第3章 DNA的復(fù)制課件

第三章DNA的復(fù)制

本章重點(diǎn)介紹遺傳中心法則和DNA的半保留復(fù)制以及逆轉(zhuǎn)錄的過程和機(jī)理，對DNA的損傷和修復(fù)、突變和重組作一般介紹。

思考

DNA是絕大多數(shù)生物體遺傳信息的載體，繼1953年Watson&Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型后，1958年，Crick提出了“中心法則”(Centraldogma)揭示了遺傳信息的傳遞規(guī)律。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制遺傳信息傳遞的中心法則

蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA生物的遺傳信息以密碼的形式儲存在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序。在細(xì)胞分裂的過程中，通過DNA復(fù)制把親代細(xì)胞所含的遺傳信息忠實(shí)地傳遞給兩個(gè)子代細(xì)胞。在子代細(xì)胞的生長發(fā)育過程中，這些遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄傳遞給RNA，再由RNA通過翻譯轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的蛋白質(zhì)多肽鏈上的氨基酸排列順序，由蛋白質(zhì)執(zhí)行各種各樣的生物學(xué)功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳特征。后來人們又發(fā)現(xiàn)，在宿主細(xì)胞中一些RNA病毒能以自己的RNA為模板復(fù)制出新的病毒RNA，還有一些RNA病毒能以其RNA為模板合成DNA，稱為逆轉(zhuǎn)錄這是中心法則的補(bǔ)充。中心法則總結(jié)了生物體內(nèi)遺傳信息的流動(dòng)規(guī)律，揭示遺傳的分子基礎(chǔ)，不僅使人們對細(xì)胞的生長、發(fā)育、遺傳、變異等生命現(xiàn)象有了更深刻的認(rèn)識，而且以這方面的理論和技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展了基因工程，給人類的生產(chǎn)和生活帶來了深刻的革命。第3章DNA的復(fù)制目錄第一節(jié)DNA生物合成第二節(jié)DNA的損傷與修復(fù)第三節(jié)DNA突變第四節(jié)DNA的遺傳重組楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制DNA體內(nèi)復(fù)制：原核、真核生物的染色體、細(xì)菌質(zhì)粒（環(huán)狀，雙鏈）、真核細(xì)胞器DNA（線粒體、葉綠體）、病毒（雙鏈，環(huán)狀）DNA的體外復(fù)制：分子克隆。DNA生物合成有兩種方式1.DNA的復(fù)制（DNA指導(dǎo)下的DNA合成）2.逆轉(zhuǎn)錄作用（RNA指導(dǎo)下的DNA的合成）楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制DNA的復(fù)制一、概念和實(shí)驗(yàn)依據(jù)二、DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶類三、DNA的復(fù)制的起始點(diǎn)和方式四、原核細(xì)胞DNA的復(fù)制過程五、DNA復(fù)制的忠實(shí)性六、真核細(xì)胞DNA的復(fù)制

第3章DNA的復(fù)制

DNA在復(fù)制時(shí)，兩條鏈解開分別作為模板，在DNA聚合酶的催化下按堿基互補(bǔ)的原則合成兩條與模板鏈互補(bǔ)的新鏈，以組成新的DNA分子。這樣新形成的兩個(gè)DNA分子與親代DNA分子的堿基順序完全一樣。由于子代DNA分子中一條鏈來自親代，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?，這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制(semiconservativereplication)

。DNA的半保留復(fù)制的概念第3章DNA的復(fù)制DNA的半保留復(fù)制可以說明DNA在代謝上的穩(wěn)定性。經(jīng)過多代復(fù)制，DNA的多核苷酸鏈仍可以保持完整，并存在于后代而不被分解掉。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制DNA的半保留復(fù)制實(shí)驗(yàn)依據(jù)

1958年Meselson&stahl用同位素示蹤標(biāo)記加密度梯度離心技術(shù)實(shí)驗(yàn),證明了DNA是采取半保留的方式進(jìn)行復(fù)制.楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制第3章DNA的復(fù)制復(fù)制中的大腸桿菌染色體放射自顯影圖

(Cairns實(shí)驗(yàn))將3H-胸苷標(biāo)記大腸桿菌DNA，經(jīng)過近兩代的時(shí)間，3H-胸苷摻入大腸桿菌DNA。用溶菌酶把細(xì)胞壁消化掉，使完整的大腸桿菌染色體DNA釋放出來，放射自顯影，得到上圖。非復(fù)制部分（C）銀粒子密度較低，由一股放射性鏈和一股非放射性鏈構(gòu)成。已復(fù)制部分占整個(gè)染色體的三分之二，其中一條雙鏈（B）僅有一股鏈?zhǔn)菢?biāo)記的，另外一股雙鏈（A）的兩股鏈都是標(biāo)記的，銀粒子密度為前二者的兩倍。染色體全長約為1100微米。ABC環(huán)狀DNA的復(fù)制

ABC第3章DNA的復(fù)制第3章DNA的復(fù)制原核生物DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶類

(1)DNA聚合酶(DNApolymerases)(2)引物酶(primase)和引發(fā)體(primosome)：啟動(dòng)RNA引物鏈的合成。(3)DNA連接酶（DNAligase）(4)DNA解鏈酶(DNAhelicase)(5)單鏈結(jié)合蛋白(single-strandbindingprotein,SSBP)：結(jié)合在解開的DNA單鏈上，防止重新形成雙螺旋。(6)拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase):兼具內(nèi)切酶和連接酶活力，能迅速將DNA超螺旋或雙螺旋緊張狀態(tài)變成松馳狀態(tài)，便于解鏈。解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物第3章DNA的復(fù)制大腸桿菌的引物酶也是DNA復(fù)制所必需的一種酶。該酶由一條多肽鏈組成，MW為60KD，每個(gè)細(xì)胞中有50-100個(gè)分子由大腸桿菌的dnaG基因編碼。引物酶催化引物RNA分子的合成，但它和傳統(tǒng)的RNA聚合酶不一樣。[1]引物酶對雷米封不敏感，而RNA聚合酶則敏感;[2]引物酶既可以利用核糖核苷酸，而RNA聚合酶只能利用核糖核苷酸;[3]引物酶只在復(fù)制起點(diǎn)處合成RNA引物而引發(fā)DNA的復(fù)制，而RNA聚合酶則是啟動(dòng)DNA轉(zhuǎn)錄合成RNA從而將遺傳信息由DNA傳遞到RNA。但在單鏈?zhǔn)删wM13DNA和質(zhì)粒Co1E1DNA復(fù)制時(shí)，引物的合成是由RNA聚合酶催化的。噬菌體T7的Gene4蛋白，T4的Gene41和61蛋白等也具有引物酶的活性和具有大腸桿菌引物酶相似的功能。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制DNA在細(xì)胞內(nèi)往往以超螺旋狀態(tài)存在，DNA拓?fù)涿复呋籇NA分子不同超螺旋狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)變。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶有兩類，大腸桿菌的ε蛋白(MW-110000)就是一種典型的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ.它的作用是暫時(shí)切斷一條DNA鏈，形成酶-DNA共價(jià)中間物而使超螺旋DNA松弛化，然后再將切斷的單鏈DNA連接起來，而不需要任何輔助因子。而大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶(DNAgyrase)則是典型的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，能將負(fù)超螺旋引入DNA分子，該酶能暫時(shí)性地切斷和重新連接雙鏈DNA，同時(shí)需要ATP水解為ADP以供能。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSBP)螺旋酶沿復(fù)制叉方向向前推進(jìn)產(chǎn)生了一段單鏈區(qū)，但是這種單鏈DNA不會長久存在，會很快重新配對形成雙鏈DNA或被核酸酶降解。在細(xì)胞內(nèi)有大量單鏈DNA結(jié)合蛋白能很快地和單鏈DNA結(jié)合，防止其重新配對形成雙鏈DNA或被核酸酶降解。一個(gè)SSBP四聚體結(jié)合于單鏈DNA上可以促進(jìn)其他SSBP四聚體現(xiàn)相鄰的單鏈DNA結(jié)合，這個(gè)過程稱為協(xié)同結(jié)合(cooperativebinding)，SSBP結(jié)合到單鏈DNA上后，使其呈伸展?fàn)顟B(tài)，沒有彎曲和結(jié)節(jié)，有利于單鏈DNA作為模板。SSBP可以重復(fù)使用，當(dāng)新生的DNA鏈合成到某一位置時(shí)，該處的SSBP便會脫落，并被重復(fù)利用。第3章DNA的復(fù)制螺旋酶（helicase）可以促使DNA在復(fù)制叉處打開雙鏈。螺旋酶可以和單鏈DNA結(jié)合，并且與ATP結(jié)合，利用ATP分解成ADP時(shí)產(chǎn)生的能量沿DNA鏈向前運(yùn)動(dòng)促使DNA雙鏈打開。目前，大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)有兩種螺旋酶參與這個(gè)過程，一種稱為螺旋酶Ⅱ或螺旋酶Ⅲ，與前導(dǎo)鏈的模板DNA結(jié)合沿5'→3'方向運(yùn)動(dòng);第二種稱為Rep蛋白，和前導(dǎo)鏈的模板DNA結(jié)合沿3'→5'方向運(yùn)動(dòng)。第3章DNA的復(fù)制DNA聚合酶催化的鏈延長反應(yīng)5′RNA引物子鏈3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′模板鏈第3章DNA的復(fù)制DNA聚合酶(DNAPolymerase)共同性質(zhì)[1]以脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)為前體催化合成DNA;[2]需要模板和引物的存在;[3]不能起始合成新的DNA鏈;[4]催化dNTP加到生長中的DNA鏈的3'-OH末端;[5]催化DNA合成的方向是5'→3'。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個(gè)細(xì)胞的分子統(tǒng)計(jì)數(shù)5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用轉(zhuǎn)化率DNA聚合酶Ⅰ109，000400+++1120，000100++-0.05400，00010-20++-50比較項(xiàng)目DNA聚合酶Ⅲ切除引物修復(fù)修復(fù)復(fù)制功能1999年發(fā)現(xiàn)聚合酶

和

，它們涉及DNA的錯(cuò)誤傾向修復(fù)（error-pronerepair）第3章DNA的復(fù)制大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ(DNApolⅢ)大腸桿菌每個(gè)細(xì)胞中只有10-20個(gè)DNApolⅢ分子，該酶對模板的要求與DNA聚合酶Ⅱ相同，最適模板也是鏈DNA中間有空隙的單鏈DNA，單鏈結(jié)合蛋白可以提高該酶催化單鏈DNA模板的DNA聚合作用。DNApolⅢ也有3'→5'和5'→3'外切酶活性，但是3'→5'外切酶活性的最適底物是單鏈DNA，只產(chǎn)生5'-單核苷酸，不會產(chǎn)生二核苷酸，即每次只能從3'端開始切除一個(gè)核苷酸。5'→3'外切酶活性也要求有單鏈DNA為起始作用底物，但一旦開始后，便可作用于雙鏈區(qū)。第3章DNA的復(fù)制大腸桿菌DNA聚合酶Ⅱ(DNApolⅡ)1970年發(fā)現(xiàn)了DNApolⅡ。此酶MW為120KD，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)約有100個(gè)酶分子，但活性只有DNApolⅠ的5%。

(1)聚合作用:該酶催化DNA的聚合，但是對模板有特殊的要求。該酶的最適模板是雙鏈DNA而中間有空隙(gap)的單鏈DNA部份，而且該單鏈空隙部份不長于100個(gè)核苷酸。對于較長的單鏈DNA模板區(qū)該酶的聚合活性很低。(2)該酶具有3'→5'外切酶活性，但無5'→3'外切酶活性。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制(3)該酶對作用底物的選擇性較強(qiáng)，一般只能將2－脫氧核苷酸摻入到DNA鏈中。(4)該酶不是復(fù)制的主要聚合酶，因?yàn)榇嗣溉毕莸拇竽c桿菌突變株的DNA復(fù)制都正常?？赡茉贒NA的損傷修復(fù)中該酶起到一定的作用。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ這是1956年由ArthurKornberg首先發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶，又稱Kornberg酶。此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特點(diǎn)。DNAPolⅠ在空間結(jié)構(gòu)上近似球體，直徑約6.5nm。在酶的縱軸上有一個(gè)約20A的深溝(cleft)，帶有正電荷，這是該酶的活性中心位置，在此位置上至少有6個(gè)結(jié)合位點(diǎn):[1]模板DNA結(jié)合位點(diǎn);[2]DNA生長鏈或引物結(jié)合位點(diǎn);[3]引物末端結(jié)合位點(diǎn)，用以專一引物或DNA生長鏈的3'-OH;[4]脫氧核苷三磷酸結(jié)合位點(diǎn);[5]5'→3'外切酶活性位點(diǎn)，用以結(jié)合生長鏈前方的5'-端脫氧核苷酸并切除之;[6]3'→5'外切酶活性位點(diǎn)，用以結(jié)合和切除生長鏈上未配對的第3章DNA的復(fù)制[1]聚合作用在引物RNA3'-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個(gè)將核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的專一性主要表現(xiàn)為新進(jìn)入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對時(shí)才有催化作用。dNTP進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)后，可能使酶的構(gòu)象發(fā)生變化，促進(jìn)3'-OH與5'-PO4結(jié)合生成磷酸二酯鍵。若是錯(cuò)誤的核苷酸進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)，則不能與模板配對，無法改變酶的構(gòu)象而被3'-5'外切酶活性位點(diǎn)所識別并切除之。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制[2]3'→5'外切酶活性──校對作用這種酶活性的主要功能是從3'→5'方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制第3章DNA的復(fù)制[3]5'→3'外切酶活性──切除修復(fù)作用從5’→3’方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)生5’-脫氧核苷酸。這種酶活性只對DNA上配對部分(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力作用。每次能切除10個(gè)核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5'→3'外切酶活力達(dá)10倍以上。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起著重要作用。對岡崎片段5'末端DNA引物的去除依賴此種外切酶活性。第3章DNA的復(fù)制[4]焦磷酸解作用DNApolⅠ的這種活性可以催化3'末端焦磷酸解DNA分子。這種作用就是無機(jī)焦磷酸分解DNA生長鏈，可以認(rèn)為是DNA聚合作用的逆反應(yīng)，而且這種水解DNA鏈作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi→(dNMP)n-x+X(dNPPP)→DNA[5]焦磷酸交換作用催化dNTP末端的PPi同無機(jī)焦磷酸的交換反應(yīng)。反應(yīng)式為32P32Pi+dNPPP←dNP32P32P+PPi→DNA（[4]、[5]兩種作用，都要求有較高濃度的PPi，因此，在體內(nèi)由于沒有足夠高的PPi而無重要意義。）第3章DNA的復(fù)制DNApolⅠ的DNA聚合酶活性和5'→3'外切酶活性協(xié)同作用，可以使DNA鏈上的切口向前推進(jìn)，即沒有新的DNA合成，只有核苷酸的交換。這種反應(yīng)叫缺口平移(Nicktranslation)。當(dāng)雙鏈DNA上某個(gè)磷酸二酯鍵斷裂產(chǎn)生切口時(shí)，DNApolIⅠ能從切口開始合成新的NDA鏈，同時(shí)切除原來的舊鏈。這樣，從切口開始合成了一條與被取代的舊鏈完全相同的新鏈。如果新?lián)饺氲拿撗鹾塑账崛姿釣棣?32P-dNTP，則重新合成的新鏈即為帶有同位素標(biāo)記的DNA分子，可以用作探針進(jìn)行分子雜交實(shí)驗(yàn)。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的結(jié)構(gòu)和功能

延長因子DNA聚合酶Ⅲ兩個(gè)亞基夾住DNADNA聚合酶Ⅲ異二聚體核心酶校對引物的結(jié)合和識別促使核心酶二聚化第3章DNA的復(fù)制連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈第3章DNA的復(fù)制DNA連接酶利用NAD或ATP中的能量催化兩個(gè)核酸鏈之間形成磷酸二酯鍵。(1)NAD+或ATP將其腺苷酰基轉(zhuǎn)移到DNA連接酶的一個(gè)賴氨酸殘基的ε─氨基上形成共價(jià)的酶-腺苷酸中間物，同時(shí)釋放出煙酰胺單核苷酸(NMN)或焦磷酸。(2)將酶-腺苷酸中間物上的腺苷?；俎D(zhuǎn)移到DNA的5'-磷酸基端，形成一個(gè)焦磷酰衍生物，即DNA-腺苷酸;(3)這個(gè)被激活的5'-磷酰基端可以和DNA的3'-OH端反應(yīng)合成磷酸二酯鍵，同時(shí)釋放出AMP。第3章DNA的復(fù)制環(huán)狀DNA復(fù)制時(shí)所形成的θ結(jié)構(gòu)起始點(diǎn)復(fù)制叉的推進(jìn)復(fù)制叉起始點(diǎn)起始點(diǎn)起始點(diǎn)復(fù)制叉復(fù)制叉未復(fù)制DNA單向復(fù)制雙向復(fù)制DNA的雙向和單向復(fù)制第3章DNA的復(fù)制定點(diǎn)起始，復(fù)制方向大多數(shù)是雙向的（等速進(jìn)行或異速進(jìn)行），形成兩個(gè)復(fù)制叉，少數(shù)是單向復(fù)制，形成一個(gè)復(fù)制叉。復(fù)制方向★用放射自顯影實(shí)驗(yàn)判斷DNA的復(fù)制方向及速度DNA的幾種復(fù)制方式楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制DNA的幾種復(fù)制方式楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制親代雙鏈（或單鏈）DNA的一條鏈在DNA復(fù)制起點(diǎn)處被切開，其5'端游離出來。DNA聚合酶Ⅲ便可以將脫氧核糖核苷酸聚合在3'-OH端。當(dāng)復(fù)制向前進(jìn)行時(shí)，親代DNA上被切斷的5'端繼續(xù)游離下來，并且很快被單鏈結(jié)合蛋白所結(jié)合。因?yàn)?'端從環(huán)上向下解鏈的同時(shí)伴有環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)繞其軸不斷的旋轉(zhuǎn)，而且以3'-OH端為引物的DNA生長鏈則不斷地以另一條環(huán)狀DNA鏈為模板向前延伸，因而稱為滾環(huán)(Rollingcircle)復(fù)制。第3章DNA的復(fù)制在這種復(fù)制方式中，DNA的延伸可以一直進(jìn)行下去，產(chǎn)生的DNA鏈可以是親代DNA單位長度的許多倍。這么長的DNA鏈?zhǔn)侨绾无D(zhuǎn)變?yōu)閱挝婚L度的DNA分子的，目前尚不清楚?？赡苁怯商禺惖膬?nèi)切酶切開產(chǎn)生單位長度的子代DNA。這些DNA可自身環(huán)繞，或保持線性分子狀態(tài)。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制雙鏈環(huán)在固定點(diǎn)解開進(jìn)行復(fù)制，但兩條鏈的合成是高度不對稱的，一條鏈先復(fù)制，另一條鏈保持單鏈而被取代，在電鏡下可以看到呈D環(huán)形狀。待一條鏈復(fù)制到一定程度，露出另一鏈的復(fù)制起點(diǎn)，另一條鏈才開始復(fù)制。這表明復(fù)制起點(diǎn)是以一條鏈為摸板起始合成DNA的一段序列；兩條鏈的起點(diǎn)并不總在同一點(diǎn)上，當(dāng)兩條鏈的起點(diǎn)分開一定距離時(shí)就產(chǎn)生D－環(huán)（D-loop）復(fù)制。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制多復(fù)制叉復(fù)制第一輪復(fù)制尚未完成，復(fù)制起點(diǎn)就開始第二輪的復(fù)制。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制不需要RNA引物的DNA復(fù)制有些病毒的基因組是線性DNA，在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中復(fù)制時(shí)不需要RNA引物。目前了解最清楚的是腺病毒DNA和枯草桿菌噬菌體φ29DNA的復(fù)制。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制在這些DNA復(fù)制時(shí)，從一端開始，只能利用一條DNA鏈作為模板，即以3'→5'鏈為模板。這樣，新合成的DNA鏈便將原來的親代DNA鏈取代子鏈。原來的親代DNA鏈(從合成起始端看是5'→3'鏈)作為單鏈從雙螺旋中釋放出來。這條鏈自身的5'和3'可以互補(bǔ)配對，然后在3'端開始以此鏈為模板重新合成另一條子鏈。這樣，DNA復(fù)制即完成。產(chǎn)生兩個(gè)與親代DNA完成一樣的子代DNA。第3章DNA的復(fù)制DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA鏈，需要有引物才能聚合核苷酸生成DNA鏈。那么，腺病毒和φ29DNA等沒有RNA引物是怎樣啟動(dòng)其DNA復(fù)制的呢?研究發(fā)現(xiàn)，所有的腺病毒DNA生長鏈上都有一個(gè)特異的蛋白質(zhì)分子附著在其5'末端的胞嘧啶核苷酸上。在DNA復(fù)制開始之前，該末端蛋白質(zhì)通過共價(jià)鍵與dCMP的5'磷酸基相連。胞嘧啶通過堿基配對與腺病毒DNA模板3'末端的鳥嘌呤核苷酸配對結(jié)合，然后由病毒本身編碼的DNA聚合酶以此末端蛋白-dCMP復(fù)合物為引物連續(xù)合成腺病毒整個(gè)基因組的36000個(gè)核苷酸，在DNA復(fù)制過程中，由于DNA鏈被置換而產(chǎn)生了扭曲張力(torsionalstrain)，但細(xì)胞內(nèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ可以消除張力。病毒自身編碼的72KD的單鏈結(jié)合蛋白可能也同時(shí)具有螺旋酶的功能促進(jìn)DNA雙鏈的解開。第3章DNA的復(fù)制DNA的復(fù)制是在起始階段進(jìn)行控制的，一旦復(fù)制起始，它就會繼續(xù)下去直到整個(gè)復(fù)制子完成復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)是以一條鏈為模板起始DNA合成的一段序列。有時(shí)，兩條鏈的復(fù)制起點(diǎn)并不總是在同一點(diǎn)上（如D環(huán)復(fù)制）。在一個(gè)完整的細(xì)胞周期中，每一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)只使用一次，完成一次復(fù)制過程。多數(shù)生物的復(fù)制起點(diǎn)，都是DNA呼吸作用強(qiáng)烈（甲醛變性實(shí)驗(yàn)）的區(qū)段，即經(jīng)常開放的區(qū)段，富含A－T。

楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制復(fù)制子(Replicon)：Genome能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位，每個(gè)復(fù)制子都含有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。原核生物的染色體和質(zhì)粒、真核生物的細(xì)胞器DNA都是環(huán)狀雙鏈分子，它們都是單復(fù)制子，都在一個(gè)固定的起點(diǎn)開始復(fù)制，復(fù)制方向大多數(shù)是雙向的，少數(shù)是單向復(fù)制。多數(shù)是對稱復(fù)制，少數(shù)是不對稱復(fù)制（一條鏈復(fù)制后才進(jìn)行另一條鏈的復(fù)制）。環(huán)狀DNA的復(fù)制眼象θ，稱θ形復(fù)制。真核生物的染色體DNA是線形雙鏈分子，含有許多復(fù)制起點(diǎn)，因此是多復(fù)制子，每個(gè)復(fù)制子約有100-200Kbp。人體細(xì)胞平均每個(gè)染色體含有1000個(gè)復(fù)制子。病毒DNA多種多樣，環(huán)狀或線形，雙鏈或單鏈，但都是單復(fù)制子。第3章DNA的復(fù)制用遺傳學(xué)和生物化學(xué)的方法可以確定大腸桿菌染色體DNA的復(fù)制起點(diǎn)oriC在基因圖譜上的位置。在一個(gè)生長的群體中幾乎所有的染色體都在復(fù)制過程中，因此離復(fù)制起點(diǎn)越近的基因出現(xiàn)頻率越高，越遠(yuǎn)的基因出現(xiàn)頻率越低。將大腸桿菌提取出來的DNA切成大約1％染色體長度的片段，通過分子雜交的方法測定各基因片段的頻率，結(jié)果表明oriC位于基因圖譜的ilv位點(diǎn)處。一旦復(fù)制開始以后，復(fù)制叉向兩側(cè)以相等速度向前移動(dòng)，兩個(gè)復(fù)制又在起點(diǎn)180°的trp位點(diǎn)處(33分附近)相會合。第3章DNA的復(fù)制大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)成串排列的重復(fù)序列

GATCTNTTNTTT成串排列的三個(gè)13bp序列共有序列共有序列TTATCCACADnaA蛋白結(jié)合位點(diǎn)四個(gè)9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大腸桿菌DNA復(fù)制起點(diǎn)在起始階段的結(jié)構(gòu)模型第3章DNA的復(fù)制原核細(xì)胞DNA的半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制過程

復(fù)制叉的移動(dòng)方向解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物體DNA聚合酶ISSB3′3′5′前導(dǎo)鏈隨后鏈3′5′復(fù)制的起始（引發(fā)）DNA鏈的延長DNA鏈終止5′RNA引物3′3′DNA復(fù)制動(dòng)畫1、2第3章DNA的復(fù)制DNA新生鏈的合成由DNA聚合酶Ⅲ所催化，然而，DNA必須由螺旋酶在復(fù)制叉處邊移動(dòng)邊解開雙鏈。這樣就產(chǎn)生了一種拓?fù)鋵W(xué)上的問題:由于DNA的解鏈，在DNA雙鏈區(qū)勢必產(chǎn)生正超螺旋，在環(huán)狀DNA中更為明顯，當(dāng)達(dá)到一定程度后就會造成復(fù)制叉難再繼續(xù)前進(jìn)，從而終止DNA復(fù)制。有兩種機(jī)制可以防止這種現(xiàn)象發(fā)生:[1]DNA在生物細(xì)胞中本身就是超螺旋，當(dāng)DNA解鏈而產(chǎn)生正超螺旋時(shí)，可以被原來存在的負(fù)超螺旋所中和;[2]DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ可以打開一條鏈，使正超螺旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變成松弛狀態(tài)，而DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(旋轉(zhuǎn)酶)可以在DNA解鏈前方不停地繼續(xù)將負(fù)超螺旋引入雙鏈DNA。第3章DNA的復(fù)制在DNA復(fù)制叉處要能由兩套DNA聚合酶Ⅲ在同一時(shí)間分別進(jìn)行復(fù)制DNA前導(dǎo)鏈和滯后鏈。如果滯后鏈模板環(huán)繞DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通過DNA聚合酶Ⅲ，然后再折向與未解鏈的雙鏈DNA在同一方向上，則滯后鏈的合成可以和前導(dǎo)鏈的合成在同一方向上進(jìn)行。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制這樣，當(dāng)DNA聚合酶Ⅲ沿著滯后鏈模板移動(dòng)時(shí)，由特異的引物酶催化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶Ⅲ所延伸。當(dāng)合成的DNA鏈到達(dá)前一次合成的岡崎片段的位置時(shí)，滯后鏈模板及剛合成的岡崎片斷便從DNA聚合酶Ⅲ上釋放出來。這時(shí)，由于復(fù)制叉繼續(xù)向前運(yùn)動(dòng)，便產(chǎn)生了又一段單鏈的滯后鏈模板，它重新環(huán)繞DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通過DNA聚合酶Ⅲ開始合成新的滯后鏈岡崎片段。通過這樣的機(jī)制，前導(dǎo)鏈的合成不會超過滯后鏈太多(最后只有一個(gè)岡崎片段的長度)。而且，這樣引發(fā)體在DNA鏈上和DNA聚合酶Ⅲ以同一速度移動(dòng)。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制按上述DNA復(fù)制的機(jī)制，在復(fù)制叉附近，形成了以兩套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引發(fā)體和螺旋構(gòu)成的類似核糖體大小的復(fù)合體，稱為DNA復(fù)制體(replisome)。復(fù)制體在DNA前導(dǎo)鏈模板和滯后鏈模板上移動(dòng)時(shí)便合成了連續(xù)的DNA前導(dǎo)鏈和由許多岡崎片段組成的滯后鏈。在DNA合成延伸過程中主要是DNA聚合酶Ⅲ的作用。當(dāng)岡崎片段形成后，DNA聚合酶Ⅰ通過其5'→3'外切酶活性切除岡崎片段上的RNA引物，同時(shí)，利用后一個(gè)岡崎片段作為引物由5'→3'合成DNA。最后兩個(gè)岡崎片段由DNA連接酶將其接起來，形成完整的DNA滯后鏈。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制復(fù)制的引發(fā)(Priming)階段包括DNA復(fù)制起點(diǎn)雙鏈解開，通過轉(zhuǎn)錄激活步驟合成RNA分子，RNA引物的合成，DNA聚合酶將第一個(gè)脫氧核苷酸加到引物RNA的3‘-OH末端復(fù)制引發(fā)的關(guān)鍵步驟就是前導(dǎo)鏈DNA的合成，一旦前導(dǎo)鏈DNA的聚合作用開始，滯后鏈上的DNA合成也隨著開始。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制DNA復(fù)制開始時(shí)，DNA螺旋酶首先在復(fù)制起點(diǎn)處將雙鏈DNA解開，然后單鏈DNA結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合在被解開的鏈上。由復(fù)制因子X(n蛋白)，復(fù)制因子Y(n'蛋白)，n"蛋白，i蛋白，dnaB蛋白和dnaC蛋白等6種蛋白質(zhì)組成的引發(fā)前體(preprimosome)，在單鏈DNA結(jié)合蛋白的作用下與單鏈DNA結(jié)合生成中間物，這是一種前引發(fā)過程。引發(fā)前體進(jìn)一步與引物酶(primase)組裝成引發(fā)體(primosome)。引發(fā)體可以在單鏈DNA上移動(dòng)，在dnaB亞基的作用下識別DNA復(fù)制起點(diǎn)位置。第3章DNA的復(fù)制首先在前導(dǎo)鏈上由引物酶催化合成一段RNA引物，然后，引發(fā)體在滯后鏈上沿5'→3'方向不停的移動(dòng)(這是一種相對移動(dòng)，也可能是滯后鏈模板在移動(dòng))，在一定距離上反復(fù)合成RNA引物供DNA聚合酶Ⅲ合成岡崎片段使用，引發(fā)體中許多蛋白因子的功能尚不清楚。但是，這些成份必須協(xié)同工作才能使引發(fā)體在滯后鏈上移動(dòng)，識別合適的引物合成位置，并將核苷酸在引發(fā)位置上聚合成RNA引物。由于引發(fā)體在滯后鏈模板上的移動(dòng)方向與其合成引物的方向相反，所以在滯后鏈上所合成的RNA引物非常短，一般只有3-5個(gè)核苷酸長。而且，在同一種生物體細(xì)胞中這些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在DNA滯后鏈模板上比較特定的位置(序列)上才能合成RNA引物。第3章DNA的復(fù)制為什么需要有RNA引物來引發(fā)DNA復(fù)制呢?這可能盡量減少DNA復(fù)制起始處的突變有關(guān)。DNA復(fù)制開始處的幾個(gè)核苷酸最容易出現(xiàn)差錯(cuò)，因此，用RNA引物即使出現(xiàn)差錯(cuò)最后也要被DNA聚合酶Ⅰ切除，提高了DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。RNA引物形成后，由DNA聚合酶Ⅲ催化將第一個(gè)脫氧核苷酸按堿基互補(bǔ)原則加在RNA引物3'-OH端而進(jìn)入DNA鏈的延伸階段。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制聚合酶III核心酶大腸桿菌復(fù)制體結(jié)構(gòu)示意圖聚合酶I聚合酶III核心酶滯后鏈前導(dǎo)鏈解螺旋酶引物合成酶RNA引物引發(fā)體拓?fù)洚悩?gòu)酶II-夾子-聚體-夾子-復(fù)合物RNA引物單鏈結(jié)合蛋白（SSB）第3章DNA的復(fù)制大腸桿菌染色體復(fù)制的終止oric復(fù)制叉2復(fù)制叉1終止復(fù)制叉2終止復(fù)制叉1復(fù)制叉1復(fù)制叉2完成復(fù)制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶

連鎖染色體第3章DNA的復(fù)制復(fù)制叉處前導(dǎo)鏈和隨后鏈同時(shí)合成的工作模型聚合酶III全酶引物聚合酶III全酶引物引物體引物體解旋酶解旋酶第3章DNA的復(fù)制復(fù)制的忠實(shí)性

DNA復(fù)制過程是一個(gè)高度精確的過程，據(jù)估計(jì)，大腸桿菌DNA復(fù)制5

109堿基對僅出現(xiàn)一個(gè)誤差，保證復(fù)制忠實(shí)性的原因主要有以下三點(diǎn):

DNA聚合酶的高度專一性（嚴(yán)格遵循堿基配對原則，但錯(cuò)配率為10-4～10-5）

DNA聚合酶的校對功能（錯(cuò)配堿基被3'

-5'外切酶切除）

起始時(shí)以RNA作為引物第3章DNA的復(fù)制DNA聚合酶的校對功能

楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制DNA聚合酶的校對功能聚合酶錯(cuò)配鹼基復(fù)制方向正確核苷酸5′5′5′3′3′3′切除錯(cuò)配核苷酸第3章DNA的復(fù)制起始時(shí)以RNA作為引物的作用

DNA復(fù)制為什么要合成一個(gè)RNA引物，而后又把這個(gè)引物消除呢？這是保證DNA聚合過程高度精確的又一措施。已知DNA聚合酶具有3’5’外切酶功能校對復(fù)制過程中的核苷酸，也就是說聚合酶在開始形成一個(gè)新的磷酸二酯鍵前，總是檢查前一個(gè)堿基是否正確，這就決定了它不能從頭開始合成。因此先合成一條低忠實(shí)性的多核苷酸來開始DNA的合成，并以核糖核苷酸來表示是“暫時(shí)”的，當(dāng)DNA開始聚合以后再以5’3’外切酶的功能切除，以高忠實(shí)性的脫氧核苷酸取而代之，確保復(fù)制的忠實(shí)性。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制真核細(xì)胞DNA復(fù)制的特點(diǎn)

多個(gè)起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)

真核生物的DNA聚合酶

端粒（telemere）復(fù)制第3章DNA的復(fù)制真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶

分子量亞基數(shù)細(xì)胞內(nèi)分布酶活力百分比外切酶活力DNA聚合酶

110-23，000多個(gè)細(xì)胞核～80%無120，000一個(gè)細(xì)胞核和線粒體2%

～15%無-400，000一個(gè)細(xì)胞核+10%～25%

5’-3’外切酶DNA聚合酶

DNA聚合酶

45，000一個(gè)細(xì)胞核10%～15%無楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制端粒酶（telomerase）DNA復(fù)制需要引物，但在線形DNA分子末端不可能通過正常的機(jī)制在引物被降解后合成相應(yīng)的片段.如果沒有特殊的機(jī)制合成末端序列，染色體就會在細(xì)胞傳代中變得越來越短。這一難題是通過端粒酶的發(fā)現(xiàn)才得到了澄清，端粒酶是一種含RNA的蛋白復(fù)合物，實(shí)質(zhì)上是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，它能催化互補(bǔ)于RNA模板的DNA片段的合成，使復(fù)制以后的線形DNA分子的末端保持不變。

初步研究表明，人體中生殖細(xì)胞的端粒長度保持不變，而體細(xì)胞的端粒長度則隨個(gè)體的老化而逐步縮短。對此的一個(gè)推論是：人的生殖細(xì)胞具端粒酶的活力，體細(xì)胞則否。這一問題的解決無疑會有助于對生命衰老的認(rèn)識。5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶第3章DNA的復(fù)制端粒合成的一種模型3′5′TTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3′5′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3′5′AATTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG整合和雜交移位和再雜交端粒合成的完成TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTT5′3′nAA3′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5′3′TTCCCCTnAA3′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5′3′TTAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTn進(jìn)一步加工繼續(xù)延伸動(dòng)畫第3章DNA的復(fù)制楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制真核和原核DNA細(xì)胞復(fù)制比較楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制第二節(jié)

DNA的損傷與修復(fù)

某些物理化學(xué)因子，如紫外線、電離輻射和化學(xué)誘變劑等，都有引起生物突變和致死的作用，其機(jī)理是作用于DNA，造成DNA結(jié)構(gòu)和功能的破壞，稱為DNA的損傷。DNA的修復(fù)主要有以下類型:暗修復(fù)四、誘導(dǎo)修復(fù)（SOS修復(fù)）一、回復(fù)修復(fù)二、切除修復(fù)三、重組修復(fù)

楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制DNA損傷的原因（一）DNA分子的自發(fā)性損傷1、DNA復(fù)制中的錯(cuò)誤校正后的錯(cuò)配率仍約在10-10左右。2、DNA的自發(fā)性化學(xué)變化①堿基的異構(gòu)互變DNA中的4種堿基各自的異構(gòu)體間都可以自發(fā)地相互變化（例如烯醇式與酮式堿基間的互變），這種變化就會使堿基配對間的氫鍵改變，可使腺嘌呤能配上胞嘧啶、胸腺嘧啶能配上鳥嘌呤等，如果這些配對發(fā)生在DNA復(fù)制時(shí)，就會造成子代DNA序列與親代DNA不同的錯(cuò)誤性損傷。第3章DNA的復(fù)制②堿基的脫氨基作用:堿基的環(huán)外氨基有時(shí)會自發(fā)脫落，從而胞嘧啶會變成尿嘧啶、腺嘌呤會變成次黃嘌呤（H）、鳥嘌呤會變成黃嘌呤（X）等，遇到復(fù)制時(shí)，U與A配對、H和X都與C配對就會導(dǎo)致子代DNA序列的錯(cuò)誤變化。胞嘧啶自發(fā)脫氨基的頻率約為每個(gè)細(xì)胞每天190個(gè)。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制③脫嘌呤與脫嘧啶自發(fā)的水解可使嘌呤和嘧啶從DNA鏈的核糖磷酸骨架上脫落下來。一個(gè)哺乳類細(xì)胞在37℃條件下，20h內(nèi)DNA鏈上自發(fā)脫落的嘌呤約1000個(gè)、嘧啶約500個(gè)；估計(jì)一個(gè)長壽命不復(fù)制繁殖的哺乳類細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞）在整個(gè)生活期間自發(fā)脫嘌呤數(shù)約為108，這占細(xì)胞DNA中總嘌呤數(shù)約3%。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制④堿基修飾與鏈斷裂細(xì)胞呼吸的副產(chǎn)物O2-、H2O2等會造成DNA損傷，能產(chǎn)生胸腺嘧啶乙二醇、羥甲基尿嘧啶等堿基修飾物，還可能引起DNA單鏈斷裂等損傷，每個(gè)哺乳類細(xì)胞每天DNA單鏈斷裂發(fā)生的頻率約為5萬次。此外，體內(nèi)還可以發(fā)生DNA的甲基化，結(jié)構(gòu)的其他變化等，這些損傷的積累可能導(dǎo)致老化。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制（二）物理因素引起的DNA損傷1、紫外線引起的DNA損傷DNA分子損傷最早就是從研究紫外線的效應(yīng)開始的。當(dāng)DNA受到最易被其吸收波長（~260nm）的紫外線照射時(shí)，主要是使同一條DNA鏈上相鄰的嘧啶以共價(jià)鍵連成二聚體，相鄰的兩個(gè)T、或兩個(gè)C、或C與T間都可以環(huán)丁基環(huán)（cyclobutanering）連成二聚體，其中最容易形成的是TT二聚體。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制人皮膚因受紫外線照射而形成二聚體的頻率可達(dá)每小時(shí)5×104/細(xì)胞，但只局限在皮膚中，因?yàn)樽贤饩€不能穿透皮膚。但微生物受紫外線照射后，就會影響其生存。紫外線照射還能引起DNA鏈斷裂等損傷。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制2、電離輻射引起的DNA損傷電離輻射損傷DNA有直接和間接的效應(yīng)，直接效應(yīng)是DNA直接吸收射線能量而遭損傷，間接效應(yīng)是指DNA周圍其他分子（主要是水分子）吸收射線能量產(chǎn)生具有很高反應(yīng)活性的自由基進(jìn)而損傷DNA。電離輻射可導(dǎo)致DNA分子的多種變化：①堿基變化主要是由OH-自由基引起，包括DNA鏈上的堿基氧化修飾、過氧化物的形成、堿基環(huán)的破壞和脫落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感。②脫氧核糖變化脫氧核糖上的每個(gè)碳原子和羥基上的氫都能與OH-反應(yīng)，導(dǎo)致脫氧核糖分解，最后會引起DNA鏈斷裂。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制③DNA鏈斷裂這是電離輻射引起的嚴(yán)重?fù)p傷事件，斷鏈數(shù)隨照射劑量而增加。射線的直接和間接作用都可能使脫氧核糖破壞或磷酸二酯鍵斷開而致DNA鏈斷裂。DNA雙鏈中一條鏈斷裂稱單鏈斷裂（singlestrandbroken），DNA雙鏈在同一處或相近處斷裂稱為雙鏈斷裂（doublestrandbroken）。雖然單斷發(fā)生頻率為雙斷的10-20倍，但還比較容易修復(fù)；對單倍體細(xì)胞（如細(xì)菌）一次雙斷就是致死事件。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制④交聯(lián)包括DNA鏈交聯(lián)和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)。同一條DNA鏈上或兩條DNA鏈上的堿基間可以共價(jià)鍵結(jié)合，DNA與蛋白質(zhì)之間也會以共價(jià)鍵相連，組蛋白、染色質(zhì)中的非組蛋白、調(diào)控蛋白、與復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶都會與DNA共價(jià)鍵連接。這些交聯(lián)是細(xì)胞受電離輻射后在顯微鏡下看到的染色體畸變的分子基礎(chǔ)，會影響細(xì)胞的功能和DNA復(fù)制。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制（三）化學(xué)因素引起的DNA損傷1、烷化劑對DNA的損傷烷化劑是一類親電子的化合物，很容易與生物體中大分子的親核位點(diǎn)起反應(yīng)。烷化劑的作用可使DNA發(fā)生各種類型的損傷：①堿基烷基化。烷化劑很容易將烷基加到DNA鏈中嘌呤或嘧啶的N或O上，其中鳥嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻擊，烷基化的嘌呤堿基配對會發(fā)生變化，例如鳥嘌呤N7被烷化后就不再與胞嘧啶配對、而改與胸腺嘧啶配對，結(jié)果會使G-C轉(zhuǎn)變成A-T。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制②堿基脫落。烷化鳥嘌呤的糖苷鍵不穩(wěn)定，容易脫落形成DNA上無堿基的位點(diǎn)，復(fù)制時(shí)可以插入任何核苷酸，造成序列的改變。③斷鏈。DNA鏈的磷酸二酯鍵上的氧也容易被烷化，結(jié)果形成不穩(wěn)定的磷酸三酯鍵，易在糖與磷酸間發(fā)生水解，使DNA鏈斷裂。④交聯(lián)。烷化劑有兩類，一類是單功能基烷化劑，如甲基甲烷碘酸，只能使一個(gè)位點(diǎn)烷基化；另一類是雙功能基烷化劑，化學(xué)武器如氮芥、硫芥等、一些抗癌藥物如環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、絲裂霉素等、某些致癌物如二乙基亞硝胺等均屬此類，其兩個(gè)功能基可同時(shí)使兩處烷基化，結(jié)果就能造成DNA鏈內(nèi)、DNA鏈間、以及DNA與蛋白質(zhì)間的交聯(lián)。第3章DNA的復(fù)制2、堿基類似物、修飾劑對DNA的損傷人工可以合成一些堿基類似物用作促突變劑或抗癌藥物，如5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、2-氨基腺嘌呤（2-AP）等。由于其結(jié)構(gòu)與正常的堿基相似，進(jìn)入細(xì)胞能替代正常的堿基摻入到DNA鏈中而干擾DNA復(fù)制合成，例如5-BU結(jié)構(gòu)與胸腺嘧啶十分相近，在酮式結(jié)構(gòu)時(shí)與A配對，卻又更容易成為烯醇式結(jié)構(gòu)與G配對，在DNA復(fù)制時(shí)導(dǎo)致A-T轉(zhuǎn)換為G-C。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制還有一些人工合成或環(huán)境中存在的化學(xué)物質(zhì)能專一修飾DNA鏈上的堿基或通過影響DNA復(fù)制而改變堿基序列，例如亞硝酸鹽能使C脫氨變成U，經(jīng)過復(fù)制就可使DNA上的G-C變成A-T對；羥胺能使T變成C，結(jié)果是A-T改成C-G對；黃曲霉素B也能專一攻擊DNA上的堿基導(dǎo)致序列的變化，這些都是誘發(fā)突變的化學(xué)物質(zhì)或致癌劑。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制DNA損傷的后果①點(diǎn)突變（pointmutation）指DNA上單一堿基的變異。嘌呤替代嘌呤（A與G之間的相互替代）、嘧啶替代嘧啶（C與T之間的替代）稱為轉(zhuǎn)換（transition）；嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤則稱為顛換（transvertion）。②缺失（deletion）指DNA鏈上一個(gè)或一段核苷酸的消失。③插入（insertion）指一個(gè)或一段核苷酸插入到DNA鏈中。在為蛋白質(zhì)編碼的序列中如缺失及插入的核苷酸數(shù)不是3的整倍數(shù)，則發(fā)生讀框移動(dòng)（readingframeshift），使其后所譯讀的氨基酸序列全部混亂，稱為移碼突變（frame-shiftmutation）。第3章DNA的復(fù)制④倒位或轉(zhuǎn)位（transposition）指DNA鏈重組使其中一段核苷酸鏈方向倒置、或從一處遷移到另一處。⑤雙鏈斷裂已如前述，對單倍體細(xì)胞一個(gè)雙鏈斷裂就是致死性事件。突變或誘變對生物可能產(chǎn)生4種后果：①致死性；②喪失某些功能；③改變基因型（genotype）而不改變表現(xiàn)型（phenotype）；④發(fā)生了有利于物種生存的結(jié)果，使生物進(jìn)化。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制回復(fù)修復(fù)這是較簡單的修復(fù)方式，一般都能將DNA修復(fù)到原樣。1.光修復(fù)2.單鏈斷裂的重接3.堿基的直接插入4.烷基的轉(zhuǎn)移楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制烷基的轉(zhuǎn)移在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有一種O6甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶，能直接將甲基從DNA鏈鳥嘌呤O6位上的甲基移到蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基上而修復(fù)損傷的DNA。這個(gè)酶的修復(fù)能力并不很強(qiáng)，但在低劑量烷化劑作用下能誘導(dǎo)出此酶的修復(fù)活性。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制堿基的直接插入

DNA鏈上嘌呤的脫落造成無嘌呤位點(diǎn)，能被DNA嘌呤插入酶（insertase）識別結(jié)合，在K+存在的條件下，催化游離嘌呤或脫氧嘌呤核苷插入生成糖苷鍵，且催化插入的堿基有高度專一性、與另一條鏈上的鹼基嚴(yán)格配對，使DNA完全恢復(fù)。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制單鏈斷裂的重接

DNA單鏈斷裂是常見的損傷，其中一部分可僅由DNA連接酶（ligase）參與而完全修復(fù)。此酶在各類生物各種細(xì)胞中都普遍存在，修復(fù)反應(yīng)容易進(jìn)行。但雙鏈斷裂缺幾乎不能修復(fù)。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制1.光修復(fù)這是最早發(fā)現(xiàn)的DNA修復(fù)方式。修復(fù)是由細(xì)菌中的DNA光解酶（photolyase）完成，此酶能特異性識別紫外線造成的核酸鏈上相鄰嘧啶共價(jià)結(jié)合的二聚體，并與其結(jié)合，這步反應(yīng)不需要光；結(jié)合后如受300-600nm波長的光照射，則此酶就被激活，將二聚體分解為兩個(gè)正常的嘧啶單體，然后酶從DNA鏈上釋放，DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。后來發(fā)現(xiàn)類似的修復(fù)酶廣泛存在于動(dòng)植物中，人體細(xì)胞中也有發(fā)現(xiàn)。第3章DNA的復(fù)制切除修復(fù)（excisionrepair）是修復(fù)DNA損傷最為普遍的方式，對多種DNA損傷包括堿基脫落形成的無堿基位點(diǎn)、嘧啶二聚體、堿基烷基化、單鏈斷裂等都能起修復(fù)作用。這種修復(fù)方式普遍存在于各種生物細(xì)胞中，也是人體細(xì)胞主要的DNA修復(fù)機(jī)制。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制①首先由核酸酶識別DNA的損傷位點(diǎn)，在損傷部位的5'側(cè)切開磷酸二酯鍵。不同的DNA損傷需要不同的特殊核酸內(nèi)切酶來識別和切割。②由5'—3'核酸外切酶將有損傷的DNA片段切除。③在DNA聚合酶的催化下，以完整的互補(bǔ)鏈為模板，按5'—3'方向DNA鏈，填補(bǔ)已切除的空隙。④由DNA連接酶將新合成的DNA片段與原來的DNA斷鏈連接起來。這樣完成的修復(fù)能使DNA恢復(fù)原來的結(jié)構(gòu)。第3章DNA的復(fù)制DNA的損傷和切除修復(fù)堿基丟失堿基缺陷或錯(cuò)配結(jié)構(gòu)缺陷切開核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA連接酶AP核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切開切除修復(fù)連接糖苷酶插入酶堿基取代第3章DNA的復(fù)制DNA的重組修復(fù)①受損傷的DNA鏈復(fù)制時(shí)，產(chǎn)生的子代DNA在損傷的對應(yīng)部位出現(xiàn)缺口。②完整的另一條母鏈DNA與有缺口的子鏈DNA進(jìn)行重組交換，將母鏈DNA上相應(yīng)的片段填補(bǔ)子鏈缺口處，而母鏈DNA出現(xiàn)缺口。③以另一條子鏈DNA為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填補(bǔ)母鏈DNA的缺口，最后由DNA連接酶連接，完成修補(bǔ)。第3章DNA的復(fù)制SOS反應(yīng)的機(jī)制“SOS”是國際上通用的緊急呼救信號。SOS修復(fù)是指DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷、細(xì)胞處于危急狀態(tài)時(shí)所誘導(dǎo)的一種DNA修復(fù)方式，修復(fù)結(jié)果只是能維持基因組的完整性，提高細(xì)胞的生成率，但留下的錯(cuò)誤較多，故又稱為錯(cuò)誤傾向修復(fù)（error-pronerepair），使細(xì)胞有較高的突變率。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系范樹國第3章DNA的復(fù)制當(dāng)DNA兩條鏈的損傷鄰近時(shí)，損傷不能被切除