水處理微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書樣本

水解決微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指引書班級姓名學(xué)號市政與環(huán)境工程學(xué)院年月目錄實(shí)驗(yàn)一顯微鏡、測微尺使用及生物相觀測實(shí)驗(yàn)二革蘭氏染色技術(shù)實(shí)驗(yàn)三培養(yǎng)基配制和滅菌實(shí)驗(yàn)四水中細(xì)菌總數(shù)測定實(shí)驗(yàn)一顯微鏡、測微尺使用及生物相觀測一、實(shí)驗(yàn)?zāi)颗c規(guī)定理解普通光學(xué)顯微鏡構(gòu)造與功能，學(xué)習(xí)與掌握顯微鏡觀測微生物辦法。觀測細(xì)菌、放線菌和藍(lán)細(xì)菌個(gè)體形態(tài)，學(xué)會繪制微生物形態(tài)構(gòu)造圖。二、顯微鏡基本構(gòu)造和功能普通光學(xué)顯微鏡是一種精密光學(xué)儀器。以往最簡樸顯微鏡僅由幾塊透鏡構(gòu)成，而當(dāng)前使用顯微鏡由一套透鏡構(gòu)成。普通光學(xué)顯微鏡普通能將物體放大1500—倍。（一）顯微鏡構(gòu)造普通光學(xué)顯微鏡構(gòu)造可分為兩大某些：一為機(jī)械裝置，一為光學(xué)系統(tǒng)，這兩某些較好配合，才干發(fā)揮顯微鏡作用。1、顯微鏡機(jī)械裝置顯微鏡機(jī)械裝置涉及鏡座、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺、推動器、粗動螺旋、微動螺旋等部件。（1）鏡座

鏡座是顯微鏡基本支架，它由底座和鏡臂兩某些構(gòu)成。在它上面連接有載物臺和鏡筒，它是用來安裝光學(xué)放大系統(tǒng)部件基本。

（2）鏡筒

鏡筒上接接目鏡，下接轉(zhuǎn)換器，形成接目鏡與接物鏡（裝在轉(zhuǎn)換器下）間暗室。從物鏡后緣到鏡筒尾端距離稱為機(jī)械筒長。由于物鏡放大率是對一定鏡筒長度而言。鏡筒長度變化，不但放大倍率隨之變化，并且成像質(zhì)量也受到影響。因而，使用顯微鏡時(shí)，不能任意變化鏡筒長度。國際上將顯微鏡原則筒長定為160mm，此數(shù)字標(biāo)在物鏡外殼上。

（3）物鏡轉(zhuǎn)換器

物鏡轉(zhuǎn)換器上可安裝3—4個(gè)接物鏡，普通是三個(gè)接物鏡（低倍、高倍、油鏡）。Nikon顯微鏡裝有四個(gè)物鏡。轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，可以按需要將其中任何一種接物鏡和鏡筒接通，與鏡筒上面接目鏡構(gòu)成一種放大系統(tǒng)。

（4）載物臺

載物臺中央有一孔，為光線通路。在臺上裝有彈簧標(biāo)本夾和推動器，其作用為固定或移動標(biāo)本位置，使得鏡檢對象正好位于視野中心。

（5）推動器

是移動標(biāo)本機(jī)械裝置，它是由一橫一縱兩個(gè)推動齒軸金屬架構(gòu)成，好顯微鏡在縱橫架桿上刻有刻度標(biāo)尺，構(gòu)成很精密平面座標(biāo)系。如果咱們須重復(fù)觀測已檢查標(biāo)本某一某些，在第一次檢查時(shí)，可記下縱橫標(biāo)尺數(shù)值，后來按數(shù)值移動推動器，就可以找到本來標(biāo)本位置。

（6）粗動螺旋

粗動螺旋是移動鏡筒調(diào)節(jié)接物鏡和標(biāo)本間距離機(jī)件，老式顯微鏡粗螺旋向前扭，鏡頭下降接近標(biāo)本。新近出產(chǎn)顯微鏡（如Nikon顯微鏡）鏡檢時(shí)，右手向前扭載物臺上升，讓標(biāo)本接近物鏡，反之則下降，標(biāo)本脫離物鏡。

（7）微動螺旋

用粗動螺旋只可以粗放調(diào)節(jié)焦距，要得到最清晰物象，需要用微動螺旋做進(jìn)一步調(diào)節(jié)。微動螺旋每轉(zhuǎn)一圈鏡筒移動0.1毫米（100微米）。新近出產(chǎn)較高檔次顯微鏡粗動螺旋和微動螺旋是共軸。2、顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)由反光鏡，聚光器，接物鏡，接目鏡等構(gòu)成，光學(xué)系統(tǒng)使物體放大，形成物體放大像。

（1）反光鏡

較早普通光學(xué)顯微鏡是用自然光檢視物體，在鏡座上裝有反光鏡。反光鏡是由一平面和另一凹面鏡子構(gòu)成，可以將投射在它上面光線反射到聚光器透鏡中央，照明標(biāo)本。不用聚光器時(shí)用凹面鏡，凹面鏡能起會聚光線作用。用聚光器時(shí)，普通都用平面鏡。新近出產(chǎn)較高檔次顯微鏡鏡座上裝有光源，并有電流調(diào)節(jié)螺旋，可通過調(diào)節(jié)電流大小調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度。

（2）聚光器

聚光器在載物臺下面，它是由聚光透鏡、虹彩光圈和升降螺旋構(gòu)成。聚光器可分為明視場聚光器和暗視場聚光器。普通光學(xué)顯微鏡配備都是明視場聚光器，明視場聚光器有阿貝聚光器、齊明聚光器和搖出聚光器。阿貝聚光器在物鏡數(shù)值孔徑高于0.6時(shí)會顯示出眾差和球差。齊明聚光器對色差、球差和慧差校正限度很高，是明視場鏡檢中質(zhì)量最佳聚光器，但它不適于4倍如下物鏡。搖出聚光器能將聚光器上透鏡從光路中搖出滿足低倍物鏡（4×）大視場照明需要。聚光器安裝在載物臺下，其作用是將光源經(jīng)反光鏡反射來光線聚焦于樣品上，以得到最強(qiáng)照明，使物象獲得明亮清晰效果。聚光器高低可以調(diào)節(jié)，使焦點(diǎn)落在被檢物體上，以得到最大亮度。普通聚光器焦點(diǎn)在其上方1.25mm處，而其上升限度為載物臺平面下方0.1mm。因而，規(guī)定使用載玻片厚度應(yīng)在0.8—1.2mm之間，否則被檢樣品不在焦點(diǎn)上，影響鏡檢效果。聚光器前透鏡組前面還裝有虹彩光圈，它可以開大和縮小，影響著成像辨別力和反差，若將虹彩光圈開放過大，超過物鏡數(shù)值孔徑時(shí)，便產(chǎn)生光斑；若收縮虹彩光圈過小，辨別力下降，反差增大。因而，在觀測時(shí)，通過虹彩光圈調(diào)節(jié)再把視場光闌（帶有視場光闌顯微鏡）啟動到視場周緣外切處，使不在視場內(nèi)物體得不到任何光線照明，以避免散射光干擾。

（3）物鏡

安裝在鏡筒前端轉(zhuǎn)換器上接物透鏡運(yùn)用光線使被檢物體第一次造像，物鏡成像質(zhì)量，對辨別力有著決定性影響。物鏡性能取決于物鏡數(shù)值孔徑（numericalapeature簡寫為NA），每個(gè)物鏡數(shù)值孔徑都標(biāo)在物鏡外殼上，數(shù)值孔徑越大，物鏡性能越好。物鏡種類諸多，可從不同角度來分類：依照物鏡前透鏡與被檢物體之間介質(zhì)不同，可分為：①干燥系物鏡

以空氣為介質(zhì)，如慣用40×如下物鏡，數(shù)值孔徑均不大于1。②油浸系物鏡

常以香柏油為介質(zhì)，此物鏡又叫油鏡頭，其放大率為90×—100×，數(shù)值孔值不不大于1。依照物鏡放大率高低，可分為：①低倍物鏡

指1×—6×，NA值為0.04—0.15；②中倍物鏡

指6×—25×，NA值為0.15—0.40；③高倍物鏡

指25×—63×，NA值為0.35—0.95；④油浸物鏡

指90×—100×，NA值為1.25—1.40。依照物鏡像差校正限度來分類可分為：①消色差物鏡

是最慣用物鏡，外殼上標(biāo)有“Ach”字樣，該物鏡可以除紅光和青光形成色差。鏡檢時(shí)普通與惠更斯目鏡配合使用。②復(fù)消色差物鏡

物鏡外殼上標(biāo)有“Apo”字樣，除能校正紅、藍(lán)、綠三色光色差外，還能校正黃色光導(dǎo)致相差，普通與補(bǔ)償目鏡配合使用。③特種物鏡

在上述物鏡基本上，為達(dá)到某些特定觀測效果而制造物鏡。如：帶校正環(huán)物鏡，帶視場光闌物鏡，相差物鏡，熒光物鏡，無應(yīng)變物鏡，無罩物鏡，長工作距離物鏡等。當(dāng)前在研究中慣用物鏡尚有：半復(fù)消色差物鏡（FL），平場物鏡(Plan)，平場復(fù)消色差物鏡（PlanApo）,超平場物鏡（Splan，超平場復(fù)消色差物鏡（SplanApo）等。

（4）目鏡

目鏡作用是把物鏡放大了實(shí)像再放大一次，并把物像映入觀測者眼中。目鏡構(gòu)造較物鏡簡樸，普通光學(xué)顯微鏡目鏡普通由兩塊透鏡構(gòu)成，上端一塊透鏡稱“接目鏡”，下端透鏡稱“場鏡”。上下透鏡之間或在兩個(gè)透鏡下方，裝有由金屬制環(huán)狀光闌或叫“視場光闌”，物鏡放大后中間像就落在視場光闌平面處，因此其上可安頓目鏡測微尺。普通光學(xué)顯微鏡慣用目鏡為惠更斯目鏡（Huygenseyepiece），如要進(jìn)行研究用時(shí)，普通選用性能更好目鏡，如補(bǔ)償目鏡（K）、平場目鏡（P）、廣視場目鏡（WF）。照相時(shí)選用照相目鏡（NFK）。（二）光學(xué)顯微鏡成像原理顯微鏡放大是通過透鏡來完畢，單透鏡成像具備像差，影響像質(zhì)。由單透鏡組合而成透鏡組相稱于一種凸透鏡，放大作用更好。（三）顯微鏡性能顯微鏡辨別能力高低決定于光學(xué)系統(tǒng)各種條件。被觀測物體必要放大率高，并且清晰，物體放大后，能否呈現(xiàn)清晰細(xì)微構(gòu)造，一方面取決于物鏡性能，另一方面為目鏡和聚光鏡性能。

1、數(shù)值孔徑也叫做鏡口率（或開口率），簡寫為N.A，在物鏡和聚光器上都標(biāo)有它們數(shù)值孔徑，數(shù)值孔徑是物鏡和聚光器重要參數(shù)，也是判斷它們性能最重要指標(biāo)。數(shù)值孔徑和顯微鏡各種性能有密切關(guān)系，它與顯微鏡辨別力成正比，與焦深成反比，與鏡象亮度平方根成正比。數(shù)值孔徑可用下式表達(dá)：N.A=n.sinα2式中：n—物鏡與標(biāo)本之間介質(zhì)析射率α—物鏡鏡口角所謂鏡口角是指從物鏡光軸上物點(diǎn)發(fā)出光線與物鏡前透鏡有效直徑邊沿所張角度。鏡口角α總是不大于180°。由于空氣折射率為1，因此干燥物鏡數(shù)值孔徑總是不大于1，普通為0.05—0.95；油浸物鏡如用香柏油（折射率為1.515）浸沒，則數(shù)值孔徑最大可接近1.5。雖然理論上數(shù)值孔徑極限等于所用浸沒介質(zhì)折射率，但事實(shí)上從透鏡制造技術(shù)看，是不也許達(dá)到這一極限。普通在實(shí)用范疇內(nèi)，高檔油浸物鏡最大數(shù)值孔徑是1.4。幾種物質(zhì)介質(zhì)折射率如下：空氣為1.0，水為1.33，玻璃為1.5，甘油為1.47，香柏油為1.52。

2、辨別力D可用下式表達(dá)：D=λ/2N.A.可見光波長為0.4—0.7微米，平均波長為0.55微米。若用數(shù)值孔為0.65物鏡，則D=0.55微米/2×0.65=0.42微米。這表達(dá)被檢物體在0.42微米以上時(shí)可被觀測到，若不大于0.42微米就不能視見。如果使用數(shù)值孔徑為1.25物鏡，則D=2.20微米。凡被檢物體長度不不大于這個(gè)數(shù)值，均能視見。由此可見，D值愈小，辨別力愈高，物象愈清晰。依照上式，可通過：（1）減低波長；（2）增大折射率；（3）加大鏡口角來提高辨別力。紫外線作光源顯微鏡和電子顯微鏡就是運(yùn)用短光波來提高辨別力以檢視較小物體。物鏡辨別力高低與造象與否清晰有密切關(guān)系。目鏡沒有這種性能。目鏡只放大物鏡所造象。

3、放大率：顯微鏡放大物體，一方面通過物鏡第一次放大造象，目鏡在明視距離導(dǎo)致第二次放大象。放大率就是最后象和原物體兩者體積大小之比例。因而，顯微鏡放大率（V）等于物鏡放大率（V1）和目鏡放大率（V2）乘積，即：V=V1×V2比較精準(zhǔn)計(jì)算辦法，可從下列公式求得M=△×DF1F2F1=接物鏡焦距，F(xiàn)2=接目鏡焦距

△=光學(xué)筒長，D=明視距離（=250毫米）△=接物鏡放大倍數(shù)D=接目鏡放大倍數(shù)M=顯微鏡放大倍數(shù)F1F2設(shè)△=160毫米

F1=4毫米

D=250毫米

F2=150毫米則M=△×D=160×250=40×16.7=668倍F1F2415

4、焦深：在顯微鏡下觀測一種標(biāo)本時(shí)，焦點(diǎn)對在某一象面時(shí)，物象最清晰，這象面為目面。在視野內(nèi)除目面外，還能在目面上面和下面看見模糊物象，這兩個(gè)面之間距離稱為焦深。物鏡焦深和數(shù)值孔徑及放大率成反比：即數(shù)值孔徑和放大率愈大，焦深愈小。因而調(diào)節(jié)油鏡比調(diào)節(jié)低倍鏡要更加仔細(xì)，否則容易使物象滑過而找不到。

三、實(shí)驗(yàn)器材顯微鏡、擦鏡紙等標(biāo)本片香柏油、二甲苯四、顯微鏡使用操作及注意事項(xiàng)顯微鏡構(gòu)造精密，使用時(shí)必要細(xì)心，要按下述操作環(huán)節(jié)進(jìn)行。（一）觀測前準(zhǔn)備1、顯微鏡從顯微鏡柜或鏡箱內(nèi)拿出時(shí)，要用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，平穩(wěn)地將顯微鏡搬運(yùn)到實(shí)驗(yàn)桌上。2、將顯微鏡放在自己身體左前方，離桌子邊沿約10cm左右，右側(cè)可放記錄本或繪圖紙。3、調(diào)節(jié)光照不帶光源顯微鏡，可運(yùn)用燈光或自然光通過反光鏡來調(diào)節(jié)光照，但不能用直射陽光，直射陽光會影響物像清晰并刺激眼睛。將10×物鏡轉(zhuǎn)入光孔，將聚光器上虹彩光圈打開到最大位置，用左眼觀測目鏡中視野亮度，轉(zhuǎn)動反光鏡，使視野光照達(dá)到最明亮最均勻?yàn)橹?。光線較強(qiáng)時(shí)，用平面反光鏡，光線較弱時(shí)，用凹面反光鏡。自帶光源顯微鏡，可通過調(diào)節(jié)電流旋鈕來調(diào)節(jié)光照強(qiáng)弱。4、調(diào)節(jié)光軸中心顯微鏡在觀測時(shí)，其光學(xué)系統(tǒng)中光源、聚光器、物鏡和目鏡光軸及光闌中心必要跟顯微鏡光軸同在始終線上。帶視場光闌顯微鏡，先將光闌縮小，用10×物鏡觀測，在視場內(nèi)可見到視場光闌圓球多邊形輪廓像，如此像不在視場中央，可運(yùn)用聚光器外側(cè)兩個(gè)調(diào)節(jié)旋鈕將其調(diào)到中央，然后緩慢地將視場光闌打開，能看到光束向視場周緣均勻展開直至視場光闌輪廓像完全與視場邊沿內(nèi)接，闡明光線已經(jīng)合軸。 切忌用單手拎提；且無論使用單筒顯微鏡或雙筒顯微鏡均應(yīng)雙眼同步睜開觀測，以減少眼睛疲勞，也便于邊觀測邊繪圖或記錄。（二）低倍鏡觀測

鏡檢任何標(biāo)本都要養(yǎng)成必要先用低倍鏡觀測習(xí)慣。由于低倍鏡視野較大，易于發(fā)現(xiàn)目的和擬定檢查位置。 將標(biāo)本片放置在載物臺上，用標(biāo)本夾夾住，移動推動器，使被觀測標(biāo)本處在物鏡正下方，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)旋鈕，使物鏡調(diào)至接近標(biāo)本處，用目鏡觀測并同步用粗調(diào)節(jié)旋鈕慢慢升起鏡筒（或下降載物臺），直至物像浮現(xiàn)，再用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕使物像清晰為止。用推動器移動標(biāo)本片，找到適當(dāng)目像并將它移到視野中央進(jìn)行觀測。 在任何時(shí)候使用粗調(diào)節(jié)器聚焦物像時(shí)，必須養(yǎng)成先從側(cè)面注視小心調(diào)節(jié)物鏡接近標(biāo)本，然后用目鏡觀測，慢慢調(diào)節(jié)物鏡離開標(biāo)本進(jìn)行準(zhǔn)焦習(xí)慣，以免因一時(shí)誤操作而損壞鏡頭及玻片。（三）高倍鏡觀測

在低倍物鏡觀測基本上轉(zhuǎn)換高倍物鏡。較好顯微鏡，低倍、高倍鏡頭是同焦，在正常狀況下，高倍物鏡轉(zhuǎn)換不應(yīng)遇到載玻片或其上蓋玻片。若使用不同型號物鏡，在轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)要從側(cè)面觀測，避免鏡頭與玻片相撞。然后從目鏡觀測，調(diào)節(jié)光照，使亮度適中，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)旋鈕，使載物臺上升（或鏡筒下降），直至物像浮現(xiàn)，再用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至物像清晰為止，找到需觀測部位，并移至視野中央進(jìn)行觀測。 在普通狀況下，當(dāng)物像在一種物鏡中已清晰聚焦后，轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器將其她物鏡轉(zhuǎn)到工作位置進(jìn)行觀測時(shí)，物像將保持基本準(zhǔn)焦?fàn)顟B(tài)，這種現(xiàn)象稱為物鏡同焦。運(yùn)用這種同焦現(xiàn)象，可以保證在使用高倍鏡或油鏡等放大倍數(shù)高、工作距離短物鏡時(shí)僅用細(xì)調(diào)節(jié)器即可對物像清晰聚焦，從而避免由于使用粗調(diào)節(jié)器時(shí)也許誤操作而損壞鏡頭或載玻片。（四）油鏡觀測

油浸物鏡工作距離（指物鏡前透鏡表面到被檢物體之間距離）很短，普通在0.2mm以內(nèi)，再加上普通光學(xué)顯微鏡油浸物鏡沒有“彈簧裝置”，因而使用油浸物鏡時(shí)要特別細(xì)心，避免由于“調(diào)焦”不慎而壓碎標(biāo)本片并使物鏡受損。使用油鏡按下列環(huán)節(jié)操作：1、先用粗調(diào)節(jié)旋鈕將鏡筒提高（或?qū)⑤d物臺下降）約2cm，并將高倍鏡轉(zhuǎn)出。2、在玻片標(biāo)本鏡檢部位滴上一滴香柏油。3、從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺緩緩地上升，（或鏡筒下降），使油浸物鏡浸入香柏油中，使鏡頭幾乎與標(biāo)本接觸。4、從接目鏡內(nèi)觀測，放大視場光闌及聚光鏡上虹彩光圈（帶視場光闌油鏡開大視場光闌），上調(diào)聚光器，使光線充分照明。用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺徐徐下降（或鏡筒上升），當(dāng)浮現(xiàn)物像一閃后改用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至最清晰為止。如油鏡已離開油面而仍未見到物象，必要再從側(cè)面觀測，重復(fù)上述操作。 有時(shí)按上述操作還找不到目物，則也許是由于油鏡頭下降尚未到位，或因油鏡上升太快。以至眼睛捕獲不到一閃而過物像。遇此狀況，應(yīng)重新操作。此外應(yīng)特別注意不要因在下降鏡頭時(shí)用力過猛，或調(diào)焦時(shí)誤將粗調(diào)節(jié)器向反方向轉(zhuǎn)動而損壞鏡頭及載玻片。5、觀測完畢，下降載物臺，將油鏡頭轉(zhuǎn)出，先用擦鏡紙擦去鏡頭上油，再用擦鏡紙蘸少量乙醚酒精混合液（乙醚2份，純酒精3份）或二甲苯，擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦拭2—3下即可，（注意向一種方向擦拭）。6、將各某些還原，轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使物鏡頭不與載物臺通光孔相對，而是成八字形位置，再將鏡筒下降至最低，降下聚光器，反光鏡與聚光器垂直，用一種干凈手帕將接目鏡罩好，以免目鏡頭沾污灰塵。最后用柔軟紗布清潔載物臺等機(jī)械某些，然后將顯微鏡放回柜內(nèi)或鏡箱中。7、有菌玻片置消毒缸中，清洗、晾干后備用。五、微生物大小測定微生物細(xì)胞大小，是微生物重要形態(tài)特性之一，也是分類鑒定根據(jù)之一。由于菌體很小、只能在顯微鏡下來測量。用于測量微生物細(xì)胞大小工具備目鏡測微尺和鏡臺測微尺。目鏡測微尺（圖20-1）是一塊圓形玻片，在玻片中央把5mm長度刻成50等分，或把10mm長度刻成100等分。測量時(shí)，將其放在接目鏡中隔板上(此處正好與物鏡放大中間像重疊)來測量經(jīng)顯微鏡放大后細(xì)胞物象。由于不同目鏡、物鏡組合放大倍數(shù)不相似，目鏡測微尺每格實(shí)際表達(dá)長度也不同樣，因而目鏡測微尺測量微生物大小時(shí)須先用置于鏡臺上鏡臺測微尺校正，以求出在一定放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每小格所代表相對長度。鏡臺測微尺（圖20-2）是中央某些刻有精準(zhǔn)等分線載玻片，普通將lmm等分為100格，每格長l0μm（即0.0lmm），是專門用來校正目鏡測微尺。校正時(shí)，將鏡臺測微尺放在載物臺上。

圖20-1目鏡測微尺

由于鏡臺測微尺與細(xì)胞標(biāo)本是處在同一位置，都要通過物鏡和目鏡兩次放大成象進(jìn)入視野，即鏡臺測微尺隨著顯微鏡總放大倍數(shù)放大而放大，因而從鏡臺測微尺上得到讀數(shù)就是細(xì)胞真實(shí)大小，因此用鏡臺測微尺已知長度在一定放大倍數(shù)下校正目鏡測微尺，即可求出目鏡測微尺每格所代表長度，然后移去鏡臺測微尺，換上待測標(biāo)本片，用校正好目鏡測微尺在同樣放大倍數(shù)下測量微生物大小。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、成果分別繪出你在低倍鏡、高倍鏡和油鏡下觀測到標(biāo)本片形態(tài)，涉及在三種狀況下視野中變化，同步注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率。2、思考題(1)用油鏡觀測時(shí)應(yīng)注意哪些問題?在載玻片和鏡頭之間加滴什么油?起什么作用?(2)試列表比較低倍鏡、高倍鏡及油鏡各方面差別。為什么在使用高倍鏡及油鏡時(shí)應(yīng)特別注意避免粗調(diào)節(jié)器誤操作?(3)什么是物鏡同焦現(xiàn)象?它在顯微鏡觀測中有什么意義?(4)影響顯微鏡辨別率因素有哪些？(5)依照你實(shí)驗(yàn)體會，談?wù)剳?yīng)如何依照所觀測微生物大小，選取不同物鏡進(jìn)行有效觀測。實(shí)驗(yàn)二革蘭氏染色技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)繉W(xué)習(xí)微生物染色基本技術(shù)，掌握微生物革蘭氏染色辦法。二、實(shí)驗(yàn)原理革蘭氏染色是細(xì)菌學(xué)中極為重要鑒別染色法。其原理重要是由于細(xì)菌細(xì)胞壁構(gòu)造差別，導(dǎo)致對結(jié)晶紫—碘復(fù)合物滲入性不同，產(chǎn)生革蘭氏反映呈現(xiàn)出陰性或陽性。由此通過革蘭氏染色可將細(xì)菌鑒別為革蘭氏陽性菌（G＋）和革蘭氏陰性菌（G－）兩個(gè)類。若菌體被結(jié)晶紫初染時(shí)，染上紫色不被酒精脫色者為G＋菌；若被酒精脫色，而復(fù)染上紅色者為G－菌。通過該染色法也可以觀測細(xì)菌個(gè)體形狀、排列、芽孢有無及其形狀、大小和著色位置等。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.染色劑=1\*GB2⑴赫克爾氏結(jié)晶紫液甲液：結(jié)晶紫2g乙液：草酸銨0.8g乙醇（95%）20ml蒸餾水80ml將甲、乙兩液混合，靜置48小時(shí)后使用。該染液較穩(wěn)定，在不透氣棕色瓶中可儲存數(shù)月。=2\*GB2⑵盧哥氏碘液碘片：1.0g碘化鉀：2.0g蒸餾水：300ml先將碘化鉀溶于少量蒸餾水中，再放入碘片，待碘片全溶后，加水至300ml。此液穩(wěn)定，在不透氣棕色瓶中可存數(shù)月。=3\*GB2⑶脫色液：95%乙醇。=4\*GB2⑷復(fù)染液：即0.5%番紅水溶液。番紅(safranine，又稱沙黃O)2.5g，95%乙醇100mL取2.5%番紅（又稱沙黃）酒精溶液20ml，蒸餾水80ml。2.操作環(huán)節(jié)=1\*GB2⑴涂片。取適當(dāng)細(xì)菌涂片，涂片時(shí)要使菌體薄而均勻，否則菌體群集會呈現(xiàn)假陽性。=2\*GB2⑵干燥和固定。自然風(fēng)干或微熱促其干燥，然后在火焰上通過1～2次，以固定涂片。=3\*GB2⑶初染。滴加結(jié)晶紫液，覆蓋約1分鐘。用水沖凈結(jié)晶紫液。=4\*GB2⑷媒染。滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約1分鐘。用水沖去碘液，將載玻片上水甩凈或用濾紙吸干。=5\*GB2⑸脫色。將載玻片傾斜，并襯以白背景，流滴95%乙醇約20～30秒，及時(shí)用水沖凈乙醇。=6\*GB2⑹復(fù)染。用番紅液1～2分鐘，使已脫色細(xì)胞重新著色，便于鑒別觀測。水洗、待干，鏡檢。=7\*GB2⑺鏡檢。用油鏡觀測單獨(dú)分散菌體，菌體呈藍(lán)紫者為G＋，紅色者為G-。四、結(jié)論實(shí)驗(yàn)與否成功，成果如何？不成功因素是什么？五、問題1.革蘭氏染色基本原理是什么？2.大腸桿菌和枯草芽孢桿菌經(jīng)革蘭氏染色后各有什么成果？3.結(jié)晶紫染色時(shí)間不夠或染色時(shí)間過久會對成果有何影響？4.革蘭氏染色在微生物學(xué)中有何實(shí)踐意義？實(shí)驗(yàn)三培養(yǎng)基配制和滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)颗c規(guī)定：熟悉玻璃器皿洗滌包裝和滅菌前準(zhǔn)備工作。學(xué)習(xí)微生物培養(yǎng)基和無菌水制備，理解培養(yǎng)基配方中各成分作用、制備流程及各環(huán)節(jié)操作技術(shù)與應(yīng)用。學(xué)習(xí)并掌握培養(yǎng)基高壓蒸氣滅菌原理、操作核心技術(shù)和滅菌技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基制備原理培養(yǎng)基是按照微生物生長發(fā)育需要，用不同組分營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)制而成營養(yǎng)基質(zhì)。人工制備培養(yǎng)基目，在于給微生物創(chuàng)造一種良好營養(yǎng)條件。把一定培養(yǎng)基放入一定器皿中，就提供了人工繁殖微生物環(huán)境和場合。自然界中，微生物種類繁多，由于微生物具備不同營養(yǎng)類型，對營養(yǎng)物質(zhì)規(guī)定也各不相似，加之實(shí)驗(yàn)和研究上目不同，因此培養(yǎng)基在構(gòu)成原料上也各有差別。但是，不同種類和不同構(gòu)成培養(yǎng)基中，均應(yīng)具有滿足微生物生長發(fā)育水分、碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長素以及某些特需微量元素等。此外，培養(yǎng)基還應(yīng)具備適當(dāng)酸堿度(pH值)和一定緩沖能力及一定氧化還原電位和適當(dāng)滲入壓。依照制備培養(yǎng)基對所選用營養(yǎng)物質(zhì)來源，可將培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基三類。按照培養(yǎng)基形態(tài)可將培養(yǎng)基分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。依照培養(yǎng)基使用目，可將培養(yǎng)基分為選取培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基及鑒別培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基類型和種類是各種各樣，必要依照不同微生物和不同目進(jìn)行選取配制，本實(shí)驗(yàn)分別配制慣用培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌和真菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號合成培養(yǎng)基和馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中添加凝固劑制成，慣用凝固劑有瓊脂、明膠和硅酸鈉，其中以瓊脂最為慣用，其重要成分為多糖類物質(zhì)，性質(zhì)較穩(wěn)定，普通微生物不能分解，故用凝固劑而不致引起化學(xué)成分變化。瓊脂在95℃熱水中才開始融化，融化后瓊脂冷卻到45℃才重新凝固。因而用瓊脂制成固體培養(yǎng)基在普通微生物培養(yǎng)溫度范疇內(nèi)(25℃-37℃)不會融化而保持固體狀態(tài)。高壓蒸氣滅菌原理高壓蒸汽滅菌是將待滅菌物品放在一種密閉加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增長了滅菌器內(nèi)壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100℃溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌目。在同一溫度下，濕熱殺菌效力比干熱大，其因素有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸取水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增長，所需凝固溫度減少(表Ⅴ-2)，二是濕熱穿透力比干熱大(表Ⅴ-3)；三是濕熱蒸汽有潛熱存在，每1克水在100℃時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出2.26kJ(千焦)熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體溫度，從而增長滅菌效力表Ⅴ-2蛋白質(zhì)含水量與凝固所需溫度關(guān)系卵自蛋白含水量(%)30分鐘內(nèi)凝固所需溫度(℃)502518605674-8080-90145160-170表Ⅴ-3干熱與濕熱穿透力及滅菌效果比較溫度(℃)時(shí)間(小時(shí))透過布層溫度(℃)滅菌20層40層100層干熱130-1404867270.5不完全濕熱105.3310l10l10l完全在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣排除與否完全極為重要，由于空氣膨脹壓不不大于水蒸汽膨脹壓，因此，當(dāng)水蒸汽中具有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸汽溫度低于飽和蒸汽溫度。滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時(shí)，壓力與溫度關(guān)系見表Ⅴ-4。普通培養(yǎng)基用1.05kg/cm2，121.3℃15-30分鐘可達(dá)到徹底滅菌目。滅菌溫度及維持時(shí)間隨滅菌物品性質(zhì)和容量等詳細(xì)狀況而有所變化。例如含糖培養(yǎng)基用0.56kg/cm2(8磅/英寸2)，112.6℃滅菌15分鐘，但為了保證效果，可將其她成分先行121.3℃，20分鐘滅菌，然后以無菌操作手續(xù)加入滅菌糖溶液。又如盛于試管內(nèi)培養(yǎng)基以1.05kg/cm2，121.3℃滅菌20分鐘即可，而盛于大瓶內(nèi)培養(yǎng)基最佳以1.05kg/cm2滅菌30分鐘。表Ⅴ-4滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時(shí)，壓力與溫度關(guān)系壓力數(shù)所有空氣排出時(shí)溫度(℃)2/3空氣排出時(shí)溫度(℃)l/2空氣排出時(shí)溫度(℃)1/3空氣排出時(shí)溫度(℃)空氣全不排出時(shí)溫度(℃)公斤(公斤/厘米2)(kg/cm2)磅/英寸2(1b/in2)0.350.701.051.401.752.1051015202530108.8115.6121.3126.2130.0134.610010911512112613094105112118124128901001091151211267290100109115121 蒸汽壓力所用單位為kg/cm2(公斤/厘米2)，它與1b/in2(磅/英寸2)和溫度換算關(guān)系見表Ⅴ-5。表Ⅴ-5蒸汽壓力與蒸汽溫度換算關(guān)系蒸汽壓力大氣壓壓力表讀數(shù)蒸汽溫度kg/cm21b/in21.001.251.501.752.002.503.000.000.250.500.751.001.502.000.003.757.5011.2515.0022.5030.00100.0107.0112.0115.0121.0128.0134.5三、實(shí)驗(yàn)器材1、

藥物瓊脂，10％HCL,10%NaOH，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方藥物；2、

材料具刻度1000毫升塘瓷盅或小鋁鍋，電子稱，10×200mm試管，量筒，小燒杯，玻璃棒，骨匙，pH試紙，分裝漏斗，試管盒，紗布，棉花，報(bào)紙，麻繩，標(biāo)簽，培養(yǎng)皿。3、設(shè)備高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱、冰箱、電爐等四、實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)稱取藥物放在大燒杯中，加入蒸餾水用玻璃棒攪拌并加熱溶化，等藥物溶解后用pH試紙調(diào)節(jié)pH至7.4-7.6，如有沉淀應(yīng)過濾后分裝，每支試管約加入9ml。每組分裝30支，加上棉塞，包上牛皮紙，準(zhǔn)備滅菌。 裝入試管中量不適當(dāng)超過試管高度1/5，裝入三角燒瓶中量以燒瓶總體積一半為限。在分裝過程中，應(yīng)注意勿使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口、以免弄濕棉塞，導(dǎo)致污染。2、無菌水準(zhǔn)備在試管或瓶內(nèi)先盛以適量蒸餾水〔或生理鹽水O．85％NaCl)，蓋好棉塞，包上牛皮紙使其滅菌后，其水量恰為9ml。每組準(zhǔn)備10支與牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可放在同一試管架上，以一大張牛皮紙包扎寫上姓名。準(zhǔn)備滅菌。3、高壓滅菌手提式高壓蒸汽滅菌鍋使用操作環(huán)節(jié)：（1）一方面將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量水，使水面與三角擱架相平為宜。（2）放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口紙而透入棉塞。（3）加蓋，并將蓋上排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶排氣槽內(nèi)。再以兩兩對稱方式同步旋緊相對兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。（4）用電爐或煤氣加熱，并同步打開排氣閥，使水沸騰以排除渦內(nèi)冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)溫度隨蒸汽壓力增長而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制熱源，維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用1.05kg/cm2，121.3℃，20分鐘滅菌。（5）滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源或關(guān)閉煤氣，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表壓力降至0時(shí)，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時(shí)，打開排氣閥，就會因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，導(dǎo)致棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。（6）將取出滅菌培養(yǎng)基放入37℃溫箱培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。五、思考題棉塞作用？實(shí)驗(yàn)四水中細(xì)菌總數(shù)測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)?.學(xué)習(xí)水樣采用辦法和水樣細(xì)菌總數(shù)測定辦法。2.理解水源水平板菌落計(jì)數(shù)原理。二、實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用平板計(jì)數(shù)技術(shù)測定水中細(xì)菌總數(shù)。由于水中細(xì)菌種類繁多，它們對營養(yǎng)和其她生長條件規(guī)定差別很大，不也許找到一種培養(yǎng)基在一種條件下，使水中所有細(xì)菌均能生長繁殖，因而，以一定培養(yǎng)基平板上生長出來菌落，計(jì)算出來水中細(xì)菌總數(shù)僅是一種近似值。當(dāng)前普通是采用普通牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。三、試劑與器材1.試劑牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，滅菌水牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g瓊脂15-20g蒸餾水1000ml（配備1/4量）2.器材滅菌三角瓶，滅菌帶玻璃塞瓶，滅菌培養(yǎng)皿，滅菌吸管，滅菌試管等。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容細(xì)菌總數(shù)是指1ml或1g檢樣中所含細(xì)菌菌落總數(shù)，所用辦法是稀釋平板計(jì)數(shù)法，由于計(jì)算是平板上形成菌落數(shù)，它反映是檢樣中活菌數(shù)量。