 356553.3基于RNA檢測方法 5126654HPV預防與宮頸癌治療 586305前景展望 627331參考文獻 71前言子宮頸癌在威脅世界女性健康的惡性腫瘤中排第四位，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，嚴重威脅著全球女性的生命健康。近年來，子宮頸癌日趨年輕化的發(fā)病趨勢越來越引起人們的關注。而目前在我國，子宮頸癌的發(fā)病率逐年呈現(xiàn)上升趨勢。子宮頸癌的發(fā)生源自子宮頸上皮內(nèi)瘤變(CervicalIntraepithelialNeoplasia，CIN)，為盡早發(fā)現(xiàn)無癥狀女性的高級別病灶，需要進行相關宮頸癌篩查，以防止其發(fā)展為浸潤性疾病。而HPV基因檢測技術的相關研究是進行宮頸癌篩查的實施手段，需要相關科研人員加以重視，那么本文就將對HPV基因檢測技術及其研究進展加以綜述，希望能為后面醫(yī)務人員的研究提供便利。2HPV及其致病機制2.1HPV概述HPV（人乳頭瘤病毒）是球形無包膜的小型環(huán)狀雙鏈DNA病毒，生物學分類上屬于乳頭瘤病毒科乳頭瘤病毒屬。截止目前，研究人員已經(jīng)分離鑒定的HPV有200多個型別，根據(jù)其致病性的差別可以將其分為高危型和低危型。高危人乳頭瘤病毒和宮頸癌的發(fā)生密切相關，除此之外還與宮頸癌、外陰癌、陰道癌、陰莖癌、肛門癌、復發(fā)性呼吸道乳頭狀瘤病等以及某些頭頸部惡性腫瘤相關。主要的傳播方式是性傳播，在發(fā)生性行為后，男性生殖器感染HPV的概率比女性要高，但因HPV持續(xù)存在的幾率較小而罹患癌癥風險極低，但是由于女性宮頸和陰道的生理結(jié)構，病毒更易滋生，因此相較于男性更易感染HPV，女性在HPV感染后的臨床癥狀表現(xiàn)為宮頸部位發(fā)生病變，如陰道分泌物增多、不規(guī)則出血、宮頸糜爛以及下腹部疼痛等。根據(jù)全球婦科癌癥發(fā)病率統(tǒng)計，宮頸癌在其中排第四，此外值得注意的是，其中超過2/3的患者來自于南非以及拉丁美洲等欠發(fā)達地區(qū)。2.2HPV流行病學HPV是比較常見的DNA病毒，在人群中的傳播十分廣泛。由于其存在自限性，大多數(shù)HPV感染并不會引起相應癥狀。因此其流行病學了解起來難以全面。截至目前的流行病學研究顯示，人類對于多種型別HPV普遍易感，且性行為較活躍的年輕人群感染HPV的幾率最大。目前主要傳染源來自HPV患者及其攜帶者，主要傳播途徑是性接觸。近幾年，HPV感染率明顯增加，且呈現(xiàn)明顯上升態(tài)勢，并且在年輕人群中表現(xiàn)尤為明顯。中國上世紀70年代至今的全國死因調(diào)查研究顯示，2004-2005年中國女性宮頸癌的病死人數(shù)在女性癌癥患者病死人數(shù)中占比較之于1990-1992年和1973-1975年出現(xiàn)短暫下降，但根據(jù)2012年的中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析報告，因?qū)m頸癌而導致的病死率年均增速仍達到8.1%。此外，在全球范圍內(nèi)，2018年新發(fā)宮頸癌病患約56.9萬例，其中死亡病例數(shù)占到31.1萬例左右，而且病死患者中的84%都屬于經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)。預計到2030年，這一比例會增加至98%。根據(jù)中國國家癌癥中心公布的數(shù)據(jù)，近幾年宮頸癌發(fā)病率年均增速已達8.7%。另外，據(jù)最新研究報道，雖然宮頸癌病死率在我國東部地區(qū)仍在繼續(xù)上升，尤其中西部地區(qū)病死率仍較高，但與以往相比比已有明顯下降。2.3HPV致病機制HPV基因按照其不同基因片段調(diào)控功能的不同可分為上游調(diào)控區(qū)、早期區(qū)、晚期區(qū)。上游調(diào)控區(qū)包含一個順式調(diào)控單元和HPV病毒的復制起點，負責調(diào)控病毒基因復制和轉(zhuǎn)錄的起始；早期區(qū)能夠編碼早期蛋白E1、E2、E4、E5、E6和E7，通過影響DNA復制、RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯的過程，參與HPV病毒的整個生命周期；晚期區(qū)負責編碼晚期蛋白L1和L2，即病毒的外殼蛋白，而病毒的外殼蛋白是細胞表面吸附、病毒包裝及侵入細胞質(zhì)的關鍵蛋白。對于HPV病毒而言，蛋白E1、E2、E4、E5、E6和E7是其增殖繁衍的關鍵功能蛋白，我們可以通過了解這些蛋白的的具體功能來了解HPV基因的致病機制。E2蛋白在HPV基因轉(zhuǎn)錄過程不同時期中發(fā)揮相應調(diào)節(jié)作用。在病毒侵染宿主后至與宿主基因組開始整合的期間，E2蛋白能夠特異性識別并結(jié)合靶位點E2BSs，然后導致特異性蛋白SP1和TATA結(jié)合蛋白TBP因此發(fā)生移位，進而抑制病毒轉(zhuǎn)錄的過程。相應的研究報道顯示，當將E2基因?qū)雽m頸癌細胞SiHa中后，癌細胞數(shù)量因此明顯下降，說明癌細胞的發(fā)展受到抑制；另外有研究表明，在與宿主基因組整合后的癌細胞中，E2基因處于甲基化狀態(tài)，說明當E2基因甲基化而不能發(fā)揮作用時，癌細胞才能正常增殖，證實了E2蛋白對HPV轉(zhuǎn)錄的阻滯作用。E5蛋白在HPV持續(xù)感染的過程中起到維持以及介導免疫逃逸的作用。在病毒與宿主細胞基因組整合后，細胞內(nèi)受體酪氨酸激酶（Met）的表達被E5蛋白上調(diào)，從而維持病毒復制和轉(zhuǎn)錄過程延續(xù)其生命周期。當外源DNA入侵女性自身免疫系統(tǒng)時，宮頸上皮細胞會發(fā)生應激反應，在基底層發(fā)生分裂并迅速凋亡、脫落，從而盡量減小病毒對人體帶來的危害。而E5蛋白的主要作用是通過上調(diào)表達環(huán)氧合酶-2，發(fā)揮促凋亡相關基因Bax的降解作用，與此同時激活表皮生長因子受體EGFR，延緩基底細胞分裂分化，使病毒能夠持續(xù)侵染宮頸上皮細胞。在介導免疫逃逸方面，高危型HPV侵染宿主細胞初期，宿主的自身免疫作用可以產(chǎn)生大量CD8＋T細胞，CD8＋T細胞是具有特定識別腫瘤細胞功能的T細胞，它能夠識別腫瘤細胞表面主要的組織相容性復合體類分子MHC，導致腫瘤細胞死亡，而E5蛋白具有能與MHC類分子的重鏈發(fā)生互作的疏水區(qū)，E5蛋白的疏水區(qū)因此能夠抑制MHC的抗原提呈，使宿主得免疫應答功能受損。E5蛋白介導宿主免疫應答，使宿主的抗病毒能力下降。E6、E7蛋白是關鍵的致癌基因。E6、E7蛋白在被感染細胞存在的位置影響到HPV的致病力，當其存在于被感染細胞的胞質(zhì)時，無法誘導惡性轉(zhuǎn)化，而當其存在于宿主細胞的細胞核時，則能夠維持HPV陽性癌細胞惡性表型。研究表明，在E6蛋白的羧基端存在一個PDZ結(jié)合模序（PBM），E6蛋白可以借助PBM與PDZ蛋白互作，促使病毒DNA進入細胞內(nèi)，繼而引發(fā)感染，進一步地HPVE6蛋白能夠結(jié)合誘導p53基因降解，并且能以腫瘤抑制基因pRb作為結(jié)合靶點，阻止腫瘤細胞凋亡。3HPV基因檢測技術及其研究進展HPV基因的實驗室檢測方法有很多種，主要可以分為三種類型：細胞學檢測方法、DNA檢測方法、RNA檢測方法。3.1細胞學檢測方法細胞學檢測方法即傳統(tǒng)檢測方法，如宮頸涂片和液基細胞學等，也可以通過對子宮脫落細胞進行病毒L1蛋白的單抗檢測來判斷患者是否感染HPV，在臨床上一般適用于進行普查，這一類檢測方法的特點是：操作簡便易行，特異度較高，但靈敏度不夠高，成本低廉，整體檢測效率較低，不能實現(xiàn)HPV分型。但是，目前隨著人工智能的不斷發(fā)展，AI輔助細胞學檢測已經(jīng)獲得了較大進展，通過研究發(fā)現(xiàn)，在相同條件下，AI輔助閱讀的敏感性(相對敏感性1.01，95%CI：0.97-1.05)與細胞學專家類似，并且AI輔助閱讀的特異性甚至高于細胞學專家(相對特異性1.26，95%CI：1.20-1.32)。在未來，AI輔助檢測能夠很大程度上規(guī)避細胞學檢測的不足。3.2基于DNA檢測方法HPVDNA檢測的基本原理是依據(jù)堿基互補配對的原則，針對HPV基因組上存在的特定序列進行相對應的引物和/或探針設計，利用探針與病毒基因序列的特異性結(jié)合，采用PCR擴增的手段獲得預期片段，再進行定性或定量檢測。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，DNA檢測的靈敏度更高并且特異性更強，能夠?qū)崿F(xiàn)HPV分型，但也存在一個問題，就是即使在宿主宮頸細胞中檢出HPV的DNA片段也只能說明病毒確實存在，并不代表一定發(fā)生了宮頸病變。到目前為止，HPVDNA檢測的方法已經(jīng)有很多，各有優(yōu)缺點。（1）芯片雜交技術是指首先對HPV靶基因的基因序列進行酶標，酶標后再與固相支持物上的探針分子進行雜交顯色，這樣可以同時一次性實現(xiàn)多種HPV的亞型分析，這個方法的優(yōu)點是通量高、速度快的特點，缺點是操作復雜、且易發(fā)生交叉污染。另外，AdvanSure和雙巢式PCR是在PCR方法的基礎上進行改良，基礎操作均類似，不同的是在引物設計時進行多重引物設計，通進而實現(xiàn)多重HPV亞型的檢測[23,24]，該方法的優(yōu)點是靈敏度較高，缺點是易發(fā)生污染。（2）數(shù)字PCR技術，即“第三代PCR”，它是通過數(shù)字PCR儀在無標準曲線的情況下，對分子靶標進行絕對定量檢測的技術，雖然目前在臨床上目前還不能全面推廣，但可以針對特殊緊急的病患進行針對使用，它的特點是檢測靈敏度高、準確定量，但成本高、通量低、且操作復雜。（3）目前瑞金醫(yī)院檢驗科HPV核酸檢測及基因分型試劑盒采用的是PCR毛細電泳片段分析法，原理是利用多重PCR和毛細電泳技術，針對宮頸細胞的E6、E7、E1基因進行引物設計，將不同HPV型別分類的基因進行PCR擴增及毛細電泳分離，由于不同基因擴增片段的長度不同，毛細電泳后條帶的位置也因此不同，這樣就能夠在一次檢測中對多種HPV型別進行同步分型。瑞金HPV核酸檢測及基因分型試劑盒可以用于體外定性檢測女性宮頸脫落細胞樣本中的25種HPV基因型別鑒定。這25種HPV基因型別包括：6、11、16、18、26、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、81、82、83等，在臨床的輔助診斷上可以使用，但是不能用于宮頸癌篩查相關預期用途。它的優(yōu)點是操作簡單規(guī)范，可以一次對多種HPV基因型別進行鑒定，定性檢測結(jié)果重復性好，可在臨床上廣泛使用，缺點是對樣品采集、轉(zhuǎn)運、儲存、和處理過程有相應要求，如果不能很好符合要求，會影響檢測結(jié)果，試劑盒檢測結(jié)果僅供臨床參考，還要綜合考慮患者的臨床癥狀或體征以及實驗室檢查的其他情況，最終作出判定。總得來說，基于DNA的檢測方法靈敏度特異性和效率成本很難兼得，在實際的臨床應用中應當根據(jù)不同的情況作出相應的選擇，以達到檢測更加高效、準確、實用。3.3基于RNA檢測方法HPVDNA檢測的基本原理與HPVDNA檢測類似，但是通過HPV的致病機制我們發(fā)現(xiàn)，病毒DNA是通過整合到宿主基因組中，進行轉(zhuǎn)錄翻譯后發(fā)揮作用的，那么由此可見，HPVmRNA檢測相比HPVDNA檢測，前者或許在臨床上能更直接和準確地發(fā)現(xiàn)HPV感染人群。研究人員GE等對細胞學表現(xiàn)正常而HPVmRNA檢測陽性的女性行組織學篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了17.3%(95%CI：16.2-18.4)CIN3+和16.4%(95%CI：15.3-17.5)CIN2+的患者，另外再分別單獨進行HPVmRNA檢測和細胞學檢查，結(jié)果單獨進行HPVmRNA檢測的敏感性更高，而單獨細胞學檢查的特異性仍較高。此外，GRANADOS等對年齡段在35歲以下且HPVmRNA檢測呈陽性的女性進行篩查發(fā)現(xiàn)，CIN2+病變的發(fā)生率最高，并且當他們是HPV16/18/45陽性時，所有的活檢結(jié)果顯示為CIN2+病變的患者均為HPVmRNA陽性。對低度鱗狀上皮內(nèi)和不典型鱗狀上皮細胞病變來說，通過HPVmRNA檢測的結(jié)果比HPVDNA檢測的特異性更高，結(jié)果相對更加可靠。HPVDNA檢測通常情況下比較容易做到靈敏度較高，但整體上看特異性不高。而根據(jù)研究結(jié)果顯示，在統(tǒng)計學分析上HPVE6/E7mRNA檢測比HPVDNA檢測陽性預測值更高、特異性更強，并且不論是HPVmRNA檢測還是HPVDNA檢測，其陽性率均隨著病變程度的增加而增加，另外通過HPVmRNA檢測的活檢結(jié)果表明其≥HSIL的特異性和陽性預測價值明顯高于DNA檢測。因此，我們可以看到，HPVmRNA檢測與HPVDNA檢測相比有較為獨特的優(yōu)勢，具有更好的臨床應用價值，HPVmRNA檢測可用作臨床風險分層。4HPV預防與宮頸癌治療宮頸癌的早期篩查和HPV疫苗的研發(fā)應用是HPV預防的主要措施，能夠在很大程度上降低宮頸癌病死率。而疫苗接種可能是消除發(fā)展中國家宮頸癌的一個長期有效的措施。HPV疫苗主要分為治療性疫苗和預防性疫苗，截至目前，疫苗研究主要針對的是高危型HPV，治療性疫苗的工作原理是，通過激活宿主細胞的自身免疫反應產(chǎn)生T細胞或溶菌酶來清除癌變細胞，治療性疫苗所針對的靶抗原一般是E6、E7關鍵致病蛋白，通過重新激發(fā)宿主特異性T細胞介導的免疫反應，以清除癌變細胞。預防性疫苗是誘導體液的免疫應答產(chǎn)生一定數(shù)量的中和抗體，通過中和抗體在很長的一段時間內(nèi)來預防HPV感染。目前我國正大力推廣適齡人群預防性疫苗的接種。臨床試驗結(jié)果顯示，目前市場上的九價疫苗能預防多種類型HPV引起的高級別宮頸、外陰、陰道病變，且疫苗的預防效果持續(xù)時間較長，最長可達6年以上。雖然疫苗的預防和治療效果顯著，但其價格昂貴、且必須低溫運輸，目前大多數(shù)的發(fā)展中國家還不具備相應條件，無法進行推廣。目前開發(fā)更有效、針對性更強的疫苗或是藥物是研究人員的主要方向，這需要深入理解HPV基因組及其致病蛋白，為臨床治療宮頸癌提供新思路，例如已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，miR－221在SOCS1／TypeIIFN信號通路中起關鍵作用，它可以抑制HPVDNA的復性；lncRNASNGH12、TMPOP2、lnc-CCDST的表達水平對HPVE6、E7蛋白的活性能夠產(chǎn)生重要影響，這些研究成果都有可能成為潛在的治療靶點，為新的靶向藥物研發(fā)提供理論基礎。最后，要預防HPV，需要養(yǎng)成良好的生活習慣。長期吸煙、多胎生育、衣原體感染和長期服用激素類避孕藥會增加宮頸癌患病風險。因此總得來說，預防宮頸癌主要是從三方面入手，一是需要加強生活習慣方面的認知，二是通過宮頸癌早期篩查，三是通過疫苗和藥物的介入。5前景展望高危HPV的高致病性嚴重影響了全球女性的健康生活，已經(jīng)帶來了嚴重后果，相應年齡段人群養(yǎng)成良好的生活習慣，提前預防、注射疫苗、早發(fā)現(xiàn)早治療是預防宮頸癌發(fā)病的有效措施。通過回顧近些年來科研人員在HPV的檢測、預防和治療方面的研究進展，我們可以看到盡管研究人員對于HPV致病機制的研究已經(jīng)有了諸多的突破，對于HPV的檢測和預防也有許多有效手段，但事實上這一疾病仍然由于許多原因為全球許多女性帶來了困擾，我們要做的是立足當下，盡可能多的去解決各方面的問題，讓這一疾病盡早淡出人們的視野。

參考文獻黃曉梅．宮頸癌的早期癥狀及影響因素研究［J］．中國繼續(xù)醫(yī)學教育，2018，10(7)：79-80．陳萬青,鄭榮壽,張思維,等.2012年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J].中國腫瘤,2016,25(1):1-8.包鶴齡,劉韞寧,王黎君,等.中國2006-2012年子宮頸癌死亡情況與變化趨勢分析[J].中華流行病學雜志,2017,38(1):58-64.陳一凡，戚欣，李靜，等．宮頸癌的發(fā)病機制