動態(tài)顯色法檢測4種清熱解毒類中藥注射液中細菌內(nèi)毒素含量

動態(tài)顯色法檢測4種清熱解毒類中藥注射液中細菌內(nèi)毒素含量目的：建立定量檢測4種清熱解毒類中藥注射液中細菌內(nèi)毒素的試驗方法。方法：承受動態(tài)顯色法，測定溫度為〔37±0.5〕405nm，預(yù)設(shè)〔四部〕4〔驗中標準曲線的相關(guān)系數(shù)r為0.999；清開靈注射液、復(fù)方半邊蓮注射液、茵梔黃200、125、75、12.5倍及以下稀釋倍數(shù)時對50%～200%1.66、1.04、0.62、0.104EU/mL，均低于各樣品規(guī)定的限值。結(jié)4結(jié)果穩(wěn)定牢靠。OBJECTIVE：Tosetupthemethodforquantitativedeterminationofbacterialendotoxinin4kindsofheat-clearinganddetoxifyingTCMinjections.METHODS：Thekineticchromogenicassay〔KCA〕methodwasused.Thedeterminationconditionsincludeddetectiontemperature〔37±0.5〕℃，detectionwavelength405nm，presetabsorbance〔A〕0.1，andreactiontime3600s.Accordingtophotometrymethodandguidanceprinciplegeneralruleofbacterialendotoxintestin2023editionofChinesePharmacopoeia〔partⅣ，reliabilitytestand interference test of standard curve were conducted. The non-interferenceconcentrationof4type〔Qingkailinginjection，CompoundBanbianlianinjection，Yinzhihuang injection and Shuanghuanglian injection〕was determined andquantitativedeterminationofbacterialendotoxinwasalsoconducted.RESULTS：Thecorrelationcoefficientrofstandardcurvewas0.999.Qingkailinginjection，CompoundBanbianlianinjection，YinzhihuanginjectionandShuanghuanglianinjectiondidn’tinterferewiththedetectionoftachypleusamebocytelysatein200，125，75and12.5timesandbelowdilutiontimesrespectively.Therecoverieswereandthecontentsofbacterialendotoxininsampleswere1.66，1.04，0.62，0.104 EU/mL，which were all lower than the limits of samples.suitableforthedetectionofbacterialendotoxinin4kindsofTCMinjections.Themethodissimple，convenient，stableandreliable.KEYWORDSKineticchromogenicassay；Heat-clearinganddetoxifying；TCMinjection；Bacterialendotoxin；Interferencetest4[1-8][9-11]2023年3種分別收載在《國家中成藥標準匯編：中成〔復(fù)方半邊蓮注射雙黃連注射液〕和WS3-B-2736-97〔茵梔黃注射液〕中。這4種中藥注射液的熱原檢查方法4種均〔1～5ng/kg〕的內(nèi)毒素進入人體即可引起發(fā)熱反響[12]；大劑量的細菌內(nèi)毒素可引起機體發(fā)生內(nèi)毒素休克、彌散性血管內(nèi)凝血、多器官衰竭等反響甚至死亡[13-15]。長、儲存、運輸、生產(chǎn)過程的特別性，易受到微生物污染，加之細菌內(nèi)毒素本身具有水溶性、耐熱性、吸附性及不揮發(fā)性等性質(zhì)[16]，使中藥注射液中的細菌內(nèi)assay，KCA〕是光度測定法中顯色基質(zhì)法靈敏度高、適用性強、操作簡便，可批量檢測故能節(jié)約時間和本錢。本爭論承受KCA對上述4種清熱解毒類中藥注射液的細菌內(nèi)毒素含量進展檢測，以建立4種中藥注射液中細菌內(nèi)毒素的定量檢測方法。材料儀器MultiskanFC型內(nèi)毒素儀〔賽默飛世爾科技公司；BioProde5.2〔湛江安度斯生物2H-2BLENDER渦旋振蕩混合器〔儀器廠。藥品與試劑清開靈注射液〔河南省神農(nóng)藥業(yè)，批號：1608041、16071102、1604040，規(guī)格：10mL支；復(fù)方半邊蓮注射液〔河南同源制藥，批1612011704011707012mL支；茵梔黃注射液〔神威藥業(yè)集團170611D170612D170613D10mL支；雙黃連注射液〔河南福森藥業(yè)集團，批號：1602023、1604363、1604413，規(guī)20mL支；細菌內(nèi)毒素工作標準品〔CS150601-20238，規(guī)格：支〕均來源于中國食品藥品檢定爭論院；KCA鱟試劑〔批號：1604220，規(guī)格：0.35mL/20～0.01EU/mL、細菌內(nèi)毒素檢查反響板〔1510080〕均來源于湛江安度斯生物。方法供試品細菌內(nèi)毒素限值確實定K=5EU〔kg·h。首先去除稀釋液的最大允許細菌內(nèi)毒素KKs=K-KM為人每千克體質(zhì)量每小時可承受的最大供試品劑量，以mL/〔kg·h〕表示。按供試品說明書規(guī)定，取每日人用最大體積V進展60kg250mL葡萄糖注射液或氯化1h計算，M=V/6012023年版《中國〔四部〕規(guī)定[17]，由于藥物使用途徑不同，為保證安全用藥，藥品的L1/2～1/31/3L。通過L2.0、5.0、3.0、1.0EU/mL。標準曲線牢靠性試驗〔四部〕方法操作[17]。1BET800μL15minBET水稀釋成1.0、0.1、0.01EU/mL3個濃度，同時設(shè)陰性比照管。另取KCA鱟試劑，加0.35mLBET水，充分溶解。取上述CSE25μL，加至32KCA，吸〔A〕測定條件：溫度〔37±0.5〕405nmA0.1，反響時間〔T〕3600s，儀器自動以T的對數(shù)值〔lgT〕為橫坐標，以質(zhì)量濃度〔c〕的對數(shù)值lg〕為縱坐標，繪制標準曲線，計算相關(guān)系數(shù)〔。供試品干擾試驗細菌內(nèi)毒素系列溶液〔C溶液〕1.0、0.1、EU/mL3CSEE1.0、E0.1、E0.01。供試品溶液〔A溶液〕的稀釋在不超過最大稀釋倍數(shù)〔MVD〕下用BET24S1S2S3、S4?！睟溶液0.1EU/mL濃度的細菌內(nèi)毒λmS10.2EU/mLCSE溶液混合，即得到0.1EU/mLS2T0.1。同樣S1T0.1、S3T0.1、S4T0.1一系列的供試品陽性溶液。KCA鱟試劑反響取A、B、CKCA25μL，加至2BET水作為陰性比照〔即D溶液2孔。依照“2.2”項下條件測定。依據(jù)標準曲線所得回歸方程計算各供試品ctcS，按下式計算該試驗條RR〔cS-c50～200%之間。供試品細菌內(nèi)毒素含量測定EU/mL表示，并進展樣品細菌內(nèi)毒素回收率測定。3結(jié)果標準曲線的牢靠性〔四部〕[17]及鱟試劑使用說明書對光度測定法r確實定值T〔CV〕≤10%。將標準曲線進展線性回歸，得到回T>3600s〔標準曲線最T3397.5sCV均%?？梢?，標準曲線試驗成立，說明試驗有效。KCA1。供試品干擾試驗結(jié)果清開靈注射液、復(fù)方半邊蓮注射液、茵梔黃注射液、雙黃連注射液分別在50%～200%，說明在該稀釋倍數(shù)4種注射液的最大無干擾濃度200、125、75、12.5倍。122。供試品中細菌內(nèi)毒素的測定〔lgT=2.8429分別計算4個品種A溶液最大無干擾濃度下的細菌內(nèi)毒素含量。結(jié)果，各組平CV3600s量實測值均<0.0083EU/mL，說明清開靈注射液、復(fù)方半邊蓮注射液、茵梔黃注均不超過各品種規(guī)定的細菌內(nèi)毒素限值。4爭論[1]、肺炎、高燒，具有解熱作用[2]，能有效抑制細菌內(nèi)毒素等致熱原引起的家兔發(fā)熱反響。復(fù)方半邊蓮[3]。茵梔黃藥注射劑，具有清熱、解毒、利濕、退黃的成效[4]悉黃、胸脅脹痛、惡心嘔吐、小便黃赤，急性、遷延性、慢性肝炎等屬上述證性腭扁桃體炎等[5-6]疾病的首選藥物之一[7-8]。自二十世紀八九十年月起中藥抗細菌內(nèi)毒素的作用開頭引起寬闊學(xué)者的重視。有爭論[18]報道，大青葉提取物具有體外破壞細菌內(nèi)毒素的作用，細菌內(nèi)毒素與大青葉提取物接觸后，注入家兔體內(nèi)未引起發(fā)熱效果。另有爭論[19]報道，大黃能顯著抑制家兔細菌內(nèi)毒素性發(fā)熱故熱原法有可能不能檢出有清熱解毒作用的中藥注射液中所含細菌內(nèi)毒素本爭論中選擇的4種中藥注射液均屬于清熱解毒類故需建立體外的方法檢測這4種中藥注射液是否被細菌內(nèi)毒素污染以及其中的細菌內(nèi)毒素含量。結(jié)果，樣品中添加細菌內(nèi)毒素后回收率均在 50%～200%，說明方法準確。經(jīng)體外檢測各樣品中細菌內(nèi)毒素含量均遠遠低于規(guī)定的限值與前期試驗中4種制劑承受家兔法檢測無熱原反響的結(jié)果相吻合但本試驗未對家兔法進展深入爭論比方樣品受細菌內(nèi)毒素污染后對家兔發(fā)熱的抑制作用有待進一步深入探討。中藥注射液成分簡單，顏色較深，已有文獻報道的體外檢測方法，或不適用于某些中藥注射液品種[20]，或檢測方法較簡單，需多種試劑進展試驗[21]。而本試驗所承受的檢測方法，所用試劑簡潔，大大簡化了試驗操作，且檢測濃度范20～0.01EU/mL濃度的細菌內(nèi)毒素。由本試驗結(jié)果可知，由于檢測手段具有較高的靈敏度，故供試品有更大的MVD，在小于MVD的稀釋倍數(shù)下，供試品不存在干擾作用。且在添加不同濃度的CSE果較為穩(wěn)定。參考文獻1]何義霞.清開靈注射液治療小兒肺炎的臨床分析[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2023，8〔13：155-156.2 吳劍波，何志民.清開靈注射液聯(lián)合糖皮質(zhì)激素對大葉性肺炎患者血清IL-10TNF-α水平的影響[J].中國生化藥物雜志，2023，36〔4〕：152-154.[3]楊聰琴.復(fù)方半邊蓮治療小兒急性支氣管炎療效觀看[J].有用中醫(yī)藥雜2023，21〔3：136-137.4 茵梔黃注射液對黃疸型病毒性肝炎的退黃效果與安全性的系統(tǒng)評價[J].2023，5〔6：461-465.5 雙黃連注射液治療慢性堵塞性肺疾病急性加重期患者的臨床觀看[J].中國藥房，2023，2〔29：4096-4098.6 雙黃連注射劑與抗生素比較治療小兒肺炎[J].2023，22〔7：1790-1793.[7]桂曼青.[J].航空航天醫(yī)學(xué)雜志，2023，25〔5：692-693.[8]張海英，任曉蕾，李玉珍.雙黃連注射液治療小兒肺炎有效性的Meta[J].中國藥房，2023，21〔44：4205-4207.[]23例臨床分析[J].中國社區(qū)20231〔1079-80.[10]陳文貴.[J].1995，6〔5：47-48.24：1919-1920.黨京丹.[J].20234〔7：771-773.[13]孫哲.[J].20231〔9128-130.HIRATAN，YANAQAWAY，SATOHM，etal.Dendriticcell-derivedTNF-alphaisresponsiblefordevelopmentofIL-10-producingCD4+Tcell[J].CellImmunol，2023，261〔1〕：37-41.NEWBYAC.Metalloproteinaseexpressioninmonocytesandmacrophagesanditsrelationshiptoatheroseleroticplaqueinstability[J].ArteriosclerTh