動態(tài)顯色法檢測4種清熱解毒類中藥注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素含量

動態(tài)顯色法檢測4種清熱解毒類中藥注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素含量目的：建立定量檢測4種清熱解毒類中藥注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的試驗(yàn)方法。方法：承受動態(tài)顯色法，測定溫度為〔37±0.5〕405nm，預(yù)設(shè)〔四部〕4〔驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r為0.999；清開靈注射液、復(fù)方半邊蓮注射液、茵梔黃200、125、75、12.5倍及以下稀釋倍數(shù)時對50%～200%1.66、1.04、0.62、0.104EU/mL，均低于各樣品規(guī)定的限值。結(jié)4結(jié)果穩(wěn)定牢靠。OBJECTIVE：Tosetupthemethodforquantitativedeterminationofbacterialendotoxinin4kindsofheat-clearinganddetoxifyingTCMinjections.METHODS：Thekineticchromogenicassay〔KCA〕methodwasused.Thedeterminationconditionsincludeddetectiontemperature〔37±0.5〕℃，detectionwavelength405nm，presetabsorbance〔A〕0.1，andreactiontime3600s.Accordingtophotometrymethodandguidanceprinciplegeneralruleofbacterialendotoxintestin2023editionofChinesePharmacopoeia〔partⅣ，reliabilitytestand interference test of standard curve were conducted. The non-interferenceconcentrationof4type〔Qingkailinginjection，CompoundBanbianlianinjection，Yinzhihuang injection and Shuanghuanglian injection〕was determined andquantitativedeterminationofbacterialendotoxinwasalsoconducted.RESULTS：Thecorrelationcoefficientrofstandardcurvewas0.999.Qingkailinginjection，CompoundBanbianlianinjection，YinzhihuanginjectionandShuanghuanglianinjectiondidn’tinterferewiththedetectionoftachypleusamebocytelysatein200，125，75and12.5timesandbelowdilutiontimesrespectively.Therecoverieswereandthecontentsofbacterialendotoxininsampleswere1.66，1.04，0.62，0.104 EU/mL，which were all lower than the limits of samples.suitableforthedetectionofbacterialendotoxinin4kindsofTCMinjections.Themethodissimple，convenient，stableandreliable.KEYWORDSKineticchromogenicassay；Heat-clearinganddetoxifying；TCMinjection；Bacterialendotoxin；Interferencetest4[1-8][9-11]2023年3種分別收載在《國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編：中成〔復(fù)方半邊蓮注射雙黃連注射液〕和WS3-B-2736-97〔茵梔黃注射液〕中。這4種中藥注射液的熱原檢查方法4種均〔1～5ng/kg〕的內(nèi)毒素進(jìn)入人體即可引起發(fā)熱反響[12]；大劑量的細(xì)菌內(nèi)毒素可引起機(jī)體發(fā)生內(nèi)毒素休克、彌散性血管內(nèi)凝血、多器官衰竭等反響甚至死亡[13-15]。長、儲存、運(yùn)輸、生產(chǎn)過程的特別性，易受到微生物污染，加之細(xì)菌內(nèi)毒素本身具有水溶性、耐熱性、吸附性及不揮發(fā)性等性質(zhì)[16]，使中藥注射液中的細(xì)菌內(nèi)assay，KCA〕是光度測定法中顯色基質(zhì)法靈敏度高、適用性強(qiáng)、操作簡便，可批量檢測故能節(jié)約時間和本錢。本爭論承受KCA對上述4種清熱解毒類中藥注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素含量進(jìn)展檢測，以建立4種中藥注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的定量檢測方法。材料儀器MultiskanFC型內(nèi)毒素儀〔賽默飛世爾科技公司；BioProde5.2〔湛江安度斯生物2H-2BLENDER渦旋振蕩混合器〔儀器廠。藥品與試劑清開靈注射液〔河南省神農(nóng)藥業(yè)，批號：1608041、16071102、1604040，規(guī)格：10mL支；復(fù)方半邊蓮注射液〔河南同源制藥，批1612011704011707012mL支；茵梔黃注射液〔神威藥業(yè)集團(tuán)170611D170612D170613D10mL支；雙黃連注射液〔河南福森藥業(yè)集團(tuán)，批號：1602023、1604363、1604413，規(guī)20mL支；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品〔CS150601-20238，規(guī)格：支〕均來源于中國食品藥品檢定爭論院；KCA鱟試劑〔批號：1604220，規(guī)格：0.35mL/20～0.01EU/mL、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查反響板〔1510080〕均來源于湛江安度斯生物。方法供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值確實(shí)定K=5EU〔kg·h。首先去除稀釋液的最大允許細(xì)菌內(nèi)毒素KKs=K-KM為人每千克體質(zhì)量每小時可承受的最大供試品劑量，以mL/〔kg·h〕表示。按供試品說明書規(guī)定，取每日人用最大體積V進(jìn)展60kg250mL葡萄糖注射液或氯化1h計(jì)算，M=V/6012023年版《中國〔四部〕規(guī)定[17]，由于藥物使用途徑不同，為保證安全用藥，藥品的L1/2～1/31/3L。通過L2.0、5.0、3.0、1.0EU/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線牢靠性試驗(yàn)〔四部〕方法操作[17]。1BET800μL15minBET水稀釋成1.0、0.1、0.01EU/mL3個濃度，同時設(shè)陰性比照管。另取KCA鱟試劑，加0.35mLBET水，充分溶解。取上述CSE25μL，加至32KCA，吸〔A〕測定條件：溫度〔37±0.5〕405nmA0.1，反響時間〔T〕3600s，儀器自動以T的對數(shù)值〔lgT〕為橫坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度〔c〕的對數(shù)值lg〕為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)〔。供試品干擾試驗(yàn)細(xì)菌內(nèi)毒素系列溶液〔C溶液〕1.0、0.1、EU/mL3CSEE1.0、E0.1、E0.01。供試品溶液〔A溶液〕的稀釋在不超過最大稀釋倍數(shù)〔MVD〕下用BET24S1S2S3、S4?！睟溶液0.1EU/mL濃度的細(xì)菌內(nèi)毒λmS10.2EU/mLCSE溶液混合，即得到0.1EU/mLS2T0.1。同樣S1T0.1、S3T0.1、S4T0.1一系列的供試品陽性溶液。KCA鱟試劑反響取A、B、CKCA25μL，加至2BET水作為陰性比照〔即D溶液2孔。依照“2.2”項(xiàng)下條件測定。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得回歸方程計(jì)算各供試品ctcS，按下式計(jì)算該試驗(yàn)條RR〔cS-c50～200%之間。供試品細(xì)菌內(nèi)毒素含量測定EU/mL表示，并進(jìn)展樣品細(xì)菌內(nèi)毒素回收率測定。3結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線的牢靠性〔四部〕[17]及鱟試劑使用說明書對光度測定法r確實(shí)定值T〔CV〕≤10%。將標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)展線性回歸，得到回T>3600s〔標(biāo)準(zhǔn)曲線最T3397.5sCV均%?？梢?，標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)成立，說明試驗(yàn)有效。KCA1。供試品干擾試驗(yàn)結(jié)果清開靈注射液、復(fù)方半邊蓮注射液、茵梔黃注射液、雙黃連注射液分別在50%～200%，說明在該稀釋倍數(shù)4種注射液的最大無干擾濃度200、125、75、12.5倍。122。供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的測定〔lgT=2.8429分別計(jì)算4個品種A溶液最大無干擾濃度下的細(xì)菌內(nèi)毒素含量。結(jié)果，各組平CV3600s量實(shí)測值均<0.0083EU/mL，說明清開靈注射液、復(fù)方半邊蓮注射液、茵梔黃注均不超過各品種規(guī)定的細(xì)菌內(nèi)毒素限值。4爭論[1]、肺炎、高燒，具有解熱作用[2]，能有效抑制細(xì)菌內(nèi)毒素等致熱原引起的家兔發(fā)熱反響。復(fù)方半邊蓮[3]。茵梔黃藥注射劑，具有清熱、解毒、利濕、退黃的成效[4]悉黃、胸脅脹痛、惡心嘔吐、小便黃赤，急性、遷延性、慢性肝炎等屬上述證性腭扁桃體炎等[5-6]疾病的首選藥物之一[7-8]。自二十世紀(jì)八九十年月起中藥抗細(xì)菌內(nèi)毒素的作用開頭引起寬闊學(xué)者的重視。有爭論[18]報(bào)道，大青葉提取物具有體外破壞細(xì)菌內(nèi)毒素的作用，細(xì)菌內(nèi)毒素與大青葉提取物接觸后，注入家兔體內(nèi)未引起發(fā)熱效果。另有爭論[19]報(bào)道，大黃能顯著抑制家兔細(xì)菌內(nèi)毒素性發(fā)熱故熱原法有可能不能檢出有清熱解毒作用的中藥注射液中所含細(xì)菌內(nèi)毒素本爭論中選擇的4種中藥注射液均屬于清熱解毒類故需建立體外的方法檢測這4種中藥注射液是否被細(xì)菌內(nèi)毒素污染以及其中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量。結(jié)果，樣品中添加細(xì)菌內(nèi)毒素后回收率均在 50%～200%，說明方法準(zhǔn)確。經(jīng)體外檢測各樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于規(guī)定的限值與前期試驗(yàn)中4種制劑承受家兔法檢測無熱原反響的結(jié)果相吻合但本試驗(yàn)未對家兔法進(jìn)展深入爭論比方樣品受細(xì)菌內(nèi)毒素污染后對家兔發(fā)熱的抑制作用有待進(jìn)一步深入探討。中藥注射液成分簡單，顏色較深，已有文獻(xiàn)報(bào)道的體外檢測方法，或不適用于某些中藥注射液品種[20]，或檢測方法較簡單，需多種試劑進(jìn)展試驗(yàn)[21]。而本試驗(yàn)所承受的檢測方法，所用試劑簡潔，大大簡化了試驗(yàn)操作，且檢測濃度范20～0.01EU/mL濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，由于檢測手段具有較高的靈敏度，故供試品有更大的MVD，在小于MVD的稀釋倍數(shù)下，供試品不存在干擾作用。且在添加不同濃度的CSE果較為穩(wěn)定。參考文獻(xiàn)1]何義霞.清開靈注射液治療小兒肺炎的臨床分析[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2023，8〔13：155-156.2 吳劍波，何志民.清開靈注射液聯(lián)合糖皮質(zhì)激素對大葉性肺炎患者血清IL-10TNF-α水平的影響[J].中國生化藥物雜志，2023，36〔4〕：152-154.[3]楊聰琴.復(fù)方半邊蓮治療小兒急性支氣管炎療效觀看[J].有用中醫(yī)藥雜2023，21〔3：136-137.4 茵梔黃注射液對黃疸型病毒性肝炎的退黃效果與安全性的系統(tǒng)評價(jià)[J].2023，5〔6：461-465.5 雙黃連注射液治療慢性堵塞性肺疾病急性加重期患者的臨床觀看[J].中國藥房，2023，2〔29：4096-4098.6 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