微環(huán)DNA轉(zhuǎn)染制備臨床級(jí)CAR-T技術(shù)規(guī)范

4DB13/TXXXXX—XXXX微環(huán)DNA轉(zhuǎn)染制備臨床級(jí)CAR-T技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了相關(guān)術(shù)語與定義、基本要求、風(fēng)險(xiǎn)預(yù)案、實(shí)施方案的制定、實(shí)施與操作、毒副反應(yīng)的處理、患者隨訪等內(nèi)容。本文件適用于細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)與實(shí)施細(xì)胞免疫治療的醫(yī)療機(jī)構(gòu)。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)cellpreparationinstitution具備細(xì)胞制備專業(yè)人員、GMP樣細(xì)胞培養(yǎng)室、專業(yè)設(shè)施及設(shè)備條件和資質(zhì)的企業(yè)、機(jī)構(gòu)或?qū)嶒?yàn)室。3.2醫(yī)療機(jī)構(gòu)medicalinstitution具備細(xì)胞免疫治療所需人員、場(chǎng)地、設(shè)施及設(shè)備條件并符合國(guó)家資質(zhì)的醫(yī)院或科室。3.3外周血單個(gè)核細(xì)胞peripheralbloodmononuclearcell；PBMC血液中具有單個(gè)核的細(xì)胞，主要包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和少量其他類型細(xì)胞。3.4臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞umbilicalcordbloodmesenchymalstemcells；UCB-MSCs胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后殘留在胎盤和臍帶中的血液經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增所獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞，屬于多能干細(xì)胞。3.5臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞umbilicalcordmesenchymalstemcells；UC-MSCs胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后，廢棄端臍帶的華氏膠組織經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增所獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞，屬于多能干細(xì)胞。3.6脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞adipose-derivedmesenchymalstemcells；AD-MSCs抽吸脂肪組織經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增所獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞，屬于多能干細(xì)胞。3.75DB13/TXXXXX—XXXX誘導(dǎo)多能干細(xì)胞inducedpluripotentstemcells；iPSCs是指通過導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子，將終末分化的體細(xì)胞重編程而獲得的一種類似胚胎干細(xì)胞和胚胎APSC多能細(xì)胞的細(xì)胞類型，屬于多能干細(xì)胞。3.8γδT細(xì)胞γδTlymphocytes；γδT是一種胞外區(qū)缺乏TCRαβ受體、CD4及CD8表達(dá)陰性、外周血占比僅1-5%、異體回輸不引起GVHD反應(yīng)的特殊T細(xì)胞亞型。3.9原料T細(xì)胞rawmaterialTcells可用于制備效應(yīng)T細(xì)胞的，來源于自體外周血單個(gè)核細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞、同種異體并經(jīng)組織相容抗原配型和/或基因改造的T淋巴細(xì)胞、同種異體經(jīng)分選獲得的特殊T細(xì)胞亞型、或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的T淋巴細(xì)胞等。3.10效應(yīng)細(xì)胞effectorcells經(jīng)體內(nèi)誘導(dǎo)或體外加工制備，培養(yǎng)擴(kuò)增所獲得的，能夠特異性或非特異性識(shí)別和殺傷靶細(xì)胞的活化T淋巴細(xì)胞。嵌合抗原受體T細(xì)胞chimericantigenreceptorTcells；CAR-T經(jīng)基因工程修飾的，可表達(dá)被導(dǎo)入的含有抗原識(shí)別片段、T細(xì)胞受體活化分子、共刺激信號(hào)等信號(hào)分子的CAR基因的效應(yīng)T細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)transduction借助病毒或非病毒載體將外源性遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）導(dǎo)入細(xì)胞并使其穩(wěn)定表達(dá)的過程。3.13病毒載體viralvector將外源性遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）插入病毒基因組非必需區(qū)包裝而成的病毒顆粒，能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)和感染細(xì)胞并使其穩(wěn)定表達(dá)外源性遺傳物質(zhì)。非病毒載體nonviralvector能夠利用自身物化性質(zhì)介導(dǎo)基因的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，使所攜帶基因階段性高表達(dá)于細(xì)胞表面，但不整合至宿主細(xì)胞基因組的非病毒載體材料。具有轉(zhuǎn)染效率高、毒性低、免疫反應(yīng)低、無傳染性、安全性高等優(yōu)點(diǎn)。3.15微環(huán)DNAminicircleDNA；mcDNA是傳統(tǒng)質(zhì)粒在大腸桿菌中通過位點(diǎn)特異性重組獲得的一種小環(huán)狀超螺旋表達(dá)框，具有缺乏抗性標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)等細(xì)菌序列、臨床安全性高等特征。3.16電轉(zhuǎn)染electrotransfection通過高強(qiáng)度電場(chǎng)作用瞬時(shí)提高細(xì)胞膜的通透性，將外源性遺傳物質(zhì)（核苷酸、DNA、RNA、蛋白、糖類、染料及病毒顆粒等）高效率導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移方法。3.17基因編輯geneediting采用基因工程技術(shù)對(duì)細(xì)胞染色體的特定基因組進(jìn)行敲除，或?qū)⒛康幕蚪M進(jìn)行隨機(jī)或定點(diǎn)插入的基6DB13/TXXXXX—XXXX因修飾過程。3.18效應(yīng)細(xì)胞終產(chǎn)品finalproductofeffectorcells指原料細(xì)胞經(jīng)體外制備、培養(yǎng)及擴(kuò)增全過程制成的終末細(xì)胞培養(yǎng)物或收獲物。3.19期間檢驗(yàn)intermediatesurvey效應(yīng)細(xì)胞終產(chǎn)品收獲前特定時(shí)間點(diǎn)的質(zhì)量檢驗(yàn)；一般包括細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活率、細(xì)胞表型、目的基因表達(dá)率、細(xì)胞因子分泌功能以及靶向殺傷功能等檢驗(yàn)檢定。3.20放行檢驗(yàn)finalinspection效應(yīng)細(xì)胞收獲后所制備終產(chǎn)品的質(zhì)量檢驗(yàn)；一般包括細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活率、快速無菌、細(xì)菌真菌培養(yǎng)、支原體培養(yǎng)、內(nèi)毒素、PH值、滲透壓、以及有害殘留物等檢驗(yàn)檢定。3.21標(biāo)識(shí)label粘貼或附著在對(duì)象上的、用于區(qū)分不同對(duì)象的標(biāo)記、注釋或條碼。3.22GMP樣細(xì)胞培養(yǎng)室GMP-likecelllaboratory具備空間萬級(jí)以上、局部百級(jí)的專業(yè)化細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施與設(shè)備的細(xì)胞培養(yǎng)室。3.23淋巴細(xì)胞刪除性化療lymphocytedeletionchemotherapy指采用特定化療藥物對(duì)患者進(jìn)行以非髓性淋巴細(xì)胞刪除為目地的化療。3.24預(yù)處理preconditioning指采用特定藥物和/或措施，對(duì)患者進(jìn)行以增強(qiáng)治療效果或預(yù)防毒副反應(yīng)為目地的前期治療和/或處4基本要求4.1人員要求4.1.1細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)（以下簡(jiǎn)稱“機(jī)構(gòu)”）應(yīng)配備有與其規(guī)模相適應(yīng)的研發(fā)、生產(chǎn)制備、質(zhì)量控制人員團(tuán)隊(duì)。一般研發(fā)團(tuán)隊(duì)2-3人以上，以博士、碩士為主；生產(chǎn)制備技術(shù)人員團(tuán)隊(duì)3-5人以上，以碩士、本科為主；質(zhì)量控制人員團(tuán)隊(duì)1-2人以上，以碩士為主。4.1.2機(jī)構(gòu)團(tuán)隊(duì)所有成員均應(yīng)接受過細(xì)胞制備、質(zhì)量控制、儲(chǔ)存與運(yùn)輸、臨床應(yīng)用等技術(shù)和規(guī)范的專業(yè)化培訓(xùn)，并年度考核合格。4.1.3機(jī)構(gòu)團(tuán)隊(duì)所有成員均應(yīng)體檢合格后上崗，體檢項(xiàng)目應(yīng)至少包括乙肝、丙肝、艾滋、梅毒、新冠等傳染病檢驗(yàn)，并年度體檢合格。4.2機(jī)構(gòu)資質(zhì)4.2.1機(jī)構(gòu)應(yīng)具備省部級(jí)以上認(rèn)證的高新技術(shù)企業(yè)資質(zhì)。4.2.2機(jī)構(gòu)應(yīng)具備省部級(jí)以上認(rèn)證的GMP樣細(xì)胞培養(yǎng)室資質(zhì)。4.2.3機(jī)構(gòu)應(yīng)具備完整規(guī)范的質(zhì)量控制體系。4.3場(chǎng)地、設(shè)施條件7DB13/TXXXXX—XXXX4.3.1機(jī)構(gòu)應(yīng)具備符合臨床級(jí)細(xì)胞制劑制備的場(chǎng)地與設(shè)施條件，主要包括研發(fā)中心、專業(yè)的GMP樣細(xì)胞培養(yǎng)室、質(zhì)量控制室等。4.3.2機(jī)構(gòu)的GMP樣細(xì)胞培養(yǎng)室應(yīng)符合空間萬級(jí)以上（萬級(jí)或千級(jí)）、局部百級(jí)、人員分流、物品分流的基本要求，并滿足定期檢測(cè)與維護(hù)、運(yùn)行良好的基本要求。4.4設(shè)備條件4.4.1機(jī)構(gòu)應(yīng)具備細(xì)胞制備所必需的各種設(shè)備，主要包括細(xì)胞分選設(shè)備、細(xì)胞轉(zhuǎn)染設(shè)備（電轉(zhuǎn)儀）、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備、細(xì)胞觀察與分析設(shè)備（流式細(xì)胞儀等）、質(zhì)控設(shè)備、冷藏冷凍設(shè)備等。4.4.2所有設(shè)備應(yīng)定期進(jìn)行檢測(cè)與維護(hù)以保證運(yùn)行良好。4.5試劑耗材要求4.5.1細(xì)胞制備所采用的各種試劑、耗材均應(yīng)購自資質(zhì)企業(yè)。4.5.2所有試劑耗材應(yīng)盡量采用臨床級(jí)別或GMP級(jí)別。4.5.3機(jī)構(gòu)自制試劑或耗材均需經(jīng)過自檢或第三方檢驗(yàn)合格，并符合臨床級(jí)別或GMP級(jí)別的要求。5風(fēng)險(xiǎn)預(yù)案5.1機(jī)構(gòu)應(yīng)對(duì)每一批次細(xì)胞產(chǎn)品建立登記備案體系、樣品留存體系、臨床事件追溯體系、不合格產(chǎn)品補(bǔ)救體系等風(fēng)險(xiǎn)預(yù)案。5.2風(fēng)險(xiǎn)預(yù)案應(yīng)考慮到每批次細(xì)胞產(chǎn)品制備全過程（病人評(píng)估、細(xì)胞采集、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、實(shí)驗(yàn)室分選、基因修飾、培養(yǎng)與擴(kuò)增、期間檢驗(yàn)、放行檢驗(yàn)、細(xì)胞凍存、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、臨床治療）中可能出現(xiàn)的各種風(fēng)險(xiǎn)及其處理措施，以確保細(xì)胞制劑的質(zhì)量可靠及臨床安全。6法規(guī)依從機(jī)構(gòu)每批次細(xì)胞制劑質(zhì)量控制需嚴(yán)格依從《中國(guó)藥典》2020版、《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)》、《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范(GLP)》、《藥物臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范(GCP)》、《CAR-T細(xì)胞制劑制備質(zhì)量管理規(guī)范》2018版、《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》2017版等相關(guān)法規(guī)和指導(dǎo)原則。7實(shí)施與操作7.1原料細(xì)胞的獲取目前CAR-T療法主要分為兩大類，一是個(gè)體化CAR-T治療，二是通用型CAR-T治療。個(gè)體化CAR-T的原料T細(xì)胞主要通過自體外周血PBMC的采集、分離分選、培養(yǎng)擴(kuò)增來獲取。通用型CAR-T的原料T細(xì)胞主要采用健康人αβT細(xì)胞、γδT細(xì)胞、NK細(xì)胞等；間充質(zhì)干細(xì)胞或iPSC來源的T細(xì)胞等。其中αβT細(xì)胞需進(jìn)行GVHD相關(guān)基因的敲除以保證原料T細(xì)胞的通用性。7.1.1自體原料T細(xì)胞的獲取：細(xì)胞采集前應(yīng)對(duì)病人狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估并符合以下標(biāo)準(zhǔn)：1）無活動(dòng)性感染疾病。2）心、肺、肝、腎功能基本正常。8DB13/TXXXXX—XXXX3）KPS評(píng)分>50或ECOG評(píng)分3分以下。4）白細(xì)胞（WBC）計(jì)數(shù)>4.0×109/L，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)>2.0×109/L，血紅蛋白（HGB）>90g/L，血小板（PLT）計(jì)數(shù)>100×109/L。5）傳染性疾病檢驗(yàn)：乙肝表面抗原，乙肝E抗原、抗體，乙肝核心抗體，丙肝（HCV）抗體，艾滋（HIV）抗體，梅毒抗體應(yīng)全部陰性。其中任何一項(xiàng)陽性需對(duì)所采集的細(xì)胞進(jìn)行特殊標(biāo)注，并通知細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)在獨(dú)立的制備空間進(jìn)行細(xì)胞制備，以防止交叉污染。自體外周血PBMC的采集：1）外周血抽取：抽取血量一般為50-100ml。2）血液成分分離機(jī)（COBE）采集外周血PBMC：循環(huán)血量一般為4000-6000ml，PBMC采集量一般為100-120ml。自體外周血PBMC的轉(zhuǎn)運(yùn)：1）轉(zhuǎn)運(yùn)條件：2-8℃條件下轉(zhuǎn)運(yùn)。2）時(shí)間限制：應(yīng)在3-4hr內(nèi)運(yùn)達(dá)GMP樣細(xì)胞培養(yǎng)室并進(jìn)行后續(xù)處理。7.1.2健康供者原料T細(xì)胞的獲取：細(xì)胞采集前應(yīng)對(duì)健康供者進(jìn)行評(píng)估并符合以下標(biāo)準(zhǔn)：1）無活動(dòng)性感染疾病。2）心、肺、肝、腎功能基本正常。3）白細(xì)胞（WBC）計(jì)數(shù)>4.0×109/L，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)>2.0×109/L，血紅蛋白（HGB）>90g/L，血小板（PLT）計(jì)數(shù)>100×109/L。4）傳染性疾病檢驗(yàn)：乙肝表面抗原，乙肝E抗原、抗體，乙肝核心抗體，丙肝（HCV）抗體，艾滋（HIV）抗體，梅毒抗體全部陰性。其中任何一項(xiàng)陽性視為供者細(xì)胞不合格。健康供者外周血PBMC的采集：1）抽取外周血：抽取血量一般為50-100ml。2）血液成分分離機(jī)（COBE）采集外周血PBMC：循環(huán)血量一般為4000-6000ml，PBMC采集量一般為100-120ml。健康供者外周血PBMC的轉(zhuǎn)運(yùn)：1）轉(zhuǎn)運(yùn)條件：2-8℃條件下轉(zhuǎn)運(yùn)。2）時(shí)間限制：應(yīng)在3-4hr內(nèi)運(yùn)達(dá)GMP樣細(xì)胞培養(yǎng)室并進(jìn)行后續(xù)處理。7.1.3臍血或臍帶組織的獲?。耗殠а蚰殠ЫM織采集前應(yīng)對(duì)產(chǎn)婦進(jìn)行評(píng)估并符合以下標(biāo)準(zhǔn)：1）足月產(chǎn)。2）無活動(dòng)性感染疾病。2）傳染性疾病檢驗(yàn)：乙肝表面抗原，乙肝E抗原、抗體，乙肝核心抗體，丙肝（HCV）抗體，艾滋（HIV）抗體，梅毒抗體全部陰性。其中任何一項(xiàng)陽性視為供者細(xì)胞或組織不合格。臍帶血或臍帶組織的采集：9DB13/TXXXXX—XXXX1）胎兒娩出、臍帶結(jié)扎后，廢棄端臍帶內(nèi)采集臍帶血約80-100ml。2）胎兒娩出、臍帶結(jié)扎后，采取廢棄端臍帶組織約15-20cm。臍帶血或臍帶組織的轉(zhuǎn)運(yùn)：1）轉(zhuǎn)運(yùn)條件：2-8℃條件下轉(zhuǎn)運(yùn)。2）時(shí)間限制：應(yīng)在離體3-4hr內(nèi)運(yùn)達(dá)GMP樣細(xì)胞培養(yǎng)室并進(jìn)行后續(xù)處理。7.1.4脂肪組織的獲?。褐窘M織采集前應(yīng)對(duì)供者進(jìn)行評(píng)估并符合以下標(biāo)準(zhǔn)：1）無活動(dòng)性感染疾病。2）傳染性疾病檢驗(yàn)：乙肝表面抗原，乙肝E抗原、抗體，乙肝核心抗體，丙肝（HCV）抗體，艾滋（HIV）抗體，梅毒抗體全部陰性。其中任何一項(xiàng)陽性視為供者細(xì)胞或組織不合格。脂肪組織的采集：1）無菌手術(shù)中抽吸大網(wǎng)膜脂肪組織10-20ml。2）無菌手術(shù)條件下抽吸皮下脂肪組織10-20ml。脂肪組織的轉(zhuǎn)運(yùn)：1）轉(zhuǎn)運(yùn)條件：2-8℃條件下轉(zhuǎn)運(yùn)。2）時(shí)間限制：應(yīng)在離體3-4hr內(nèi)運(yùn)達(dá)GMP樣細(xì)胞培養(yǎng)室并進(jìn)行后續(xù)處理。7.1.5商業(yè)化干細(xì)胞的獲?。簛碓从谫Y質(zhì)企業(yè)或?qū)嶒?yàn)室。具備可靠的質(zhì)量保證。液氮環(huán)境下轉(zhuǎn)運(yùn)至GMP樣細(xì)胞培養(yǎng)室。7.2原料T細(xì)胞的分選與制備7.2.1自體原料T細(xì)胞的分選與培養(yǎng)：細(xì)胞處理環(huán)境：細(xì)胞處理全過程應(yīng)在GMP樣細(xì)胞培養(yǎng)室及生物安全柜中進(jìn)行。細(xì)胞處理流程：PBMC的Ficoll分離→MACS磁珠分選→收獲原料T細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)：原料T細(xì)胞的培養(yǎng)與擴(kuò)增需采用未加異源血清及抗生素的無血清培養(yǎng)基，以及臨床級(jí)別或至少GMP級(jí)別的細(xì)胞因子。7.2.2同種異體原料T細(xì)胞的分選與培養(yǎng)：細(xì)胞處理環(huán)境：細(xì)胞處理全過程應(yīng)在GMP樣細(xì)胞培養(yǎng)室及生物安全柜中進(jìn)行。細(xì)胞處理流程：健康供者外周血PBMC的Ficoll分離→MACS磁珠分選→收獲原料T細(xì)胞(γδT：直接使用；αβT：需敲除GVHD相關(guān)基因）。細(xì)胞培養(yǎng)：原料T細(xì)胞的培養(yǎng)與擴(kuò)增需采用未加異源血清及抗生素的無血清培養(yǎng)基，以及臨床級(jí)別或至少GMP級(jí)別的細(xì)胞因子。7.2.3間充質(zhì)干細(xì)胞來源原料T細(xì)胞的分選與培養(yǎng)：臍血干細(xì)胞來源原料T細(xì)胞的制備：DB13/TXXXXX—XXXX1）細(xì)胞處理環(huán)境：細(xì)胞處理全過程應(yīng)在GMP樣細(xì)胞培養(yǎng)室及生物安全柜中進(jìn)行。2）細(xì)胞處理流程：臍帶血的Ficoll分離→MACS磁珠分選→收獲原料T細(xì)胞(γδT：直接使用；αβT：需敲除GVHD相關(guān)基因）。3）細(xì)胞培養(yǎng)：原料T細(xì)胞的培養(yǎng)與擴(kuò)增需采用未加異源血清及抗生素的無血清培養(yǎng)基，以及臨床級(jí)別或至少GMP級(jí)別的細(xì)胞因子。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源原料T細(xì)胞的制備：1）細(xì)胞處理環(huán)境：組織與細(xì)胞處理全過程應(yīng)在GMP樣細(xì)胞培養(yǎng)室及生物安全柜中進(jìn)行。2）細(xì)胞處理流程：臍帶處理獲取華氏膠組織→培養(yǎng)皿中培養(yǎng)獲取間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）→MACS磁珠分選收獲原料T細(xì)胞(γδT：直接使用；αβT：需敲除GVHD相關(guān)基因）。3）細(xì)胞培養(yǎng)：原料T細(xì)胞的培養(yǎng)與擴(kuò)增需采用未加異源血清及抗生素的無血清培養(yǎng)基，以及臨床級(jí)別或至少GMP級(jí)別的細(xì)胞因子。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源原料T細(xì)胞的制備：1）細(xì)胞處理環(huán)境：組織與細(xì)胞處理全過程應(yīng)在GMP樣細(xì)胞培養(yǎng)室及生物安全柜中進(jìn)行。2）細(xì)胞處理流程：脂肪組織的獲取→培養(yǎng)皿中培養(yǎng)獲取間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）→MACS磁珠分選收獲原料T細(xì)胞(γδT：直接使用；αβT：需敲除GVHD相關(guān)基因）。3）細(xì)胞培養(yǎng)：原料T細(xì)胞的培養(yǎng)與擴(kuò)增需采用未加異源血清及抗生素的無血清培養(yǎng)基，以及臨床級(jí)別或至少GMP級(jí)別的細(xì)胞因子。7.2.4商業(yè)化干細(xì)胞來源原料T細(xì)胞的制備：細(xì)胞處理環(huán)境：細(xì)胞處理全過程應(yīng)在GMP樣細(xì)胞培養(yǎng)室及生物安全柜中進(jìn)行。細(xì)胞處理流程：快速解凍MSCs或iPSCs→MACS分選→收獲原料T細(xì)胞(γδT：直接使用；αβT：需敲除GVHD相關(guān)基因）。細(xì)胞培養(yǎng)：原料T細(xì)胞的培養(yǎng)與擴(kuò)增需采用未加異源血清及抗生素的無血清培養(yǎng)基，以及臨床級(jí)別或至少GMP級(jí)別的細(xì)胞因子。7.3原料液的制備與建庫7.3.1目的基因-CAR全基因序列的設(shè)計(jì)與合成：應(yīng)用DNAstar8.0生物學(xué)軟件分別分析、篩選和設(shè)計(jì)包含有CAR結(jié)構(gòu)的胞外域、跨膜區(qū)及胞內(nèi)域的全基因序列。采用基于PCR的長(zhǎng)片段DNA精確合成法（PCR-basedaccuratesynthesis,PAS），合成目的基因-CAR全基因序列。將目的基因-CAR全基因序列合成至pUC57質(zhì)粒中，命名為目的基因-CAR-pUC57載體質(zhì)粒。雙酶切凝膠電泳、基因測(cè)序鑒定目的基因-CAR全基因序列連接正確。7.3.2目的基因-CAR親本載體質(zhì)粒的制備（原料液）：載體質(zhì)粒：采用mcDNA載體試劑盒（MC-EasyTMMinicircleDNAProductionkit,SBI）所提供的親本載體質(zhì)粒（pMC.CMV-MCS-SV40PolyA）及目的基因-CAR-pUC57載體質(zhì)粒。質(zhì)粒提?。翰捎觅|(zhì)粒提取試劑盒分別提取上述質(zhì)粒。DB13/TXXXXX—XXXX親本載體質(zhì)粒構(gòu)建：所提取上述質(zhì)粒經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化（在mcDNA試劑盒所提供的特殊感受態(tài)菌液ZYCY10P3S2TE.coli中）、挑選克隆、搖菌擴(kuò)增獲得目的基因-CAR親本載體質(zhì)?？寺【骸ｈb定：從上述含目的基因-CAR親本載體質(zhì)粒的克隆菌液中提取質(zhì)粒，雙酶切、凝膠電泳、基因測(cè)序鑒定正確，表明目的基因-CAR親本載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。7.3.3目的基因-CAR親本載體質(zhì)粒原料液主庫及工作庫的建立：上述鑒定正確的目的基因-CAR親本載體質(zhì)粒克隆菌液大量搖菌擴(kuò)增后，在同一容器中與50%的甘油按照1：1混合收獲25%的親本載體質(zhì)粒甘油菌液（原料液）。原料液主庫的建立：上述原料液按照5-7×106/1.5ml/1.8ml凍存管的濃度分裝入凍存管，程序降溫-80℃儲(chǔ)存，建立原料液主庫。原料液工作庫的建立：原料液主庫中取出原料液，搖菌擴(kuò)增過夜獲得大量菌液；提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切、凝膠電泳、基因測(cè)序鑒定正確，在同一容器中制備成25%的甘油菌液，分裝，程序降溫，-80℃儲(chǔ)存，建立原料液工作庫。原料液主庫及工作庫的儲(chǔ)存時(shí)限：-80℃儲(chǔ)存一般不超過12個(gè)月。原料液主庫的更新：每12個(gè)月從-80℃取出原料液搖菌擴(kuò)增，經(jīng)雙酶切、凝膠電泳、測(cè)序鑒定正確，在同一容器中制備成25%的甘油菌液，分裝，程序降溫，-80℃儲(chǔ)存，建立原料液次代主庫。原料液工作庫的質(zhì)控：原料液工作庫達(dá)到儲(chǔ)存時(shí)限前廢棄，按步驟重新建立工作庫。原料液主庫及工作庫各代次應(yīng)符合一致性的要求。7.4工作液的制備與儲(chǔ)存7.4.1目的基因-CAR-mcDNA載體質(zhì)粒的提?。?80℃工作庫中取出原料液，室溫復(fù)蘇，接種到含有50μg/ml卡那霉素2ml的LB液體培養(yǎng)基上，30℃、250rpm搖菌1-2hr，測(cè)定OD600值，計(jì)算接種體積。將菌液按照接種體積接種至試劑盒提供的1X生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，搖菌過夜（<16hr）。取少量菌液測(cè)定并調(diào)整PH值在6.9-7.4之間、OD600值在4-6之間。繼續(xù)搖菌（<5.5hr）收獲菌液。小劑量提取質(zhì)粒，雙酶切、凝膠電泳、基因測(cè)序鑒定目的基因-CAR-mcDNA載體質(zhì)粒質(zhì)量合格，暫存于-20℃。按QIAGENEndoFreePlasmidMaxiKit說明書步驟，大劑量提取目的基因-CAR-mcDNA載體質(zhì)粒，凝膠電泳再次鑒定合格。用EndoFreebufferTE重溶質(zhì)粒并定量（濃度要求：>400ng/ul收獲目的基因-CAR-mcDNA載體質(zhì)粒（工作液）。7.4.2目的基因-CAR-mcDNA載體質(zhì)粒工作液的儲(chǔ)存：目的基因-CAR-mcDNA載體質(zhì)粒工作液需置于-20℃暫存，用于CAR-T效應(yīng)細(xì)胞的制備。目的基因-CAR-mcDNA載體質(zhì)粒工作液-20℃暫存時(shí)限一般不超過3個(gè)月。7.5臨床級(jí)CAR-T效應(yīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染制備7.5.1主要設(shè)備：DB13/TXXXXX—XXXXLONZA公司提供的臨床級(jí)4D-Nucleofector電轉(zhuǎn)儀。7.5.2主要試劑：LONZA公司提供的臨床級(jí)電轉(zhuǎn)試劑盒：P3PrimaryCell4D-NucleofectorTMXKitL（100ul），或P3PrimaryCell4D-NucleofectorTMLVKitL（1.0ml）。7.5.3原料T細(xì)胞：個(gè)體化CAR-T制備：采用自體外周血PBMC來源原料T細(xì)胞。通用型CAR-T制備：采用健康供者外周血來源或干細(xì)胞來源的γδT細(xì)胞、GVHD相關(guān)基因敲除的αβT細(xì)胞、或NK細(xì)胞等。7.5.4生產(chǎn)用工作液：目的基因-CAR-mcDNA載體質(zhì)粒工作液。7.5.5CAR-T效應(yīng)細(xì)胞的電轉(zhuǎn)制備：六孔板加入含CD3單抗、CD28單抗及IL-2的無血清培養(yǎng)基2ml，培養(yǎng)箱中預(yù)熱備用。電轉(zhuǎn)液配制：采用LONZA電轉(zhuǎn)試劑盒所提供試劑，按照不同電轉(zhuǎn)單元所需電轉(zhuǎn)液總量配制電轉(zhuǎn)液（配置比例：82μlnucleofectorsolution+18μlsupplement/每100μl電轉(zhuǎn)液室溫放置備用。工作液的準(zhǔn)備：-20℃取出目的基因-CAR-mcDNA載體質(zhì)粒工作液，室溫復(fù)融備用。原料T細(xì)胞的準(zhǔn)備：按照每個(gè)100μl電轉(zhuǎn)杯轉(zhuǎn)染5×106個(gè)T細(xì)胞的細(xì)胞量準(zhǔn)備原料T細(xì)胞，1500rpm離心，完全棄上清。待轉(zhuǎn)液的準(zhǔn)備：上述原料T細(xì)胞中加入所需劑量的電轉(zhuǎn)液重懸，按照電轉(zhuǎn)液總量的1/10劑量加入目的基因-CAR-mcDNA載體質(zhì)粒工作液，混勻制備成待轉(zhuǎn)液備用。電轉(zhuǎn)杯添加：取LONZA提供的電轉(zhuǎn)杯（100μl單元或1.0ml單元按各單元規(guī)定劑量加入待轉(zhuǎn)液（需輕柔添加并避免氣泡）。CAR-T的電轉(zhuǎn)制備：采用LONZA4D-Nucleofector電轉(zhuǎn)儀，設(shè)定相應(yīng)程序，啟動(dòng)電轉(zhuǎn)完成CAR-T效應(yīng)細(xì)胞的電轉(zhuǎn)制備。7.5.6CAR-T效應(yīng)細(xì)胞的培養(yǎng)與擴(kuò)增：采用試劑盒提供的特制吸管，輕柔吸出電轉(zhuǎn)杯中的全部細(xì)胞，移入預(yù)熱的6孔板中，輕柔打散，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日加入IL-15繼續(xù)培養(yǎng)24-48hr。取少量細(xì)胞行biotin-proteinL染色、PE-SA標(biāo)記、流式檢測(cè)T細(xì)胞表面CAR基因的表達(dá)率（CAR表達(dá)率應(yīng)為60-80%）。細(xì)胞80-90%覆蓋時(shí)，轉(zhuǎn)移至175cm2培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)袋（半封閉）繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增，每2-3天添加新鮮培養(yǎng)基，據(jù)情擴(kuò)瓶培養(yǎng)。一般5-10天細(xì)胞數(shù)量滿足臨床數(shù)量級(jí)時(shí)收獲。7.5.7CAR-T效應(yīng)細(xì)胞的期間檢驗(yàn)（期間質(zhì)控，效應(yīng)細(xì)胞收獲前2天）：細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞活率檢驗(yàn)：采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板法或細(xì)胞計(jì)數(shù)儀法；細(xì)胞數(shù)量應(yīng)達(dá)到臨床數(shù)量級(jí)，細(xì)胞活率應(yīng)在95%以上。細(xì)胞表型檢驗(yàn)：采用流式細(xì)胞法（FCM個(gè)體化：CD3+T占比應(yīng)在95%以上，CD4/CD8比值應(yīng)在1.4-2.0之間；通用型γδT：γδT占比應(yīng)在99%以上；通用型αβT：TCR及B2M表達(dá)應(yīng)陰性。DB13/TXXXXX—XXXXCAR基因表達(dá)檢驗(yàn)：采用biotin-proteinL染色、PE-SA標(biāo)記、流式細(xì)胞檢測(cè)法；CAR表達(dá)率應(yīng)在60%以上。細(xì)胞因子分泌功能檢驗(yàn)：采用ELISA檢驗(yàn)法；INF-γ、IL-2或TNF-α等細(xì)胞因子分泌量應(yīng)顯著升高。靶向殺傷功能檢驗(yàn)：采用CCK-8檢驗(yàn)法；效靶比20:1時(shí)殺傷效率應(yīng)在80%以上。7.6臨床級(jí)CAR-T注射液的制備、儲(chǔ)存、質(zhì)控與轉(zhuǎn)運(yùn)：7.6.1臨床級(jí)CAR-T注射液的制備、灌裝與儲(chǔ)存：臨床級(jí)凍存液的配制：31.25%的臨床級(jí)復(fù)方電解質(zhì)溶液A+31.25%的臨床級(jí)0.45%氯化鈉注射液+20%的臨床級(jí)人血白蛋白+10%的臨床級(jí)右旋糖酐40+7.5%的臨床級(jí)DMSO。收獲期間檢驗(yàn)合格的CAR-T效應(yīng)細(xì)胞，生理鹽水離心洗滌2-3次，完全棄上清。加入臨床級(jí)凍存液重懸細(xì)胞（符合臨床數(shù)量級(jí)要求），制備成臨床級(jí)CAR-T注射液。灌裝Miltenyi臨床級(jí)凍存袋，制備成CAR-T注射液終產(chǎn)品（抽取部分終產(chǎn)品行放行檢驗(yàn)及樣本凍存共追溯），程序降溫，液氮凍存。7.6.2臨床級(jí)CAR-T注射液的放行檢驗(yàn)（終產(chǎn)品質(zhì)控）：外觀檢驗(yàn)：采用明亮背景下肉眼觀測(cè)法；包裝袋內(nèi)注射液應(yīng)為淡乳白色、半透明、無雜質(zhì)、無細(xì)胞團(tuán)塊。細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞活率檢驗(yàn)：采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板法或細(xì)胞計(jì)數(shù)儀法；細(xì)胞數(shù)量應(yīng)符合臨床數(shù)量級(jí)，細(xì)胞活率>90%?？焖贌o菌檢驗(yàn)：采用快速革蘭氏染色法；注射液細(xì)菌檢驗(yàn)應(yīng)為（-）。細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)：采用鱟試劑檢驗(yàn)法；注射液內(nèi)細(xì)菌毒素含量應(yīng)<0.5EU/mL。細(xì)菌真菌檢驗(yàn)：采用細(xì)菌真菌培養(yǎng)法；注射液細(xì)菌真菌檢驗(yàn)應(yīng)為（-樣本需-80℃凍存一年以上供追溯。支原體檢驗(yàn)：采用肉湯培養(yǎng)法；注射液支原體檢驗(yàn)應(yīng)為（-樣本需-80℃凍存一年以上供追溯。PH值檢驗(yàn)：采用酸度計(jì)檢驗(yàn)法；注射液PH值應(yīng)在7.35-7.45之間。滲透壓檢驗(yàn)：采用滲透壓摩爾濃度測(cè)定儀法；注射液滲透壓應(yīng)在280-310mmol/L之間。mcDNA殘留檢驗(yàn)：采用PCR法；注射液mcDNA殘留應(yīng)為（-）。0IL-15殘留檢驗(yàn)：采用ELISA檢驗(yàn)法；注射液IL-15殘留量應(yīng)<30pg/mL。7.6.3臨床級(jí)CAR-T注射液的轉(zhuǎn)運(yùn)：采用氣相液氮罐轉(zhuǎn)運(yùn)，以避免轉(zhuǎn)運(yùn)過程中凍存袋的破損風(fēng)險(xiǎn)。長(zhǎng)途轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)需注意氣相液氮罐的有效低溫時(shí)限。8臨床應(yīng)用：8.1回輸治療前需確認(rèn)急救設(shè)備（心電監(jiān)護(hù)、除顫、呼吸機(jī)、吸氧、吸痰等）及急救藥品（托珠單抗、糖皮質(zhì)激素等）已床旁準(zhǔn)備就緒。DB13/TXXXXX—XXXX8.2回輸治療前需進(jìn)行淋巴細(xì)胞刪除性化療預(yù)處理，以干擾腫瘤微環(huán)境，提高臨床療效。多采用以下方案：環(huán)磷酰胺400mg/m2靜脈輸注1次/日，第1-2天；氟達(dá)拉濱20mg/m2靜脈輸注1次/日，第1-4天；預(yù)處理完成后一周內(nèi)實(shí)施CAR-T回輸治療。8.3回輸治療前30min可預(yù)防性使用布洛芬、苯海拉明、異丙嗪等降溫、抗過敏、鎮(zhèn)靜藥物，以防止可能出現(xiàn)的高熱或過敏反應(yīng)。8.4回輸治療前需嚴(yán)格核對(duì)病人ID，仔細(xì)檢查凍存袋是否有破損和滲漏、內(nèi)容物色澤改變及異常懸浮物，一旦發(fā)現(xiàn)任何異常，需即刻聯(lián)系生產(chǎn)機(jī)構(gòu)質(zhì)控人員并終止本批次注射液的使用。8.5回輸治療時(shí)需采用不帶濾網(wǎng)的臨床級(jí)輸液器以防效應(yīng)細(xì)胞的損失，輸注速度應(yīng)掌握在10-20ml/min，避免因輸注速度過快引起的過敏反應(yīng)。8.6回輸治療期間及結(jié)束后，需嚴(yán)密觀察病情變化并及時(shí)給與相應(yīng)的對(duì)癥處理；除非出現(xiàn)危及生命的毒副反應(yīng)，一般不建議使用糖皮質(zhì)激素。9毒副反應(yīng)的處理9.1脫靶效應(yīng)（Ontarget,Offtumor）：特異性細(xì)胞免疫治療多具有明確的靶點(diǎn)（腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原但除腫瘤細(xì)胞表達(dá)這些靶點(diǎn)外正常組織也可能表達(dá)，因而可能出現(xiàn)效應(yīng)細(xì)胞同時(shí)殺傷腫瘤以外的正常組織所致的脫靶效應(yīng)。此類毒副反應(yīng)以肺損害較為多見，病人可能出現(xiàn)呼吸困難、血氧下降等臨床表現(xiàn)。治療以吸氧、吸痰、保持呼吸道通暢、呼吸機(jī)支持、抗感染等對(duì)癥治療措施為主。9.2細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokinereleasesyndrome,CRS）：CRS的發(fā)生是由于效應(yīng)細(xì)胞回輸體內(nèi)后大量增殖和靶向殺傷而釋放大量的細(xì)胞因子，形成細(xì)胞因子“風(fēng)暴”并造成多器官功能損害及衰竭。臨床主要表現(xiàn)為高熱寒戰(zhàn)、心肺功能下降、低血壓、缺氧與肺水腫、急性腎損傷等多器官功能障礙癥狀。因臨床癥狀較為兇險(xiǎn)，治療需積極而及時(shí)。一般在積極對(duì)癥治療基礎(chǔ)上合理使用細(xì)胞因子拮抗劑如托珠單抗等藥物大多能夠緩解，細(xì)胞因子拮抗劑無效時(shí)也可考慮使用糖皮質(zhì)激素治療。9.3神經(jīng)毒性：神經(jīng)毒性反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制可能是細(xì)胞因子大量進(jìn)入血腦屏障引起的神經(jīng)損害，臨床多表現(xiàn)為頭痛、神志改變、意識(shí)障礙、譫妄、幻覺等，嚴(yán)重者可能出現(xiàn)癲癇。由于托珠單抗分子量大而不易通過血腦屏障，嚴(yán)重的神經(jīng)毒性需采用糖皮質(zhì)激素類藥物及對(duì)癥處理等治療。9.4過敏反應(yīng)：各種細(xì)胞制劑的回輸治療均可能引起發(fā)熱、皮疹等類似過敏反應(yīng)的癥狀，一般高熱（>38.5℃)發(fā)