DB2306T 185-2023 牛呼吸道疾病綜合征病原PCR檢測技術(shù)規(guī)范

ICS65.020.30CCSICS65.020.30CCSB41黑 龍 江 省 大 慶 市 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB2306/T185—2023PCR技術(shù)規(guī)范2023-12-31發(fā)布 2024-01-31實(shí)施大慶市場監(jiān)理局 發(fā)布DB2306/T185—2023DB2306/T185—2023PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前言 II1范引文件 1語定義 1境設(shè)施 1器備 1劑材料 2本處與酸取 2增系反條件 2附錄A（范） 病采集常處理 9參考獻(xiàn) 10前 言本文按GB/T1.1—2020《準(zhǔn)工導(dǎo)則 第部分標(biāo)化件結(jié)和起規(guī)》起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本文件由大慶市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出并歸口。DB2306/T185—2023DB2306/T185—2023PAGEPAGE10PCR技術(shù)規(guī)范范圍本文件規(guī)定了牛呼吸道疾病綜合征病原PCR檢測技術(shù)的環(huán)境與設(shè)施、儀器設(shè)備、試劑與材料、樣本前處理與核酸提取、擴(kuò)增體系與反應(yīng)條件等要求。本文件主要適用于牛呼吸道疾病綜合征主要病原的PCR檢測和分子鑒定。（GB/T18637 /GB/T27981 PCRNY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范NY/T3234牛支原體PCR檢測方法SN/T1129牛病毒性腹瀉/粘膜病檢疫技術(shù)規(guī)范下列術(shù)語和定義適用于本文件。牛呼吸道疾病綜合癥bovinerespiratorydiseasecomplex，BRDC實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)及級別要求具有與采集病料相適應(yīng)的動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室條件和生物安全防護(hù)水平相適應(yīng)的設(shè)備，以及防止病原感染和擴(kuò)散的有效措施。操作人員資質(zhì)及防護(hù)要求操作人員有從業(yè)資質(zhì)，符合上崗要求。生物安全柜、4℃離心機(jī)、PCR儀、漩渦震蕩器、水平電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、恒溫水浴鍋、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀等。試劑PCRRNADNAPBSTrizolReagent材料（1005001000（1002005001000（（（10、200、1000μL）（1.5、2、15、50mL），采樣管（5mL），（10、200μL、1000μL），（5、10、20mL），），PCR管（200μL）等。樣本前處理樣本采集遵循NY/T541的規(guī)定，見附錄1。核酸提取按RNA或DNA核酸提取試劑盒說明書操作。牛傳染性鼻氣管炎病毒（PCR）引物選擇IBRV的gI糖蛋白基因區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，序列如下：上游引物：5ˊ-CACGGACCTGGTGGACAAGAAG-3ˊ(624-645)下游引物：5ˊ-CTACCGTCACGTGAGTGGTACG-3ˊ(1070-1091)目的片段大小468bp。擴(kuò)增體系：上、下游引物各50pM，脫氧核糖核苷酸三磷酸（dNTPs）20mM，PCR緩沖液（MgCl250mM）20mM，TaqDNA0.75μLDNA5μL50。反應(yīng)條件：共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；每個(gè)溫度循環(huán)由95℃60s、57℃60s和72℃60s組成。最后1個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)，在72℃下延長6min。IBRVIBRV標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行PCRIBRV標(biāo)PCR（qPCR）GB/T27981選擇IBRV的gB基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，序列如下：(57499–57519)(57595–57575)探針序列：5ˊ-FAM-AGGACCGCGAGTTCTTGCCGC-TAMRA-3ˊ(57525–57545)參考基因序列為GenBank登錄號AJ004801。擴(kuò)增體系：添加2×real-timePCR混合液12.5μL，ROX參考染料0.5μL，上、下游引物（4.5μM）各1.0μL，探針（3μM）1.0μL，無核酸酶水4μL，DNA模版5.0μL。反應(yīng)條件：50℃2min，95℃2min，1個(gè)循環(huán)；95℃15s，60℃45s，45個(gè)循環(huán)。通常根據(jù)所選擇的設(shè)備分析軟件說明設(shè)定閾值，來自陰性動(dòng)物病毒分離陰性樣本，用做檢測系統(tǒng)的背景信號。每次檢測反應(yīng)應(yīng)該包括陰性對照、陽性對照和試劑對照。來自陰性牛的肺組織或者鼻液作為陰性對照；自然感染牛陽性樣本作為陽性對照（陽性對照可以用陰性樣本摻入IBRV）。（Ct）45Ct（3Ct值）CT值30-33陰性結(jié)果：未檢測出Ct值的樣本應(yīng)判定為陰性。陰性對照和未添加模板應(yīng)檢測不出Ct值。牛病毒性腹瀉病毒（RT-PCR）SN/T1129引物根據(jù)BVDV病毒株基因序列5ˊUTR設(shè)計(jì)合成一對特異性引物，序列如下：上游引物：5ˊ-AGGCTAGCCATGCCCTTAGT-3ˊ下游引物：5ˊ-TCTGCAGCACCCTATCAGG-3ˊ目的片段大小244bp。5L0RT-25LM225L5L（各0L）2.5μL，RNasin（40U/μL）0.5μL，AMV（5U/μL）0.5μL，TagDNA（5U/μL）0.5μL，上下游引物各0.5μL，RNA模板5.0μL，DEPC/ddH2O9.5μL。4031530110min，4℃PCR將PCR10μL與2μL1%含EB0.5244如被檢樣品有條帶，大小為244bp，與陽性樣品相同，即可判定為陽性。（RT-qPCR）GB/T18637引物根據(jù)BVDV的5ˊUTR非編碼區(qū)合成引物和探針，序列如下：上游引物：5ˊ-CCGCGAMGGCCGAAAAGA-3ˊ下游引物：5ˊ-TGACGACTNCCCTGTACTCAG-3ˊ探針序列：5ˊ-FAM-CCATGCCCTTAGTAGGACTAGCA-BHQ1-3ˊ擴(kuò)增體系：5×RT（Mg2+濃度15mmoL/L）5.0μL，dNTP（2.5mmoL/L）1.0μL，MgCl2（25mmoL/L）2.0（10μmoL/L）1.0μL（10μmoL/L）0.5U/μL）0.5μL，RNA（40U/μL）0.25酶（5U/μL）0.25μL3.5μL。反應(yīng)條件：反轉(zhuǎn)錄42℃30min（或按反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行設(shè)定）；預(yù)變性94℃3min；92℃15s，45℃30s，72℃60s，5個(gè)循環(huán)；92℃10s，56℃60s，40個(gè)循環(huán)，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct（或Cp）值判定結(jié)果。根據(jù)BVDV或值BVDVCt（或Cp）值>35牛副流感病毒3型（RT-PCR）檢測引物選擇核衣殼蛋白N基因序列設(shè)計(jì)引物，序列如下：上游引物：5ˊ-GAGAAAGACCCAGGAAGACAGA-3ˊ下游引物：5ˊ-ACACCCATCGCATAACTCCAGA-3ˊ目的片段大小704bp。bufer2.5（201.0U/μL）0.2μL，ddH2O17.3μL，cDNA2.0。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性50s，50℃退火50s，72℃延伸50s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物于4℃保存。51%（EB5μg/mL）200V0m水）704bp（RT-qPCR）引物3M5ˊACAA-3ˊ下游引物：5ˊ-TCCCTCTATCGAGTGGAAGACACT-3ˊ探針序列：5ˊ-FAM-TTGCGCTTGCACC-MGB-3ˊ目的片段大小63bp。PCRSuperMix-UDG12.5μL（10μmoL/L）0.5μL，DEPC9.25μL，cDNA2.0μL0.25μL。502minUDG；952min9515s6030s4060通常根據(jù)所選擇的設(shè)備分析軟件說明設(shè)定閾值，來自陰性動(dòng)物病毒分離陰性樣本，用做檢測系統(tǒng)的背景信號。根據(jù)Ct（或Cp）值對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行描述及判定，描述和判定分為：無Ct（或Cp）值，且無擴(kuò)增曲線，表示樣品中無BPIV3核酸，判為陰性；Ct（或Cp）值<35，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中存在BPIV3核酸，判為陽性；Ct（或Cp）值>35，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線的樣品需復(fù)檢。復(fù)檢仍出現(xiàn)上述結(jié)果的，判為陽性。否則判為陰性。牛呼吸道合胞體病毒（RT-PCR）檢測引物根據(jù)王嵩等人錯(cuò)誤!未找到引用源。報(bào)道，選擇保守性較強(qiáng)的N基因設(shè)計(jì)的引物，序列如下：上游引物：5ˊ-TATGCTATGTCCCGATTGG-3ˊ下游引物：5ˊ-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3ˊ目的片段大小596bp。擴(kuò)增體系；總體系25μL體系中進(jìn)行，LATaqbuffer2.5μL，dNTP（2.5mmoL/L）1.5μL，上、下游引物（20μmoL/L）各0.5μL，模板DNA2.0μL，ddH2O17.8μL，后加LATaq（5U/μL）0.2μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min、94℃變性50s，56℃50s，72℃延伸50s，30個(gè)循環(huán)，72℃再延伸10min。R1（水，V596bp逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）引物選擇BRSVN基因序列的共有保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，序列如下：上游引物：5ˊ-GAGATGGGAGAAGTAGCTC-3ˊ上游引物：5ˊ-GGCTCTCCTAATGACTGC-3ˊ目的片段大?。?38bp。擴(kuò)增體系：SYBRGreenMaster10μL，上、下引物（10μmoL/L）各0.2μL，DEPC水8.6μL，cDNA模板1.0μL。反應(yīng)條件：95℃2min，95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)Ct（或Cp）值對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行描述及判定，描述和判定分為：無Ct（或Cp）值，且無擴(kuò)增曲線，表示樣品中無BRSV核酸，判為陰性；當(dāng)Ct（或Cp）值<35，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中存在BRSV核酸，判為陽性；Ct（或Cp）值>35，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線的樣品需復(fù)檢。復(fù)檢仍出現(xiàn)上述結(jié)果的，判為陽性。反之則判為陰性。（PCR）引物根據(jù)何泊寧等人錯(cuò)誤!未找到引用源。報(bào)道，選擇多殺性巴氏桿菌外膜蛋白H（OmpH）基因序列設(shè)計(jì)引物，序列如下：上游引物：5ˊ-GACGAGCTCTTAGCAGTCGCAGCAGTA-3ˊ下游引物：5ˊ-GGGGTCGACTTAGACATTGCCTTTTGTTGTTACG-3ˊ目的片段大小978bp。按細(xì)菌總DNA提取試劑盒說明書提取致病菌基因組總DNA。擴(kuò)增體系：上、下游引物（20μM）各0.5μL，Premix2×TaqMasterMix12.5μL，去離子水10.5μL，DNA模板1.0μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min（共30個(gè)循環(huán)25i。PCR5μLEB1%DL2000DNA（（8p為陽性。將PCR（PCR）引物根據(jù)王密等人錯(cuò)誤!未找到引用源。報(bào)道，選擇擴(kuò)增16SrRNA的引物，序列如下：上游引物：5ˊ-GGGGCTTTTTGTTTTGGTGG-3ˊ(70-90)下游引物：5ˊ-TCTCTGGCACATCGCAGTGTAT-3ˊ(975-997)目的片段大小927bp。擴(kuò)增體系：10×PCRbuffer2.5μL，dNTP（2.5mM）2.0μL，上、下游引物（20μM）各0.5μL，LATaq（2.5U/μL）0.25μL，超純水18.75μL，DNA模板2.0μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收試劑盒回收、純化DNA，于4℃保存。陰性對照（水）無目的基因和其他雜帶出現(xiàn)，陽性對照（A.pyogenes陽性樣本）出現(xiàn)約927bp大小的目的基因?yàn)殛栃?。牛支原體（PCR）NY/T3234引物5ˊ-GGCTCTCATTAAGAATGTC-3ˊ擴(kuò)增基因片段長度1.9kb。病料經(jīng)常規(guī)處理，DNA提取試劑盒提取模板。（100.5μL，5U/μLrTaqDNA0.5mmol/LMgCl22.0μL，ddH2O15.0模板2.0μL，10×PCRBuffer(Mg2+free)2.5μL，2.5mmol/LdNTPs2.0。955min；9530s，5230s，72120s，3072℃再延伸10min。取PCR產(chǎn)物經(jīng)EB染色的0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳和成像。待檢樣品擴(kuò)增出的DNA片段為1.9kb，可判定為支原體核酸陽性；未出現(xiàn)1.9kb的DNA片段，則可判定待檢樣品為牛支原體核酸陰性。附錄A（規(guī)