發(fā)酵過程控制

關(guān)于發(fā)酵過程控制第一節(jié)發(fā)酵過程工藝控制的目的、研究的方法和層次一發(fā)酵過程的種類分批培養(yǎng)補(bǔ)料分批培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)第2頁,共99頁，2024年2月25日，星期天1、分批發(fā)酵簡單的過程，培養(yǎng)基中接入菌種以后，沒有物料的加入和取出，除了空氣的通入和排氣。整個(gè)過程中菌的濃度、營養(yǎng)成分的濃度和產(chǎn)物濃度等參數(shù)都隨時(shí)間變化。第3頁,共99頁，2024年2月25日，星期天分批培養(yǎng)中微生物的生長遲滯期對(duì)數(shù)生長期穩(wěn)定期死亡期第4頁,共99頁，2024年2月25日，星期天1、比生長速率若細(xì)胞物質(zhì)或細(xì)胞數(shù)目增長一倍的時(shí)間間隔是常數(shù)，則微生物是以指數(shù)速率增長，可用數(shù)學(xué)模型來描述。（1）

（2）

式（1）表明，細(xì)胞物質(zhì)隨時(shí)間的增加而增加式（2）表明，細(xì)胞數(shù)目隨時(shí)間的增加而增加第5頁,共99頁，2024年2月25日，星期天

若μ為常數(shù)，則：

對(duì)式（1）積分得：

在大多數(shù)情況下，生長是以物質(zhì)的增加衡量的，因而得到應(yīng)用。

此式可在△t=td（td為倍增時(shí)間）時(shí)求得，td即在時(shí)所需時(shí)間，于是td=ln2/μ=0.693/μ。

為比生長速率，單位是h-1。第6頁,共99頁，2024年2月25日，星期天

例題：某微生物的＝0.125h-1，求td。第7頁,共99頁，2024年2月25日，星期天微生物生長分為：遲滯期、對(duì)數(shù)生長期、穩(wěn)定期和死亡期在遲滯期，菌體沒有分裂只有生長，因?yàn)楫?dāng)菌種接種入一個(gè)新的環(huán)境，細(xì)胞內(nèi)的核酸、酶等稀釋，這時(shí)細(xì)胞不能分裂。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的與細(xì)胞分裂相關(guān)的物質(zhì)濃度達(dá)到一定程度，細(xì)胞開始分裂，這時(shí)細(xì)胞生長很快，比生長速率幾近常數(shù)。這個(gè)時(shí)期稱為對(duì)數(shù)生長期第8頁,共99頁，2024年2月25日，星期天隨著細(xì)胞生長，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物減少，廢物積累，導(dǎo)致細(xì)胞生長速率下降，進(jìn)入減速期和穩(wěn)定期。最后當(dāng)細(xì)胞死亡速率大于生成速率，進(jìn)入死亡期對(duì)于初級(jí)代謝產(chǎn)物，在對(duì)數(shù)生長期初期就開始合成并積累，而次級(jí)代謝產(chǎn)物則在對(duì)數(shù)生長期后期和穩(wěn)定期大量合成。第9頁,共99頁，2024年2月25日，星期天分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)操作簡單，周期短，染菌機(jī)會(huì)少，生產(chǎn)過程和產(chǎn)品質(zhì)量容易掌握缺點(diǎn)產(chǎn)率低，不適于測定動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)第10頁,共99頁，2024年2月25日，星期天2、補(bǔ)料分批培養(yǎng)

在分批培養(yǎng)過程中補(bǔ)入新鮮的料液，以克服營養(yǎng)不足而導(dǎo)致的發(fā)酵過早結(jié)束的缺點(diǎn)。在此過程中只有料液的加入沒有料液的取出，所以發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液體積比發(fā)酵開始時(shí)有所增加。在工廠的實(shí)際生產(chǎn)中采用這種方法很多。第11頁,共99頁，2024年2月25日，星期天補(bǔ)料分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)在這樣一種系統(tǒng)中可以維持低的基質(zhì)濃度，避免快速利用碳源的阻遏效應(yīng)；可以通過補(bǔ)料控制達(dá)到最佳的生長和產(chǎn)物合成條件；還可以利用計(jì)算機(jī)控制合理的補(bǔ)料速率，穩(wěn)定最佳生產(chǎn)工藝。缺點(diǎn)由于沒有物料取出，產(chǎn)物的積累最終導(dǎo)致比生產(chǎn)速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌機(jī)會(huì)第12頁,共99頁，2024年2月25日，星期天3、半連續(xù)培養(yǎng)在補(bǔ)料分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上間歇放掉部分發(fā)酵液（帶放）稱為半連續(xù)培養(yǎng)。某些品種采取這種方式，如四環(huán)素發(fā)酵優(yōu)點(diǎn)放掉部分發(fā)酵液，再補(bǔ)入部分料液，使代謝有害物得以稀釋有利于產(chǎn)物合成，提高了總產(chǎn)量。缺點(diǎn)代謝產(chǎn)生的前體物被稀釋，提取的總體積增大第13頁,共99頁，2024年2月25日，星期天4、連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵過程中一邊補(bǔ)入新鮮料液一邊放出等量的發(fā)酵液，使發(fā)酵罐內(nèi)的體積維持恒定。達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，整個(gè)過程中菌的濃度，產(chǎn)物濃度，限制性基質(zhì)濃度都是恒定的。第14頁,共99頁，2024年2月25日，星期天連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)控制稀釋速率可以使發(fā)酵過程最優(yōu)化。發(fā)酵周期長，得到高的產(chǎn)量。由于μ＝D，通過改變稀釋速率可以比較容易的研究菌生長的動(dòng)力學(xué)缺點(diǎn)菌種不穩(wěn)定的話，長期連續(xù)培養(yǎng)會(huì)引起菌種退化，降低產(chǎn)量。長時(shí)間補(bǔ)料染菌機(jī)會(huì)大大增加。第15頁,共99頁，2024年2月25日，星期天二發(fā)酵過程工藝控制的目的有一個(gè)好的菌種以后要有一個(gè)配合菌種生長的最佳條件，使菌種的潛能發(fā)揮出來目標(biāo)是得到最大的比生產(chǎn)速率和最大的生產(chǎn)率第16頁,共99頁，2024年2月25日，星期天發(fā)揮菌種的最大生產(chǎn)潛力考慮之點(diǎn)菌種本身的代謝特點(diǎn)生長速率、呼吸強(qiáng)度、營養(yǎng)要求（酶系統(tǒng)）、代謝速率菌代謝與環(huán)境的相關(guān)性溫度、pH、滲透壓、離子強(qiáng)度、溶氧濃度、剪切力等第17頁,共99頁，2024年2月25日，星期天微生物代謝是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，它的代謝呈網(wǎng)絡(luò)形式，比如糖代謝產(chǎn)生的中間物可能用作合成菌體的前體，可能用作合成產(chǎn)物的前體，也可能合成副產(chǎn)物，而這些前體有可能流向不同的反應(yīng)方向，環(huán)境條件的差異會(huì)引發(fā)代謝朝不同的方向進(jìn)行。第18頁,共99頁，2024年2月25日，星期天微生物的生長與產(chǎn)物合成有密切相關(guān)性，不僅表現(xiàn)在菌體量的大小影響產(chǎn)物量的多少，而且菌體生長正常與否，即前期的代謝直接影響中后期代謝的正常與否。特別是對(duì)于次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成更具有復(fù)雜性因此對(duì)發(fā)酵過程的了解不能機(jī)械的，割裂的去認(rèn)識(shí)，而要從細(xì)胞代謝水平和反應(yīng)工程水平全面的認(rèn)識(shí)第19頁,共99頁，2024年2月25日，星期天發(fā)酵過程受到多因素又相互交叉的影響如菌本身的遺傳特性、物質(zhì)運(yùn)輸、能量平衡、工程因素、環(huán)境因素等等。因此發(fā)酵過程的控制具有不確定性和復(fù)雜性。為了全面的認(rèn)識(shí)發(fā)酵過程，本章首先要告訴大家分析發(fā)酵過程的基本方面，在此基礎(chǔ)上再舉一些例子，說明如何綜合分析發(fā)酵過程及進(jìn)行優(yōu)化放大。第20頁,共99頁，2024年2月25日，星期天三發(fā)酵過程研究的方法和層次1、研究方法單因子實(shí)驗(yàn)：對(duì)實(shí)驗(yàn)中要考察的因子逐個(gè)進(jìn)行試驗(yàn)，尋找每個(gè)因子的最佳條件。一般用搖瓶做實(shí)驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)一次可以進(jìn)行多種條件的實(shí)驗(yàn)，可以在較快時(shí)間內(nèi)得到的結(jié)果。缺點(diǎn)如果考察的條件多，實(shí)驗(yàn)時(shí)間會(huì)比較長各因子之間可能會(huì)產(chǎn)生交互作用，影響的結(jié)果準(zhǔn)確性第21頁,共99頁，2024年2月25日，星期天數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到最佳的實(shí)驗(yàn)條件。如正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)、響應(yīng)面設(shè)計(jì)。優(yōu)點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行多因子試驗(yàn)。用少量的實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過數(shù)理分析得到單因子實(shí)驗(yàn)同樣的結(jié)果，甚至更準(zhǔn)確，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率。但對(duì)于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求準(zhǔn)確性高，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)的最佳條件是經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法算出來的，如果實(shí)驗(yàn)中存在較大的誤差就會(huì)得出錯(cuò)誤的結(jié)果。第22頁,共99頁，2024年2月25日，星期天2、研究的層次初級(jí)層次的研究：一般在搖瓶規(guī)模進(jìn)行試驗(yàn)。主要考察目的菌株生長和代謝的一般條件，如培養(yǎng)基的組成、最適溫度、最適pH等要求。搖瓶研究的優(yōu)點(diǎn)是工作量大，可以一次試驗(yàn)幾十種甚至幾百種條件，對(duì)于菌種培養(yǎng)條件的優(yōu)化有較高的效率。第23頁,共99頁，2024年2月25日，星期天代謝及工程參數(shù)層次研究：一般在小型反應(yīng)器規(guī)模進(jìn)行試驗(yàn)。在搖瓶試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察溶氧、攪拌等搖瓶上無法考察的參數(shù)，以及在反應(yīng)器中微生物對(duì)各種營養(yǎng)成分的利用速率、生長速率、產(chǎn)物合成速率及其它一些發(fā)酵過程參數(shù)的變化，找出過程控制的最佳條件和方式。由于罐發(fā)酵中全程參數(shù)的監(jiān)控是連續(xù)的，所以得到的代謝情況比較可信。第24頁,共99頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共99頁，2024年2月25日，星期天鳥苷發(fā)酵過程曲線第26頁,共99頁，2024年2月25日，星期天生產(chǎn)規(guī)模放大：在大型發(fā)酵罐規(guī)模進(jìn)行試驗(yàn)。將小型發(fā)酵罐的優(yōu)化條件在大型反應(yīng)器上得以實(shí)現(xiàn),達(dá)到產(chǎn)業(yè)化的實(shí)現(xiàn)。一般來說微生物在不同體積的反應(yīng)器中的生長速率是不同的，原因可能是，罐的深度造成氧的溶解度、空氣停留時(shí)間和分布不同，剪切力不同，滅菌時(shí)營養(yǎng)成分破壞程度不同所致。第27頁,共99頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)發(fā)酵過程的中間分析發(fā)酵過程的中間分析是生產(chǎn)控制的眼睛，它顯示了發(fā)酵過程中微生物的主要代謝變化。因?yàn)槲⑸飩€(gè)體極微小，肉眼無法看見，要了解它的代謝狀況，只能從分析一些參數(shù)來判斷，所以說中間分析是生產(chǎn)控制的眼睛。這些代謝參數(shù)又稱為狀態(tài)參數(shù)，因?yàn)樗鼈兎从嘲l(fā)酵過程中菌的生理代謝狀況，如pH，溶氧，尾氣氧，尾氣二氧化碳，粘度，菌濃度等第28頁,共99頁，2024年2月25日，星期天代謝參數(shù)按性質(zhì)分可分三類：物理參數(shù)：溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、空氣壓力、空氣流量、溶解氧、表觀粘度、排氣氧（二氧化碳）濃度等化學(xué)參數(shù)：基質(zhì)濃度（包括糖、氮、磷）、pH、產(chǎn)物濃度、核酸量等生物參數(shù)：菌絲形態(tài)、菌濃度、菌體比生長速率、呼吸強(qiáng)度、基質(zhì)消耗速率、關(guān)鍵酶活力等第29頁,共99頁，2024年2月25日，星期天從檢測手段分可分為：直接參數(shù)、間接參數(shù)直接參數(shù)：通過儀器或其它分析手段可以測得的參數(shù)，如溫度、pH、殘?zhí)堑乳g接參數(shù)：將直接參數(shù)經(jīng)過計(jì)算得到的參數(shù)，如攝氧率、KLa(氧傳遞系數(shù))等第30頁,共99頁，2024年2月25日，星期天直接參數(shù)又可分為在線檢測參數(shù)和離線檢測參數(shù)在線檢測參數(shù)指不經(jīng)取樣直接從發(fā)酵罐上安裝的儀表上得到的參數(shù)，如溫度、pH、攪拌轉(zhuǎn)速；離線檢測參數(shù)指取出樣后測定得到的參數(shù)，如殘?zhí)?、NH2-N、菌體濃度。第31頁,共99頁，2024年2月25日，星期天一發(fā)酵過程主要分析的項(xiàng)目目前發(fā)酵過程主要分析項(xiàng)目如下1、pHpH與微生物的生命活動(dòng)密切相關(guān)——酶催化活性

pH的變化又是微生物代謝狀況的綜合反映——基質(zhì)代謝、產(chǎn)物合成、細(xì)胞狀態(tài)、營養(yǎng)狀況、供氧狀況第32頁,共99頁，2024年2月25日，星期天2、排氣氧、排氣CO2和呼吸熵排氣氧的濃度表征了進(jìn)氣的氧被微生物利用以后還剩余的氧，因此排氣氧的大小反映了菌生長的活性，通過計(jì)算可以求得攝氧率（OUR）。OUR=Qo2XQo2為呼吸強(qiáng)度，X為菌濃度排氣二氧化碳反映了微生物代謝的情況，因?yàn)槲⑸飻z入的氧并不是全部變成二氧化碳的，有的進(jìn)入代謝中間物分子，進(jìn)入細(xì)胞或產(chǎn)物，因此消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有機(jī)物降解后會(huì)產(chǎn)生二氧化碳，使排氣二氧化碳大于消耗的氧。第33頁,共99頁，2024年2月25日，星期天RQ值隨微生物菌種的不同，培養(yǎng)基成分的不同，生長階段的不同而不同。測定RQ值一方面可以了解微生物代謝的狀況，另一方面也可以指導(dǎo)補(bǔ)料CER表示單位體積發(fā)酵液單位時(shí)間內(nèi)釋放的二氧化碳的量呼吸熵呼吸熵反映了氧的利用狀況第34頁,共99頁，2024年2月25日，星期天

一般在發(fā)酵中后期為保證產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物，有意使菌體處于半饑餓狀態(tài)，在營養(yǎng)限制的條件下，維持產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物的速率在較高水平。對(duì)于這種工藝，后期的補(bǔ)料控制是關(guān)鍵。過程中發(fā)現(xiàn)，在補(bǔ)糖開始時(shí)，不但CER、OUR大幅度提高，連RQ也提高約10％，表明通過補(bǔ)糖不但提供了更多的碳源，而且隨著體系內(nèi)葡萄糖濃度提高，糖代謝相關(guān)酶活力也提高，產(chǎn)能增加。第35頁,共99頁，2024年2月25日，星期天3、糖含量微生物生長和產(chǎn)物合成與糖代謝有密切關(guān)系。糖的消耗反映產(chǎn)生菌的生長繁殖情況反映產(chǎn)物合成的活力菌體生長旺盛糖耗一定快，殘?zhí)且簿徒档偷每臁Ｍㄟ^糖含量的測定，可以控制菌體生長速率，可控制補(bǔ)糖來調(diào)節(jié)pH，促進(jìn)產(chǎn)物合成，不致于盲目補(bǔ)糖，造成發(fā)酵不正常。糖含量測定包括總糖和還原糖。

總糖指發(fā)酵液中殘留的各種糖的總量。如發(fā)酵中的淀粉、飴糖、單糖等各種糖。

還原糖指含有自由醛基的單糖，通常指的是葡萄糖。第36頁,共99頁，2024年2月25日，星期天4、氨基氮和氨氮氨基氮指有機(jī)氮中的氮（NH2-N），單位是mg/100ml。如氨基酸中的氮，黃豆餅粉、花生餅粉中都有有機(jī)氮。氨氮指無機(jī)氨中的氮（NH3-N）。氮利用快慢可分析出菌體生長情況，含氮產(chǎn)物合成情況。但是氮源太多會(huì)促使菌體大量生長。有些產(chǎn)物合成受到過量銨離子的抑制，因此必須控制適量的氮。通過氨基氮和氨氮的分析可控制發(fā)酵過程，適時(shí)采取補(bǔ)氨措施。發(fā)酵后期氨基氮回升，這時(shí)就要放罐，否則影響提取過程。第37頁,共99頁，2024年2月25日，星期天5、磷含量微生物體內(nèi)磷含量較高，培養(yǎng)基中以磷酸鹽為主，發(fā)酵中用來計(jì)算磷含量的是磷酸根。磷是核酸的組成部分，是高能化合物ATP的組成部分，磷還能促進(jìn)糖代謝。因此磷在培養(yǎng)基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取補(bǔ)磷措施。第38頁,共99頁，2024年2月25日，星期天6、菌濃度和菌形態(tài)菌形態(tài)和菌濃度直接反映菌生長的情況。菌形態(tài)顯微鏡觀察菌濃度的測定是衡量產(chǎn)生菌在整個(gè)培養(yǎng)過程中菌體量的變化，一般前期菌濃增長很快，中期菌濃基本恒定。補(bǔ)料會(huì)引起菌濃度的波動(dòng)，這也是衡量補(bǔ)料量適合與否的一個(gè)參數(shù)。第39頁,共99頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共99頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共99頁，2024年2月25日，星期天菌濃測定方法測粘度壓縮體積法（離心）靜置沉降體積法光密度測定法OD600~660

適合于細(xì)菌、酵母第42頁,共99頁，2024年2月25日，星期天7、產(chǎn)物濃度

在培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生菌的合成能力和產(chǎn)物積累情況都要通過產(chǎn)物量的測定來了解，產(chǎn)物濃度直接反映了生產(chǎn)的狀況,是發(fā)酵控制的重要參數(shù)。而且通過計(jì)算還可以得到生產(chǎn)速率和比生產(chǎn)速率，從而分析發(fā)酵條件如補(bǔ)料、pH對(duì)產(chǎn)物形成的影響。第43頁,共99頁，2024年2月25日，星期天二產(chǎn)物量的測定（一）產(chǎn)物量的特殊表示法1、抗生素效價(jià)的表示抗生素效價(jià)表示抗生素的有效成分的多少，效價(jià)大小用單位（U）來表示效價(jià)表示方法：重量折算法重量單位類似重量單位特殊單位第44頁,共99頁，2024年2月25日，星期天重量折算單位：以最低抑菌濃度為一個(gè)單位，如青霉素0.6微克＝1U重量單位：規(guī)定某些抗生素活性部分1μg=1u如鏈霉素、卡那霉素、紅霉素等定義活性部分1μg＝1u第45頁,共99頁，2024年2月25日，星期天類似重量單位：規(guī)定抗生素的某種鹽1mg=1000u如金霉素、四環(huán)素的鹽酸鹽定義為1μg＝1u特殊單位：藥檢所制定某些抗生素的單位制霉菌素1mg=3700u多粘菌素B1mg=10000u第46頁,共99頁，2024年2月25日，星期天2、酶活力的表示法酶活力用單位來表示。由于酶通常不是很純，不能用重量來表示酶的量。同一種酶用不同的方法測定會(huì)有不同的酶活單位，容易造成混亂，為此國際上作了統(tǒng)一規(guī)定，規(guī)定在250C下，以最適的底物濃度，最適的緩沖液離子強(qiáng)度，以及最適的pH諸條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一微克分子底物的酶定量為一個(gè)活性單位。第47頁,共99頁，2024年2月25日，星期天（二）產(chǎn)物量的測定1、化學(xué)法（1）滴定法產(chǎn)物能使一定指示劑變色來指示反應(yīng)終點(diǎn)的可用滴定法如青霉素在堿性條件下加入過量的I2，反應(yīng)生成青霉噻唑酸碘，用Na2S2O3滴定多余的碘，可計(jì)算出青霉素的單位檸檬酸可以用NaOH滴定來計(jì)算檸檬酸產(chǎn)量第48頁,共99頁，2024年2月25日，星期天（2）比色法產(chǎn)物經(jīng)一定化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生顏色，且顏色深淺與產(chǎn)物濃度成正比，可以用比色法測定。淀粉酶活力測定：在1%可溶性淀粉溶液中加入淀粉酶，所釋放出的麥芽糖與生色試劑（3，5-二硝基水楊酸與酒石酸鉀鈉的堿溶液）產(chǎn)生顏色，它在540nm處所得吸光度跟淀粉酶活力成正比。第49頁,共99頁，2024年2月25日，星期天（3）測壓法產(chǎn)物特定反應(yīng)放出或攝入氣體，使系統(tǒng)有壓力變化，可以通過測定壓力變化得知產(chǎn)物量。2、物理法許多酶、抗生素都有不對(duì)稱碳原子，具有旋光性，因此可以通過測定旋光度來測定酶或抗生素的含量。谷氨酸γ－氨基丁酸＋CO2第50頁,共99頁，2024年2月25日，星期天化學(xué)和物理方法優(yōu)點(diǎn)：快速、方便，經(jīng)常用于過程分析缺點(diǎn)產(chǎn)品中存在的雜質(zhì)會(huì)干擾測定結(jié)果，因此抗生素成品的測定用生物法測定。

適用于抗生素效價(jià)的測定

生物法以抗生素的殺菌能力為衡量效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)，其原理恰好與臨床應(yīng)用的要求相一致，而且此法靈敏度高，需用的檢品量較小，這是其它方法不能比的。但此法得到結(jié)果比較慢，需經(jīng)過16~18小時(shí)培養(yǎng)。生物法常用于發(fā)酵終了產(chǎn)品效價(jià)的測定。3、生物法第51頁,共99頁，2024年2月25日，星期天常用的生物法測定抗生素，采用杯碟法“杯”是放被測抗生素的不銹鋼小管，小管內(nèi)徑為6mm，高10mm的圓筒形管子，管子的重量盡可能相等。碟是攤布培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)皿。操作方法是：將已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基加熱到完全融化，倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，每碟15ml（下層），待其凝固。此外，將融化的培養(yǎng)基冷卻到500C左右混入試驗(yàn)菌，將混有菌的培養(yǎng)基5ml加到已凝固的培養(yǎng)基上待凝固（上層）。

第52頁,共99頁，2024年2月25日，星期天在培養(yǎng)基表面垂直放上小杯，在杯中加入待檢樣品，加滿后在370C培養(yǎng)16~18小時(shí)。在培養(yǎng)中,一方面試驗(yàn)菌開始生長另一方面抗生素呈球面擴(kuò)散，離杯越近，抗生素濃度越大，離杯越遠(yuǎn)抗生素濃度越小。隨著抗生素濃度減小，有一條最低抑菌濃度帶，在帶范圍內(nèi)，菌不能生長，而呈透明的圓圈，這就叫“抑菌圈”?？股貪舛仍礁撸志υ酱?，第53頁,共99頁，2024年2月25日，星期天r:抑菌圈的半徑(毫米）M：抗生素在管中的量（單位）C：最低抑菌濃度（單位/毫升）H：培養(yǎng)基的厚度（毫米）L：管子的高度（毫米）D：抗生素的擴(kuò)散系數(shù)（毫米/小時(shí)）T：細(xì)菌生長到肉眼所用的時(shí)間（小時(shí)）第54頁,共99頁，2024年2月25日，星期天抗生素濃度與抑菌圈的半徑成一定數(shù)學(xué)關(guān)系logM=(1/9.21DT)r2+log(C.4πDTH)抗生素的總量的對(duì)數(shù)值與抑菌圈半徑的平方呈正比。此外還受C、H、D、T的影響但是C、H、D、T是無法測量的，在實(shí)際計(jì)算中要設(shè)法消去第55頁,共99頁，2024年2月25日，星期天一般的消去方法有二劑量法標(biāo)準(zhǔn)曲線法第56頁,共99頁，2024年2月25日，星期天兩劑量法：標(biāo)準(zhǔn)品低單位總量:m抑菌圈半徑SL標(biāo)準(zhǔn)品高單位總量:M抑菌圈半徑：SH樣品高單位總量:M’抑菌圈半徑UH樣品低單位總量:m’抑菌圈半徑：UL已知：令：得出：→→第57頁,共99頁，2024年2月25日，星期天logM’—logM＝_logM’/M=同理logm’—logm=logm’/m==logθ=logθ2logθ=第58頁,共99頁，2024年2月25日，星期天logM’—logm’=logM’/m’==logKlogM—logm=logM/m==logK2logK=第59頁,共99頁，2024年2月25日，星期天標(biāo)準(zhǔn)曲線法優(yōu)點(diǎn)：在一個(gè)碟子上可以同時(shí)做兩個(gè)樣品的效價(jià)，當(dāng)要做的樣品量大時(shí)，采取標(biāo)準(zhǔn)曲線法可以提高效率。假設(shè)選用的濃度為：3U，4U，5U，6U,7U中心點(diǎn)是5U1122第60頁,共99頁，2024年2月25日，星期天每個(gè)濃度做三個(gè)碟子。5U為中心點(diǎn)，每個(gè)碟子中有3個(gè)杯中加中心點(diǎn)濃度，其余3個(gè)加其它濃度。測得抑菌圈后，將濃度和抑菌圈平均直徑做標(biāo)準(zhǔn)曲線。第61頁,共99頁，2024年2月25日，星期天logMr第62頁,共99頁，2024年2月25日，星期天管碟法影響因素的討論：斜率小D、T大,誤差小截距小C、D、T、H小，誤差小第63頁,共99頁，2024年2月25日，星期天logMrlogM1r1r1r1第64頁,共99頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基厚度H越小，其它條件相同時(shí)r越大。影響H的因素：培養(yǎng)基的厚度細(xì)菌生長到肉眼所需的時(shí)間T越大在其它條件相同時(shí)，r越大影響T的因素：菌體本身，及影響菌體生長的條件如：接種量，培養(yǎng)溫度、及營養(yǎng)環(huán)境其它影響因素：上層鋪得平整、菌液加入時(shí)的溫度、鋼圈的放置、滴液第65頁,共99頁，2024年2月25日，星期天在線檢測必須用專門的傳感器（也叫電極或探頭）放入發(fā)酵系統(tǒng)，將發(fā)酵的一些信息傳遞出來，為發(fā)酵控制提供依據(jù)。一參數(shù)在線檢測由于微生物培養(yǎng)過程是純培養(yǎng)過程，無菌要求高，因此對(duì)傳感器有特殊要求：插入罐內(nèi)的傳感器必須能經(jīng)受高壓蒸汽滅菌（材料、數(shù)據(jù)）傳感器結(jié)構(gòu)不能存在滅菌不透的死角，以防染菌（密封性好）傳感器對(duì)測量參數(shù)要敏感，且能轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。（響應(yīng)快、靈敏）傳感器性能要穩(wěn)定，受氣泡影響小。第66頁,共99頁，2024年2月25日，星期天氨是酶反應(yīng)中最常見的產(chǎn)物和反應(yīng)物，氨離子可用氨氣敏電極來測定。CO2電極（測溶液中的CO2）結(jié)構(gòu)與氨電極類似。測量CO2時(shí)，氣體透過電極膜，CO2和水反應(yīng)，達(dá)到以下平衡：pH電極溶氧電極它們是基礎(chǔ)電極，以它們?yōu)榛A(chǔ)可以制作各種離子電極和酶電極CO2+H2OHCO3-+H+第67頁,共99頁，2024年2月25日，星期天什么因素導(dǎo)致pH下降？1、有機(jī)酸的積累有機(jī)酸積累pH下降補(bǔ)加氨水在正常代謝情況下，細(xì)胞通過EMP途徑和TCA循環(huán)的過程是為細(xì)胞合成提供前體和能量的，按照細(xì)胞經(jīng)濟(jì)學(xué)的原則不會(huì)供過于求，即不會(huì)出現(xiàn)有機(jī)酸的積累若發(fā)酵后期有機(jī)酸積累會(huì)引起加入的[NH4+]積累，相應(yīng)出現(xiàn)產(chǎn)苷速率下降?！x不正常第68頁,共99頁，2024年2月25日，星期天測定以下中間物發(fā)酵后期丙酮酸積累第69頁,共99頁，2024年2月25日，星期天2、氨基酸的積累在有機(jī)酸分析的基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過HPLC測定發(fā)酵過程中不同時(shí)間發(fā)酵液中氨基酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總氨基酸積累并且其積累晚于有機(jī)酸和[NH4+]積累。第70頁,共99頁，2024年2月25日，星期天氨基酸成分分析表明，初始發(fā)酵液中谷氨酸濃度比較高，其它氨基酸濃度都較低，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行谷氨酸很快被用于菌體合成，在8小時(shí)之前已經(jīng)降到很低水平，并始終維持在低水平，而在48小時(shí)左右丙氨酸開始出現(xiàn)明顯的積累，發(fā)酵液中積累量達(dá)到初始量的12.6倍之多，其它十余種氨基酸濃度則變化不大，并且在整個(gè)發(fā)酵過程中都維持在較低水平。因此，丙氨酸濃度變化可能是導(dǎo)致代謝流遷移所致。第71頁,共99頁，2024年2月25日，星期天3、分析原因發(fā)酵過程中積累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸轉(zhuǎn)化而來，因此可以推斷由于EMP途徑代謝流的增加造成了丙酮酸的積累，丙酮酸隨后轉(zhuǎn)化為丙氨酸丙氨酸本身又會(huì)對(duì)谷氨酸合成酶（GS）造成反饋抑制和阻遏，使產(chǎn)苷速率降低。第72頁,共99頁，2024年2月25日，星期天丙酮酸積累氨水補(bǔ)加增加[NH4+]積累抑制GS抑制TCA循環(huán)丙酮酸積累激活磷酸果糖激酶EMP流量增加惡性循環(huán)丙氨酸積累第73頁,共99頁，2024年2月25日，星期天（二）代謝流遷移的酶學(xué)證明糖代謝途徑關(guān)鍵酶糖酵解途徑（EMP）在糖酵解途徑中有兩個(gè)不可逆的步驟的酶：磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶磷酸果糖激酶的時(shí)序分析第74頁,共99頁，2024年2月25日，星期天12小時(shí)時(shí)由于生長處于對(duì)數(shù)生長初期，代謝活力較低，所以PFK的活力相對(duì)較低。24小時(shí)后隨著發(fā)酵過程進(jìn)入平穩(wěn)產(chǎn)物形成期和細(xì)胞生長期，磷酸果糖激酶的活力也基本保持平穩(wěn)。但是到40小時(shí)以后，鳥苷形成速率減慢甚至停止，同時(shí)觀察到氨基酸和有機(jī)酸積累，PFK相對(duì)酶活增加，這表明此時(shí)通過EMP途徑的糖代謝通量已有了明顯的增加。第75頁,共99頁，2024年2月25日，星期天丙酮酸激酶時(shí)序分析第76頁,共99頁，2024年2月25日，星期天丙酮酸激酶沒有表現(xiàn)出明顯的酶活增加，而是在24小時(shí)就基本上達(dá)到其最大值，隨后維持在恒定的水平，這表明在糖代謝時(shí)EMP途徑代謝流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代謝流遷移的主要因素磷酸戊糖途徑（HMP）關(guān)鍵酶磷酸戊糖途徑中主要的限速酶是6－磷酸葡萄糖脫氫酶，該酶催化6－磷酸葡萄糖脫氫生成6－磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯。第77頁,共99頁，2024年2月25日，星期天6－磷酸葡萄糖脫氫酶時(shí)序分析由圖可以看到，早期6－磷酸葡萄糖脫氫酶活力很高，這可能是前期菌體合成代謝比較活躍，通過HMP途徑合成用于細(xì)胞成分的核酸等組成物質(zhì)；隨后基本不變，從而保持EMP和HMP途徑通量的平衡，此時(shí)穩(wěn)定持續(xù)的形成產(chǎn)物；但是到40小時(shí)后，6－磷酸葡萄糖脫氫酶已經(jīng)表現(xiàn)出明顯的下降趨勢，并且隨著后期發(fā)酵過程的進(jìn)行而持續(xù)下降。根據(jù)物料平衡原則，有可能糖代謝在HMP途徑通量下降而EMP途徑通量增加。第78頁,共99頁，2024年2月25日，星期天三羧酸(TCA)循環(huán)的關(guān)鍵酶三羧酸循環(huán)是“消耗”丙酮酸的途徑，三羧酸流量大丙酮酸不會(huì)積累。三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶為檸檬酸合成酶，其催化乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合形成檸檬酸，是三羧酸循環(huán)的啟動(dòng)步驟，也是三羧酸循環(huán)中的主要控制點(diǎn)，由檸檬酸合成酶所催化的反應(yīng)是三羧酸循環(huán)中的第一個(gè)限速步驟。第79頁,共99頁，2024年2月25日，星期天檸檬酸合成酶時(shí)序分析第80頁,共99頁，2024年2月25日，星期天從圖可以看到，TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶檸檬酸合成酶在整個(gè)發(fā)酵過程中，尤其是在后期產(chǎn)苷速率下降的過程中都維持比較平穩(wěn)的水平，這表明在發(fā)酵過程后期所發(fā)生的代謝流遷移時(shí)，TCA循環(huán)的通量并沒有發(fā)生明顯的增加。即代謝流遷移發(fā)生在EMP和HMP之間，主要是由于EMP和HMP途徑之間的分配平衡被打破所造成的。EMP途徑代謝流的增加造成了一種代謝流的溢流現(xiàn)象。第81頁,共99頁，2024年2月25日，星期天丙氨酸脫氫酶的時(shí)序分析第82頁,共99頁，2024年2月25日，星期天在發(fā)酵中后期，丙氨酸脫氫酶活力出現(xiàn)了明顯的增加。丙氨酸脫氫酶催化由丙酮酸生成丙氨酸，該酶活性增加與丙酮酸和丙氨酸的時(shí)序增加相吻合，這些數(shù)據(jù)表明代謝流的溢流現(xiàn)象發(fā)生在檸檬酸合成酶之前的丙酮酸節(jié)點(diǎn)，通過丙氨酸脫氫酶生成丙氨酸，從而緩解了EMP途徑代謝流增加造成的代謝不平衡。結(jié)果加入EMP途徑的抑制劑，克服了代謝流遷移的問題，提高了鳥苷的產(chǎn)量第83頁,共99頁，2024年2月25日，星期天（三）與產(chǎn)物合成相關(guān)的酶和中間物測定例：螺旋霉素生物合成的代謝研究第84頁,共99頁，2024年2月25日，星期天圖3螺旋霉素生物合成代謝網(wǎng)絡(luò)途徑

第85頁,共99頁，2024年2月25日，星期天圖1螺旋霉素生物合成中間物動(dòng)態(tài)流量分布圖

哪個(gè)代謝中間物過多積累第86頁,共99頁，2024年2月25日，星期天在發(fā)酵后期有FO-Ⅱ積累，要減少FO-Ⅰ轉(zhuǎn)化為FO-Ⅱ必須降低C3?；傅幕盍?，但這與SPⅡ、SPⅢ合成有矛盾在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，SP-Ⅰ還有一定的積累，如能最大限度的轉(zhuǎn)化為SP-Ⅱ、SP-Ⅲ，即加強(qiáng)步驟3對(duì)發(fā)酵效率和發(fā)酵效價(jià)是有積極意義的。而FO-Ⅱ、NSP-Ⅱ的最終積累則導(dǎo)致流量浪費(fèi)，因?yàn)檫@兩種物質(zhì)最終不能轉(zhuǎn)化為目的產(chǎn)物。因此必須減小步驟4的通量。但由于這幾個(gè)步驟的轉(zhuǎn)化都是由C3?；复呋磻?yīng)，這給改變通量帶來一定的困難。第87頁,共99頁，2024年2月25日，星期天圖2有機(jī)酸前體的動(dòng)態(tài)流量分布圖第88頁,共99頁，2024年2月25日，星期天在圖2中，乙酸和丁酸在從40小時(shí)開始積累并在64小時(shí)達(dá)到最高值，對(duì)照?qǐng)D3螺旋霉素生物合成代謝網(wǎng)絡(luò)途徑[9]，我們可以推測在發(fā)酵中前期在圖3中的步驟1也即大環(huán)成環(huán)步驟有一定程度的“瓶頸”影響，從而導(dǎo)致乙酸、丁酸有一定的積累。若能加強(qiáng)這一步驟的通量，應(yīng)能提高代謝網(wǎng)絡(luò)的通量，提高螺旋霉素的效價(jià)。我們測定了內(nèi)酯環(huán)合成相關(guān)的酶活——前體的活化第89頁,共99頁，2024年2月25日，星期天