酶促反應動力學

酶促反應動力學生化反應動力學●單底物酶反應動力學●多底物酶反應動力學●各種因素對酶反應速度的影響●微生物代謝調節(jié)的生化基礎第2頁,共115頁，2024年2月25日，星期天生物在表觀上所顯示的一切生理現(xiàn)象(實為體內生物化學反應)都與酶的作用密切相關。因此，研究生化反應動力學也就是研究酶催化反應動力學。微生物的生長和產(chǎn)物的生成都是一系列復雜的酶催化反應的結果。要了解微生物發(fā)酵動力學必須首先了解酶反應動力學。酶動力學主要研究酶催化反應的速度及各種因素（包括酶濃度、底物濃度、產(chǎn)物、pH值、溫度、抑制劑和激活劑等）對反應速度的影響，并提出從反應物到產(chǎn)物之間可能進行的歷程。第3頁,共115頁，2024年2月25日，星期天單底物、單產(chǎn)物反應；酶促反應速度一般在規(guī)定的反應條件下，用單位時間內底物的消耗量和產(chǎn)物的生成量來表示；反應速度取其初速度，即底物的消耗量很?。ㄒ话阍?﹪以內）時的反應速度；底物濃度遠遠大于酶濃度。（[S]》[E]）研究前提一、底物濃度對酶反應速率的影響第4頁,共115頁，2024年2月25日，星期天產(chǎn)物0時間初速度酶促反應速度逐漸降低酶促反應的時間進展曲線第5頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

在其他因素不變的情況下，底物濃度對反應速度的影響呈矩形雙曲線關系。反應初速度隨底物濃度變化曲線第6頁,共115頁，2024年2月25日，星期天當?shù)孜餄舛容^低時反應速度與底物濃度成正比；反應為一級反應。[S]VVmax第7頁,共115頁，2024年2月25日，星期天隨著底物濃度的增高反應速度不再成正比例加速；反應為混合級反應。[S]VVmax第8頁,共115頁，2024年2月25日，星期天當?shù)孜餄舛雀哌_一定程度反應速度不再增加，達最大速度；反應為零級反應[S]VVmax第9頁,共115頁，2024年2月25日，星期天E+SESP+Ek1k2k3（一）中間絡合物學說

k4三個假設：（1）E與S形成ES復合物的反應是快速平衡反應，而ES分解為E及P的反應為慢反應，反應速度取決于慢反應即

V＝k3[ES]。（2）S的總濃度遠遠大于E的總濃度，因此在反應的初始階段，S的濃度可認為不變即[S]＝[St]。（3）P→0忽略這步反應第10頁,共115頁，2024年2月25日，星期天（二）酶促反應的動力學方程式1、米氏方程的推導第11頁,共115頁，2024年2月25日，星期天1913年Michaelis和Menten提出反應速度與底物濃度關系的數(shù)學方程式，即米－曼氏方程式，簡稱米氏方程(Michaelisequation)。[S]：底物濃度V：不同[S]時的反應速度Vmax：最大反應速度(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常數(shù)(Michaelisconstant)

第12頁,共115頁，2024年2月25日，星期天穩(wěn)態(tài)時ES濃度不變

反應速度

V=k3[ES]ES的生成速度=消耗速度

k1[E][S]=k2[ES]+k3[ES]E的質量平衡方程

[E]=[Et]-[ES]E+SESP+Ek1k2k3(Ⅲ)(Ⅰ)(Ⅱ)第13頁,共115頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共115頁，2024年2月25日，星期天穩(wěn)態(tài)時ES濃度不變反應速度

V=k3[ES]ES的生成速度=消耗速度

k1[E][S]=k2[ES]+k3[ES]E的質量平衡方程

[E]=[Et]-[ES]E+SESP+Ek1k2k3V=V[S]Km+[S]米氏方程V=Vmax=k3[ES]max=k3[Et]Km=

k2+k3k1米氏常數(shù)第15頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

a.當[S]很小時V=V[S]/Km一級反應反應初速度隨底物濃度變化曲線米氏曲線V=V[S]Km+[S]b.當[S]很大時V=V[S]/[S]=V

0

級反應混合級第16頁,共115頁，2024年2月25日，星期天Km=?Km=[S]V=V[S]Km+[S]若V＝V/2V2＝V[S]Km+[S]1Km+[S]=2[S]第17頁,共115頁，2024年2月25日，星期天2、動力學參數(shù)的意義（1）米氏常數(shù)Km的意義Km＝[S]∴Km值等于酶促反應速度為最大反應速度一半時的底物濃度，單位是mol/L。2＝Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2第18頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

①Km是酶的特性常數(shù)：

與pH、溫度、離子強度、酶及底物種類有關，與酶濃度無關，可以鑒定酶。酶底物Km(mmol/L)脲酶尿素25溶菌酶6-N-乙酰葡萄糖胺0.006葡萄糖-6-磷酸脫氫酶6-磷酸-葡萄糖0.058胰凝乳蛋白酶苯甲酰酪氨酰胺2.5甲酰酪氨酰胺12.0乙酰酪氨酰胺32.0第19頁,共115頁，2024年2月25日，星期天②可以判斷酶的專一性和天然底物Km值最小的底物——最適底物/天然底物1/Km近似表示酶對底物的親和力：1/Km越大、親和力越大第20頁,共115頁，2024年2月25日，星期天Km=

k2+k3k1Km≈k2（分離能力）/k1（親合能力）E+SESP+Ek1k2k3Km越小，親和力越強。[S]很小時，反應速度就能達到很大。性能優(yōu)，代謝中這類酶更為重要k2>>k3時第21頁,共115頁，2024年2月25日，星期天④Km可幫助判斷某代謝反應的方向和途徑催化可逆反應的酶對正/逆兩向底物Km不同

——Km較小者為主要底物③根據(jù)Km：判斷某[s]時v與Vmax的關系判斷抑制劑的類型第22頁,共115頁，2024年2月25日，星期天乳酸脫氫酶（1.7×10-5）丙酮酸脫氫酶（1.3×10-3）丙酮酸脫羧酶（1.0×10-3）丙酮酸乳酸乙酰CoA乙醛丙酮酸濃度較低時：代謝哪條途徑?jīng)Q定于Km最小的酶一底物多酶反應第23頁,共115頁，2024年2月25日，星期天（2）Vmax和k3（kcat)的意義一定酶濃度下，酶對特定底物的Vmax也是一個常數(shù)。[S]很大時，Vmax＝k3[E]。k3表示當酶被底物飽和時，每秒鐘每個酶分子轉換底物的分子數(shù)，——又稱為轉換數(shù)、催化常數(shù)kcatkcat越大，酶的催化效率越高第24頁,共115頁，2024年2月25日，星期天（3）kcat/km的意義：V=Vmax[S]Km+[S]∵Vmax=kcat[Et]∴V=kcat[Et][S]Km+[S]當[S]<<Km時，[E]＝[Et]第25頁,共115頁，2024年2月25日，星期天是E和S反應形成產(chǎn)物的表觀二級速率常數(shù)。其大小可用于比較酶的催化效率。kcat/km＝

kcat/km的上限為k1,即生成ES的速率，即酶的催化效率不超過E和S形成ES的結合速率kcat/km的大小可以比較不同酶或同一種酶催化不同底物的催化效率。第26頁,共115頁，2024年2月25日，星期天（1）Lineweaver-Burk林-貝氏雙倒數(shù)作圖法3、Km與V的求取第27頁,共115頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共115頁，2024年2月25日，星期天蔗糖酶米氏常數(shù)（Km）的測定1.配12支蔗糖底物溶液，濃度分別為0、0.005、0.00625、0.0075、0.00875、0.010、0.0125、0.015、0.02、0.025、0.0375、0.050M，在35℃水浴保溫；2.加入3U/ml已在35℃水浴保溫的酶溶液，準確作用5分鐘，終止反應；3.各吸取0.5ml反應液與3，5-二硝基水楊酸，沸水浴5分鐘，冷卻后在540nm測定吸光度OD值；4.作圖第29頁,共115頁，2024年2月25日，星期天（2）Eadie-Hofstee作圖法第30頁,共115頁，2024年2月25日，星期天vV[S]Vmax斜率－Km第31頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

（3）Hanes-Woolf作圖法

第32頁,共115頁，2024年2月25日，星期天斜率=1/VmKm/Vm-Km[S]/V[S]第33頁,共115頁，2024年2月25日，星期天vVmax[S]－3Km－2Km－Km（4）Eisenthal和Cornish-Bowden線性作圖法第34頁,共115頁，2024年2月25日，星期天二、多底物的酶促反應動力學

分為單底物、雙底物和三底物反應1.酶促反應按底物分子數(shù)分類：第35頁,共115頁，2024年2月25日，星期天①有序反應（orderedreactions）領先底物釋放釋放A和Q競爭地與自由酶結合（1）序列反應或單－置換反應2.多底物反應按動力學機制分類：第36頁,共115頁，2024年2月25日，星期天②隨機反應（randomreactions）如肌酸激酶使肌酸磷酸化的反應第37頁,共115頁，2024年2月25日，星期天AAEPE’PEE’QEQEBB

A和Q競爭自由酶E形式

B和P競爭修飾酶形式E’A和Q不同E’結合

B和P也不與E結合。(2)乒乓反應或雙－置換反應第38頁,共115頁，2024年2月25日，星期天3.雙底物反應的動力學方程（1）序列機制的底物動力學方程及動力學圖——在B的濃度達到飽和時A的米氏常數(shù)——在A的濃度達到飽和時B的米氏常數(shù)——底物A與酶結合的解離常數(shù)——底物A、B都達到飽和時最大反應速率第39頁,共115頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共115頁，2024年2月25日，星期天（2）乒乓機制的底物動力學方程及動力學圖——在B的濃度達到飽和時A的米氏常數(shù)——在A的濃度達到飽和時B的米氏常數(shù)——底物A、B都達到飽和時最大反應速率第41頁,共115頁，2024年2月25日，星期天第42頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

三、酶的抑制作用失活作用：使酶Pr變性而引起酶活力喪失。抑制作用：使酶活力下降但不引起變性。抑制劑：能引起抑制作用的物質。第43頁,共115頁，2024年2月25日，星期天（一）抑制程度的表示方法V0：Vi：不加入抑制劑時的反應速率加入抑制劑后的反應速率以反應速率的變化表示第44頁,共115頁，2024年2月25日，星期天1.相對活力分數(shù)（殘余活力分數(shù)）2.相對活力百分數(shù)（殘余活力百分數(shù)）V0ViViV0第45頁,共115頁，2024年2月25日，星期天3.抑制分數(shù)——指被抑制而失去活力的分數(shù)V0Vi4.抑制百分數(shù)ViV0

抑制率第46頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

依據(jù)：

能否用透析、超濾等物理方法

除去抑制劑，使酶復活。不可逆抑制與可逆抑制（二）抑制作用的分類第47頁,共115頁，2024年2月25日，星期天1、不可逆抑制作用：抑制劑與酶必需基團以牢固的共價鍵相連很多為劇毒物質重金屬、有機磷、有機汞、有機砷、氰化物、青霉素、毒鼠強等。不可逆抑制第48頁,共115頁，2024年2月25日，星期天不可逆抑制劑

非專一性不可逆抑制劑（作用于一/幾類基團）

專一性不可逆抑制劑（作用于某一種酶的活性部位基團）2、不可逆抑制劑不可逆抑制第49頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

（1）非專一性不可逆抑制劑①重金屬離子

Ag+、

Cu2+、

Hg2+、

Pb2+、

Fe3+

高濃度時可使酶蛋白變性失活；低濃度時對酶活性產(chǎn)生抑制。

——通過加入EDTA解除第50頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

H2N-CH-COOH

CH2

SH

H2N-CH-COOH

CH2

S-CH2COOHICH2COOHHI②烷化劑（多為鹵素化合物）++碘乙酸第51頁,共115頁，2024年2月25日，星期天③有機磷化合物（敵百蟲、沙林）第52頁,共115頁，2024年2月25日，星期天膽堿酯酶OHPOC2H5OC2H5S有機磷農(nóng)藥部分第53頁,共115頁，2024年2月25日，星期天膽堿乙酰化酶膽堿酯酶膽堿乙酰膽堿積累導致神經(jīng)中毒癥狀第54頁,共115頁，2024年2月25日，星期天如何緊急救治？排毒洗胃、喝雞蛋清牛奶導泄、利尿血液透析（清除游離狀態(tài)毒物）解毒藥：解磷定第55頁,共115頁，2024年2月25日，星期天ROOROOROXROO—EP+E—OHP+HX有機磷化合物羥基酶磷酰化酶(失活)酸ROOROO—EP+-CHNOH磷?；?失活)N+CH3-CHNN+CH3OOROOR+E—OH

P解磷定解毒------解磷定(PAM)：第56頁,共115頁，2024年2月25日，星期天④有機汞、有機砷化合物——與酶分子中-SH作用；

可通過加入過量巰基化合物解除。第57頁,共115頁，2024年2月25日，星期天⑤氰化物、硫化物和CO

——與酶中金屬離子形成穩(wěn)定的絡合物如氰化物與含鐵卟啉細胞色素氧化酶結合⑥青霉素（penicillin）與細菌糖肽轉肽酶Ser-OH活性，影響細胞壁合成。第58頁,共115頁，2024年2月25日，星期天（2）專一性不可逆抑制劑

①Ks型具有底物類似的結構——（設計）帶有一活潑基團：與必需基團反應（抑制）

∵利用對酶親合性進行修飾∴親合標記試劑（affinitylabelingreagent）第59頁,共115頁，2024年2月25日，星期天②Kcat型具有底物類似的結構本身是酶的底物還有一潛伏的反應基團“自殺性底物”

第60頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

抑制作用可通過透析等方法除去。原因：非共價鍵結合可逆抑制競爭性抑制(competitiveinhibition)非競爭性抑制(non-competitiveI.）反競爭性抑制(uncompetitiveI.)

3、可逆抑制作用：第61頁,共115頁，2024年2月25日，星期天（1）競爭性（Competitive)抑制第62頁,共115頁，2024年2月25日，星期天I：抑制劑（inhibitor）第63頁,共115頁，2024年2月25日，星期天第64頁,共115頁，2024年2月25日，星期天【舉例】

丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶琥珀酸琥珀酸脫氫酶FADFADH2延胡索酸琥珀酸第65頁,共115頁，2024年2月25日，星期天競爭性抑制第66頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

磺胺類藥物的抑菌機制：與對氨基苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶二氫蝶呤啶＋對氨基苯甲酸＋谷氨酸二氫葉酸合成酶二氫葉酸第67頁,共115頁，2024年2月25日，星期天利用競爭性抑制是藥物設計主要思路磺胺類藥抗菌機理：（與對氨基苯甲酸是結構類似物）競爭性抑制細菌葉酸形成，抑制細菌繁殖人通過食物直接補充葉酸，對人無毒害。第68頁,共115頁，2024年2月25日，星期天生物堿麻醉—競爭性替代生物堿—嗎啡、海洛因、可卡因、尼古丁

嗎啡海洛因第69頁,共115頁，2024年2月25日，星期天麻醉機理源自—37C醫(yī)學網(wǎng)痛覺神經(jīng)信號阿片—鴉片類物質生物堿競爭性替代腦肽—麻醉致幻腦肽(E)控制痛覺信號的釋放第70頁,共115頁，2024年2月25日，星期天抑制物（2）非競爭性（Non-competitive)抑制無法形成產(chǎn)物第71頁,共115頁，2024年2月25日，星期天Noncompetitiveinhibition第72頁,共115頁，2024年2月25日，星期天第73頁,共115頁，2024年2月25日，星期天（3）反競爭性（Uncompetitive）抑制第74頁,共115頁，2024年2月25日，星期天第75頁,共115頁，2024年2月25日，星期天第76頁,共115頁，2024年2月25日，星期天1：反應體系不加I2：體系中加入一定量不可逆抑制劑3：體系中加入一定量可逆抑制劑v123[E](三)可逆和不可逆抑制作用的鑒別第77頁,共115頁，2024年2月25日，星期天[E]v不可逆抑制劑的作用[E]v可逆抑制劑的作用[I]→[I]第78頁,共115頁，2024年2月25日，星期天(四）可逆抑制作用動力學第79頁,共115頁，2024年2月25日，星期天1.競爭性抑制第80頁,共115頁，2024年2月25日，星期天消去[ES]第81頁,共115頁，2024年2月25日，星期天第82頁,共115頁，2024年2月25日，星期天第83頁,共115頁，2024年2月25日，星期天斜率斜率第84頁,共115頁，2024年2月25日，星期天競爭性：I與S與酶活性中心結合機會均等

V下降發(fā)生抑制Km增大親和力Vmax不變[S]增大，I結合機率減小第85頁,共115頁，2024年2月25日，星期天Km變大，Vmax不變第86頁,共115頁，2024年2月25日，星期天2.非競爭性抑制第87頁,共115頁，2024年2月25日，星期天第88頁,共115頁，2024年2月25日，星期天截距第89頁,共115頁，2024年2月25日，星期天V下降發(fā)生抑制Km不變親和力不受影響Vmax減小部分酶始終失活第90頁,共115頁，2024年2月25日，星期天Km不變，Vmax變小

第91頁,共115頁，2024年2月25日，星期天3.反競爭性抑制作用第92頁,共115頁，2024年2月25日，星期天第93頁,共115頁，2024年2月25日，星期天第94頁,共115頁，2024年2月25日，星期天Km、Vmax都變小第95頁,共115頁，2024年2月25日，星期天第96頁,共115頁，2024年2月25日，星期天四、影響酶催化反應速率的因素底物濃度酶濃度抑制劑第97頁,共115頁，2024年2月25日，星期天上圖反映出溫度如何影響酶活力？產(chǎn)物累積量相對酶活％

最適溫度

最適溫度動物酶

35~40℃植物酶40~50℃微生物大部分

40~50℃?zhèn)€別高溫菌90℃以上（一）溫度對酶反應的影響第98頁,共115頁，2024年2月25日，星期天溫度越高，活化分子越多，反應速度快；酶變性時間越短，反應速度下降也迅速。鐘罩型曲線第99頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

（二）pH對酶反應的影響最適pH時的酶活力最大最適pH因酶而異，多數(shù)酶在7.0左右是酶的特性之一唾液淀粉酶精氨酸酶胃蛋白酶第100頁,共115頁，2024年2月25日，星期天pH對酶活的影響：

pH的改變破壞酶的空間構象，引起酶活性的喪失（可逆不可逆）；pH的改變影響酶活性中心催化基團的解離，從而使得底物轉變成產(chǎn)物的過程受到影響；pH的改變影響酶活性中心結合基團的解離狀態(tài)，使得底物不能與其結合；pH的改變影響底物的解離狀態(tài)，或者使底物不能與酶結合，或者結合后不能生成產(chǎn)物。第101頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

（三）激活劑對酶反應的影響第102頁,共115頁，2024年2月25日，星期天①無機離子陽離子

K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Zn2+等陰離子

Cl-、Br-等②中等大小的有機分子③某些激酶第103頁,共115頁，2024年2月25日，星期天產(chǎn)物抑制：在酶反應中，產(chǎn)物在釋出之前可以和酶以復合物(EP)的形式存在，也即產(chǎn)物可以占領酶分子上的特殊位點，從而導致酶的催化速度下降。

（四）產(chǎn)物對酶反應的影響第104頁,共115頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)其化學組成可將酶分為：

簡單蛋白酶：只需要其蛋白質部分就具有催化功能的酶。復合蛋白酶：需要有非蛋白成分協(xié)助的酶，也稱“結合蛋白質酶”復合蛋白酶的非蛋白成分稱為輔因子或輔基，金屬酶需要Mg2+、Fe2+、Zn2+等金屬作輔基。（五）輔酶的影響其它一些酶則需要小分子有機化合物如B族維生素作為輔因子，稱為輔酶。第105頁,共115頁，2024年2月25日，星期天輔酶是某些酶的必需組成部分。沒有它，酶不表現(xiàn)活性；加入它，在達到酶蛋白和輔酶物質確定的比例以前，活性隨加入的輔酶物質的量而成比例的升高。輔酶物質包括三種類型：二是輔酶，它與酶蛋白結合較松，可看成是雙底物反應中的底物之一，也可看成是活化劑。一是載體底物，實際上可看作是某些雙底物酶反應中的一種底物。三是輔基(protheticgroup)，一般與酶蛋白結合緊密，但對脫去輔基的酶蛋白來說，它起著類似活化劑的作用。第106頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

理解微生物代謝活動(途徑及其控制)的意義以便提出實用的生化問題，并弄清楚環(huán)境中哪些因素有可能影響產(chǎn)品產(chǎn)量，而必須嚴加控制是很重要的。

微生物經(jīng)過長期的自然選擇，具備了一套完美的代謝調節(jié)機制，平衡各代謝途徑基質的流通量和反應速率，以適應外界環(huán)境的變化。在細胞內，除細胞膜水平的底物滲透性外，有酶活性的調節(jié)和酶量(合成)的調節(jié)兩種不同的酶調節(jié)機制。五、微生物代謝調節(jié)的生化基礎第107頁,共115頁，2024年2月25日，星期天一、酶活性的調節(jié)

微生物代謝調節(jié)的主要方式是通過小分子化合物調節(jié)酶促反應的速度。這些小分子化合物一般存在于細胞內，是由細胞自己產(chǎn)生的。通過它們對代謝途徑中關鍵酶活性的抑制和激活作用，有效地控制每種基本代謝過程。細胞中蛋白質(酶)生物活性的調節(jié)可以歸納為以下5種方式：共價修飾、締合與解離、競爭性抑制、變構(或副位)效應和基因表達。基因表達是一種調節(jié)酶量合成，使酶活性發(fā)生變動的代謝調節(jié)作用(酶的誘導和阻遏)，第108頁,共115頁，2024年2月25日，星期天（一）共價修飾作用

蛋白質憑借其分子中一個或多個氨基酸殘基與一種化學基團進行共價連接或拆開，而使其活性發(fā)生改變。這種基團通常是磷酸根，共價結合部位為絲氨酸殘基的-CH2OH。1、可逆共價修飾作用細胞中有些酶以活性形式和非活性形式存在，而且兩種形式可以通過另外的酶的催化作用進行共價修飾而互相轉換。酶的可逆性共價修飾作用有兩重意義：

(1)可在短時間內生成大量活性改變了的酶，有效地控制細胞的代謝狀況；

(2)可逆修飾更易做到為響應代謝環(huán)境的變化而控制酶的活性。這一系統(tǒng)具有能隨機應變的特點，因而處在不斷活化和鈍化狀態(tài)。第109頁,共115頁，2024年2月25日，星期天2、不可逆共價調節(jié)

無活性的酶原當功能需要時，被相應的蛋白酶作用切去一小段肽鏈而活化，故又稱為酶原激活。酶原變?yōu)槊甘遣豢赡娴?，一旦這些生成的蛋白酶完成了它們的使命以后，便被降解而不再恢復為酶原。這種酶活性的關閉作用是極其重要的，胰蛋白酶原轉變成胰蛋白酶的過程就是這種共價結構