高效液相色譜法培訓(xùn)課件

高效液相色譜法培訓(xùn)課件高效液相色譜法（HPLC）是60年代末以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入了氣相色譜的理論與實(shí)驗(yàn)方法，流動(dòng)相用高壓泵輸送，采用高效固定相和在線檢測(cè)等手段發(fā)展而成的分離分析方法。與氣相色譜法相比具有：適用范圍廣，樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，分離效率高，流動(dòng)相選擇范圍廣，檢測(cè)方法多為非破壞性的，流出組分可回收等優(yōu)點(diǎn)。第一節(jié)概述第2頁,共99頁，2024年2月25日，星期天HPLC液-固吸附液-液分配正相色譜反相色譜一般反相色譜離子對(duì)色譜離子抑制色譜離子交換色譜一般離子交換色譜離子色譜氨基酸分析空間排斥色譜凝膠滲透色譜凝膠過濾色譜假相色譜膠束色譜環(huán)糊精色譜親合色譜，手性色譜，毛細(xì)管電泳鍵合相色譜第3頁,共99頁，2024年2月25日，星期天正相色譜（normalphase）流動(dòng)相極性小于固定相極性的分配色譜法稱為正相分配色譜。常用的分析柱有:氨基柱、氰基柱、硅膠柱。常用流動(dòng)相為極性小的有機(jī)溶劑。反相色譜（reversedphase）流動(dòng)相極性大于固定相極性的分配色譜法稱為反相分配色譜法。常用的分析柱有：ODS(C18)，C8，C2。常用流動(dòng)相為甲醇-水，乙腈-水。第4頁,共99頁，2024年2月25日，星期天離子抑制色譜（ionsuppressionchromatography）——調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，抑制組分的解離，增加組分在固定相中的溶解度，改善峰形，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸和弱堿的目的。離子對(duì)色譜（ionpairchromatography）——將反離子加入流動(dòng)相中，與呈解離狀態(tài)的被測(cè)物作用，生成脂溶性的中性離子對(duì)絡(luò)合物，從而增加了被測(cè)物在非極性固定相中的溶解度，改善分離效果，達(dá)到分離目的。常用反離子有：季銨鹽——用于酸類

烷基磺酸鹽——用于堿類第5頁,共99頁，2024年2月25日，星期天離子色譜法（ionchromatography）離子色譜是由經(jīng)典的離子交換色譜發(fā)展起來的一種液相色譜技術(shù)，利用物質(zhì)在離子交換柱上遷移的差異而達(dá)到分離，用于親水性陰陽離子的測(cè)定。根據(jù)是否采用抑制柱，可分為抑制型離子色譜和非抑制型離子色譜。第6頁,共99頁，2024年2月25日，星期天空間排斥色譜（stericexclusion

）也稱凝膠色譜，依據(jù)被分離組分分子尺寸與凝膠空徑大小之間的相對(duì)關(guān)系而分離，類似于分子篩作用。在一定分子線團(tuán)尺寸內(nèi)，分子越大，保留時(shí)間越短。凝膠滲透——以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相凝膠過濾——以水溶液為流動(dòng)相對(duì)于相同化學(xué)組成的高分子化合物，其分子尺寸大小與分子量成正比，因此凝膠色譜可以研究高分子化合物的分子量分布。第7頁,共99頁，2024年2月25日，星期天膠束色譜(micellarchromatography)表面活性劑在水中超過某一濃度（臨界濃度）時(shí)，多余的表面活性劑不再溶解，聚集而成膠束（膠粒）。以膠束分散體系為流動(dòng)相的色譜法稱為膠束色譜法。它的流動(dòng)相為膠束多相分散體系，不是真溶液；流動(dòng)相中不含有機(jī)溶劑。因膠束色譜法的流動(dòng)相是多相分散體系，在整個(gè)色譜體系中又增加了一相，故也被稱為假相色譜（pseudophasechromatography）。第8頁,共99頁，2024年2月25日，星期天手性色譜(chiralchromatography)用于分離手性藥物對(duì)映體的一種有效技術(shù)，可分為直接法和間接法兩類：直接法手性固定相法（chiralstationaryphase;CSP)手性流動(dòng)相法(chiralmobilephaseadditive;CMPA)間接法—手性試劑衍生化法

chiralderivatizationreagent,CDR)第9頁,共99頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)高效液相色譜儀色譜柱進(jìn)樣閥流動(dòng)相檢測(cè)器高壓泵脫氣裝置第10頁,共99頁，2024年2月25日，星期天高效液相色譜儀組成輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)第11頁,共99頁，2024年2月25日，星期天溶劑

色譜泵自動(dòng)進(jìn)樣器

HPLC色譜柱檢測(cè)器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)液相色譜流程圖第12頁,共99頁，2024年2月25日，星期天第13頁,共99頁，2024年2月25日，星期天啟動(dòng)液相色譜儀器的流程開啟HPLC系統(tǒng)各個(gè)設(shè)備的電源打開泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、檢測(cè)器電源，待設(shè)備通過自檢后，打開計(jì)算機(jī)啟動(dòng)色譜管理軟件準(zhǔn)備流動(dòng)相過濾，脫氣色譜泵排氣用新配制的流動(dòng)相灌注泵第14頁,共99頁，2024年2月25日，星期天液相柱---保留值與pH的關(guān)系pH變化值0.1RS變化值1.6色譜柱：ZorbaxStableBondC184.6*250mm,5um流動(dòng)相：27%甲醇：73%磷酸pH：2.5&2.6溫度：50℃流速：1.0mL/min.第15頁,共99頁，2024年2月25日，星期天2.流動(dòng)相類別

按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分按極性分：極性、弱極性、非極性按使用方式分：等度洗脫和梯度洗脫

第16頁,共99頁，2024年2月25日，星期天對(duì)溶劑的要求水：去離子水自動(dòng)純水儀純凈水商品瓶裝水溶劑:

色譜純（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，異丙醇）試劑:分析純第17頁,共99頁，2024年2月25日，星期天不管采用何種途徑，配制流動(dòng)相應(yīng)用新鮮水，水質(zhì)要求越高放置時(shí)間越短。理想的HPLC用水應(yīng)為18.2Ω的超純水，并通過0.22um的濾膜，除去熱源、有機(jī)物、無機(jī)離子及空氣等。

第18頁,共99頁，2024年2月25日，星期天過濾：0.45um或更小孔徑濾膜

目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液。脫氣：除去流動(dòng)相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡氣泡對(duì)測(cè)定的影響：

1）泵中氣泡使液流波動(dòng)，改變保留時(shí)間和峰面積

2）柱中氣泡使流動(dòng)相繞流，峰變形

3）檢測(cè)器中的氣泡產(chǎn)生基線波動(dòng)

過濾與脫氣第19頁,共99頁，2024年2月25日，星期天第20頁,共99頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共99頁，2024年2月25日，星期天流動(dòng)相的保存有機(jī)溶劑流動(dòng)相：

室溫下密封，避光保存緩沖鹽流動(dòng)相：

當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用：低溫下密封保存，一般不超過3天防止微生物生長有機(jī)溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動(dòng)相：低溫密封保存防止有機(jī)相的揮發(fā)選用適宜的容器第22頁,共99頁，2024年2月25日，星期天流動(dòng)相的保存有機(jī)溶劑流動(dòng)相：

室溫下密封，避光保存緩沖鹽流動(dòng)相：

當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用：低溫下密封保存，一般不超過3天防止微生物生長有機(jī)溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動(dòng)相：低溫密封保存防止有機(jī)相的揮發(fā)選用適宜的容器第23頁,共99頁，2024年2月25日，星期天1．梯度洗脫的特點(diǎn)（1）改善分離,加快分析速度；（2）改善峰形,減少拖尾,有利于痕量組分的檢測(cè)；（3）增加峰容量；（4）強(qiáng)烈滯留的組分不容易殘留在柱上,保持柱性能長期良好；（5）下次分析時(shí),流動(dòng)相需要一段平衡時(shí)間；不同溶劑的UV吸收程度稍有差異,可能會(huì)引起基線漂移第24頁,共99頁，2024年2月25日，星期天2．梯度洗脫的主要條件①A流動(dòng)相/弱溶劑組成；②B流動(dòng)相/強(qiáng)溶劑組成；③梯度時(shí)間；④梯度曲線：線性、凸型或凹型等。強(qiáng)溶劑

A%time125第25頁,共99頁，2024年2月25日，星期天第26頁,共99頁，2024年2月25日，星期天梯度：低壓混合低壓梯度用單泵產(chǎn)生梯度，泵前（低壓端）混合對(duì)脫氣要求高不易調(diào)節(jié)梯度的滯后體積如設(shè)計(jì)不當(dāng)，梯度的

準(zhǔn)確性受影響滯后體積（系統(tǒng)

體積）設(shè)計(jì)合理第27頁,共99頁，2024年2月25日，星期天梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響死體積/譜帶展寬體積(無色譜柱時(shí))滯后(系統(tǒng))體積滯后(系統(tǒng))體積溶劑輸送系統(tǒng)(泵)檢測(cè)器進(jìn)樣器色譜柱梯度混合器溶劑輸送系統(tǒng)(泵)高壓梯度注意∶滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼器、混合器及其管路比例閥檢測(cè)器進(jìn)樣器ABCD色譜柱溶劑輸送系統(tǒng)(泵)低壓梯度阻尼器混合器第28頁,共99頁，2024年2月25日，星期天梯度滯后大小的影響滯后體積太大會(huì)引起梯度變化的延遲例如：滯后體積為2.0ml，流速1.0ml/min實(shí)際梯度會(huì)比設(shè)置值晚2分鐘響應(yīng)，沒有問題對(duì)微柱色譜影響更大，同上例但流速0.1ml/min實(shí)際梯度會(huì)比設(shè)置值晚20分鐘響應(yīng)，不能接受滯后體積的不同會(huì)使方法轉(zhuǎn)換麻煩滯后體積比文獻(xiàn)大或小都會(huì)使方法不能重現(xiàn)滯后體積的變化會(huì)導(dǎo)致梯度重現(xiàn)性不好普通分析型液相色譜的滯后體積為2~4ml第29頁,共99頁，2024年2月25日，星期天滯后體積變化的影響設(shè)計(jì)不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化滯后體積隨反壓變化的后果：梯度的準(zhǔn)確性不好，造成：方法的適應(yīng)性不好用靜態(tài)梯度混合器；固定滯后體積可明顯改善梯度特性梯度百分比保留時(shí)間梯度曲線好的梯度滯后曲線保留時(shí)間梯度百分比不好的梯度滯后曲線固定滯后體積，改善了梯度性能普通的低壓梯度系統(tǒng)第30頁,共99頁，2024年2月25日，星期天輸液泵多用柱塞往復(fù)泵，柱塞向前運(yùn)動(dòng)，液體輸出，流向色譜柱；向后運(yùn)動(dòng)，將貯液瓶中液體吸入缸體。如此往復(fù)運(yùn)動(dòng)，將流動(dòng)相源源不斷地輸送到色譜柱中。柱塞往復(fù)泵屬于恒流泵，流量不受柱阻影響，泵壓最高為400kg/cm2。這種泵具有清洗容易，更換流動(dòng)相方便等優(yōu)點(diǎn)，但脈動(dòng)性較大是其缺點(diǎn)。目前多采用雙泵補(bǔ)償法來克服這一問題。第31頁,共99頁，2024年2月25日，星期天第32頁,共99頁，2024年2月25日，星期天避免使用對(duì)不銹鋼有腐蝕性的溶劑。例：硝酸、硫酸、鹽酸、鹵化物，四氯化碳與異丙醇或四氫呋喃的混合物，含強(qiáng)絡(luò)合劑的溶液等。過濾——用濾膜過濾或垂熔漏斗過濾脫氣——采用超聲或過濾的方法注意流動(dòng)相使用前沖洗使用含酸、堿、緩沖液的流動(dòng)相后，必須用不含鹽的有機(jī)溶劑-水沖洗！第33頁,共99頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共99頁，2024年2月25日，星期天第35頁,共99頁，2024年2月25日，星期天第36頁,共99頁，2024年2月25日，星期天進(jìn)樣閥第37頁,共99頁，2024年2月25日，星期天1柱泵324定量圈進(jìn)樣孔6廢液5廢液Inject6柱泵3214定量圈進(jìn)樣孔廢液5廢液Load第38頁,共99頁，2024年2月25日，星期天注意：使用后應(yīng)清洗！第39頁,共99頁，2024年2月25日，星期天進(jìn)樣注意點(diǎn)進(jìn)樣閥的廢液出口端高度必須與進(jìn)樣針在同一水平位置，以免虹吸作用，使樣品向針筒方向回流，或從廢液口流出。使用前后，要用流動(dòng)相（不含酸堿等緩沖液）或甲醇或水沖洗針孔，用針孔清洗器）。第40頁,共99頁，2024年2月25日，星期天進(jìn)樣方法整個(gè)定量圈體積進(jìn)樣——為獲得好的精密度，進(jìn)樣量應(yīng)大于定量圈量的2-5倍以上。由于層流影響，需要有過量的樣品液來取代管壁上的流動(dòng)相（見下圖）。SampleMobilephase第41頁,共99頁，2024年2月25日，星期天例20l定量圈，進(jìn)樣體積不能超過10l。否則，部分樣品將會(huì)從出口流失。這是因?yàn)橛捎趯恿鞯年P(guān)系，樣品流經(jīng)管中心的速度是平均速度的兩倍。進(jìn)樣前應(yīng)用流動(dòng)相沖洗進(jìn)樣孔，以除去前一針留下的樣品。注射針必須清洗干凈。部分定量圈體積進(jìn)樣——當(dāng)樣品量少時(shí)，采用部分體積進(jìn)樣，進(jìn)樣量由微量注射器手動(dòng)控制，要求：不得超過定量圈體積的1/2量第42頁,共99頁，2024年2月25日，星期天檢測(cè)器紫外檢測(cè)器可變波長檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器熒光檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器蒸發(fā)光散射示差檢測(cè)器質(zhì)譜第43頁,共99頁，2024年2月25日，星期天色譜圖minH光譜圖nmAA-λ曲線(定性)A-t曲線(定量)第44頁,共99頁，2024年2月25日，星期天蒸發(fā)光散射檢測(cè)器是通用檢測(cè)器，適用于無紫外吸收的化合物。原理：組分先引入已通氣體（N2,空氣）的蒸發(fā)室，加熱，使流動(dòng)相蒸發(fā)而被除去，樣品組分形成氣溶膠而產(chǎn)生光散射，測(cè)定散射光強(qiáng)度而獲得組分的濃度信號(hào)。本法中流動(dòng)相在檢測(cè)前已蒸發(fā)，故梯度洗脫基線穩(wěn)定。第45頁,共99頁，2024年2月25日，星期天組分的氣溶膠噴霧蒸發(fā)檢測(cè)N2光源溶劑泵色譜柱流出物注意：流動(dòng)相必須是揮發(fā)性的，不能含緩沖鹽，若調(diào)節(jié)pH可用氨水、醋酸。第46頁,共99頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)譜檢測(cè)器第47頁,共99頁，2024年2月25日，星期天UV-VISDADFluRefraElecConducotherMs

檢測(cè)器使用統(tǒng)計(jì)第48頁,共99頁，2024年2月25日，星期天HPLC檢測(cè)器應(yīng)提供的功能對(duì)樣品有響應(yīng)并有一個(gè)輸出信號(hào)應(yīng)該提供在檢測(cè)器響應(yīng)值與樣品濃度之間的線性關(guān)系；并且所設(shè)計(jì)的校正技術(shù)應(yīng)該促進(jìn)這種關(guān)系第49頁,共99頁，2024年2月25日，星期天理想的HPLC檢測(cè)器高靈敏度；可忽略的基線噪音寬的線性范圍獨(dú)立于流動(dòng)相及操作參數(shù)的響應(yīng)對(duì)壓力、溫度及流速等變化不敏感長時(shí)間操作的穩(wěn)定性低死體積非破壞性選擇性第50頁,共99頁，2024年2月25日，星期天靈敏度：信噪比靈敏度是信號(hào)與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N）檢測(cè)限（LOD）：S/N=2~4定量限（LOQ）：S/N=8~10好的信噪比有利于：更好的色譜峰確認(rèn)更好的定量更好地完成色譜峰純度/均一性 6:1NS第51頁,共99頁，2024年2月25日，星期天吸光度（AbsorbanceUV/Vis）檢測(cè)目前實(shí)驗(yàn)室中最流行的選擇多數(shù)公司約75%的檢測(cè)器是吸光度檢測(cè)器（其中50%是多波長，25%是PDA）測(cè)量通過溶液后的紫外或可見光光強(qiáng)度的損失吸光度與樣品濃度呈線性關(guān)系在被測(cè)物的最大吸收波長處檢測(cè)時(shí)靈敏度最大第52頁,共99頁，2024年2月25日，星期天吸光度檢測(cè)器（UV/Vis）－優(yōu)點(diǎn)這種檢測(cè)器簡(jiǎn)單、可靠多數(shù)人熟悉并喜歡這種技術(shù)可以作梯度實(shí)驗(yàn)并且是非破壞性的大多數(shù)有機(jī)化合物有一定程度的吸光度一般來說靈敏度還可以AU0.000.050.100.15Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Parabensat254nm第53頁,共99頁，2024年2月25日，星期天吸光度檢測(cè)器（UV/Vis）－缺點(diǎn)由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用檢測(cè)器對(duì)某些化合物的檢測(cè)靈敏度不及其他檢測(cè)器樣品中不同化合物的最大吸收波長不同時(shí)，需要使用多波長檢測(cè)，或使用折衷的波長受流動(dòng)相組成的影響：用截止波長以上至少5～10nm作為工作波長緩沖鹽、離子對(duì)試劑、胺改性劑也會(huì)有影響第54頁,共99頁，2024年2月25日，星期天背景吸收對(duì)紫外檢測(cè)器噪音的影響UVSpectrumofEluentswith0.1%TFAAgainstHPLCGradeH2OBlankAU0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.901.001.101.201.301.401.50nm200.00210.00220.00230.00240.00250.00260.00270.00280.00290.00H20with0.1%TFA50%ACNwith0.1%TFA第55頁,共99頁，2024年2月25日，星期天溶劑混合的基線噪音色譜條件色譜柱：

C18,

5μm,3.9x150mmat35oC.流動(dòng)相：

A:0.1%TFAinWater. B:0.1%TFAinAcetonitrile.梯度：5-40%Bin35min.流速：1.0mL/min.樣品：水（10μLinj.vol.）檢測(cè)：214nm

圖1；好的梯度系統(tǒng)

圖2；一般的二元梯度系統(tǒng)

圖3；一般的四元梯度系統(tǒng)第56頁,共99頁，2024年2月25日，星期天為何如此重要？五個(gè)小肽的5ng進(jìn)樣，好的色譜系統(tǒng)非常容易鑒別出所有峰。在不好的色譜系統(tǒng)中，第一個(gè)峰則消失在基線噪音中。第57頁,共99頁，2024年2月25日，星期天基線噪音對(duì)積分的影響1.2241.1831.183Caffeine@271nm第58頁,共99頁，2024年2月25日，星期天色譜柱色譜柱有柱管和固定相組成，柱管用不銹鋼制成，柱長10～30cm，內(nèi)徑2～6mm，以4.6mm的內(nèi)徑最常用。根據(jù)鍵合基團(tuán)極性不同，化學(xué)鍵合相可分為非極性、中等極性和極性三類。常用色譜柱有：ODS柱、氰基柱、氨基柱等第59頁,共99頁，2024年2月25日，星期天非極性鍵合相表面基團(tuán)為非極性烴基，如C18

、C8等，主要用于RP色譜。C18是最常用的非極性鍵合相，將十八烷基氯硅烷與硅膠表面的硅醇基經(jīng)多步反應(yīng)而成。R1，R2=H，Cl，CH31（2，3）：1第60頁,共99頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)R1、R2基團(tuán)，含碳量可分為高碳、中碳、低碳型鍵合相：高碳R1=R2=CH3

載樣量大，吸附性能大；中碳R1=H,≡Si－O－Si(H)－C18H37

R2=Cl≡Si－O低碳R1=R2=Cl∣≡Si－O≡Si－O－≡Si－OSi－C18H37第61頁,共99頁，2024年2月25日，星期天中等極性鍵合相——常見的有醚基鍵合相，這類鍵合相根據(jù)流動(dòng)相的極性，可作為正相或反相色譜的固定相，應(yīng)用較少。極性鍵合相——可作正相或反相色譜使用氨基鍵合相：硅膠-氨丙硅烷基[－Si－(CH2)3NH2]氰基鍵合相：硅膠-氰乙硅烷基[－Si－(CH2)2CN]

鍵合相色譜pH控制在2-8第62頁,共99頁，2024年2月25日，星期天液相色譜的色譜柱第63頁,共99頁，2024年2月25日，星期天第64頁,共99頁，2024年2月25日，星期天色譜柱的連接Stop_depth長度不合適造成柱前死體積第65頁,共99頁，2024年2月25日，星期天錐箍錐度不合適造成滲漏色譜柱的連接第66頁,共99頁，2024年2月25日，星期天色譜柱使用與保存所有色譜柱使用緩沖液后必須用柱體積20-30倍的水沖洗色譜柱色譜柱柱體積沖洗體積150×4.6mm2.5ml50ml200×4.6mm3.3ml65ml250×4.6mm4.2ml80ml第67頁,共99頁，2024年2月25日，星期天保存色譜柱時(shí)用100%甲醇或乙腈，柱兩端必須用接頭密封。停用數(shù)天后最使用時(shí)，應(yīng)先用低流速甲醇沖洗1h左右，然后再換上流動(dòng)相，否則直接用流動(dòng)相，柱效會(huì)下降，峰形不好。新柱使用前應(yīng)用甲醇或乙腈沖洗（0.5ml/min）。第68頁,共99頁，2024年2月25日，星期天色譜柱失效癥狀色譜柱壓增高峰變寬，拖尾，裂峰塔板數(shù)下降，選擇性下降，分離度降低保留值減小或增大色譜柱失效的原因進(jìn)口濾片堵塞吸附了樣品雜質(zhì)柱填充不良，使用久，機(jī)械及熱沖擊造成空洞固定相遭化學(xué)侵蝕第69頁,共99頁，2024年2月25日，星期天原因壓力拖尾塔板數(shù)選擇性保留值堵塞#####空洞####吸附樣品#化學(xué)沖擊######柱凹陷——出現(xiàn)裂峰現(xiàn)象，填料與色譜柱頂端不齊平，可用相同填料填平凹陷處。壓力影響——應(yīng)避免突然的壓力波動(dòng)與任何的機(jī)械與熱力沖擊，如色譜柱掉在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上或驟然改變柱溫等。進(jìn)樣過程中轉(zhuǎn)動(dòng)進(jìn)樣閥太慢引起壓力波動(dòng)，會(huì)使色譜峰產(chǎn)生裂隙。第70頁,共99頁，2024年2月25日，星期天柱壓升高原因強(qiáng)保留樣品組分——強(qiáng)吸附組分易聚集在柱進(jìn)口填料上，嚴(yán)重縮短色譜柱壽命。尤其是生物樣品提取物、含油成分等。當(dāng)嚴(yán)重拖尾峰出現(xiàn)時(shí)往往是強(qiáng)保留污染物在柱口處聚集的信號(hào)。解決辦法使用保護(hù)柱可延長分析柱壽命。每天實(shí)驗(yàn)后應(yīng)用強(qiáng)溶劑（例甲醇-水等，至少20-30倍柱體積的量）沖洗色譜柱。并定期進(jìn)行保養(yǎng)，以低流速的強(qiáng)溶劑較長時(shí)間沖洗色譜柱。第71頁,共99頁，2024年2月25日，星期天樣品純度差——有微小的顆粒堵塞管路?？捎脼V膜過濾樣品后再進(jìn)樣。樣品濃度高——連續(xù)進(jìn)樣，造成過載。如果樣品吸收度不是太低，使樣品濃度在1mg/ml以下較適宜。

流動(dòng)相中緩沖液濃度過高，有機(jī)相比例大——在色譜過程中堵塞管路，析出的鹽結(jié)晶還磨損泵、進(jìn)樣閥密封圈造成漏液。緩沖液濃度一般控制在20mmol以下較適宜，測(cè)定完畢后必須及時(shí)用水充分沖洗。第72頁,共99頁，2024年2月25日，星期天注意！

一旦柱壓升高，應(yīng)停止測(cè)定，用水沖洗數(shù)小時(shí)或更長時(shí)間，待壓力下降后再測(cè)定，如果不清楚堵在哪一段，則應(yīng)逐級(jí)檢查，換泵頭上濾芯，保護(hù)柱等。第73頁,共99頁，2024年2月25日，星期天柱效低的原因頻繁更換流動(dòng)相組成——加速柱效降低。最好一根色譜柱使用的流動(dòng)相成分和pH值相近，如始終在酸性條件下或堿性條件下工作。色譜柱的選擇不合適或使用時(shí)間久更換色譜柱（廠家，型號(hào)）進(jìn)樣操作不當(dāng)轉(zhuǎn)動(dòng)進(jìn)樣閥時(shí)應(yīng)一次轉(zhuǎn)到位，不能過慢或停頓，否則易造成裂峰。第74頁,共99頁，2024年2月25日，星期天樣品溶劑與流動(dòng)相成分不匹配樣品溶劑與流動(dòng)相成分不匹配，造成前沿峰或倒峰。如樣品用純甲醇作溶劑，而流動(dòng)相中甲醇比例很低，這樣易出現(xiàn)前沿峰，改變樣品溶劑成分或比例，使醇-水比例接近于流動(dòng)相。前沿峰倒峰第75頁,共99頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果不能重現(xiàn)表現(xiàn)為同一樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣所得峰面積相差大，引起這種情況時(shí)，可從以下幾方面來查找原因：泵、進(jìn)樣閥、管路漏液——造成峰面積變化。檢測(cè)器靈敏度改變——如果同一樣品兩次進(jìn)樣峰面積相差10倍或更大倍數(shù)，則最可能的原因是檢測(cè)器的靈敏度被無意中改變，軟件的靈敏度改變不會(huì)影響峰面積的積分?jǐn)?shù)值。第76頁,共99頁，2024年2月25日，星期天色譜軟件積分方式是否一致——尤其是對(duì)于色譜峰較復(fù)雜的，積分時(shí)基線稍有變化將造成峰面積大的變化，如果兩峰不是基線分離，則峰切割方式對(duì)峰面積有很大影響，有時(shí)候采用峰高較峰面積誤差小。垂直切割基線切割第77頁,共99頁，2024年2月25日，星期天樣品溶液的穩(wěn)定性有些樣品在流動(dòng)相條件下不穩(wěn)定，放置后會(huì)產(chǎn)生雜質(zhì)峰，應(yīng)注意。例如有一樣品在流動(dòng)相溶液中不穩(wěn)定，配制后于不同時(shí)間進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)在主峰后會(huì)產(chǎn)生一雜質(zhì)峰，該雜峰隨時(shí)間而迅速增大。將流動(dòng)相中緩沖液換成水后，樣品測(cè)定液放置15h后仍穩(wěn)定。第78頁,共99頁，2024年2月25日，星期天HPLC法在藥物分析中的應(yīng)用鑒別采用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照法檢查中國藥典規(guī)定了5種測(cè)定方法含量測(cè)定中國藥典規(guī)定了2種定量方法在進(jìn)行HPLC測(cè)定時(shí)，中國藥典規(guī)定要進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)第79頁,共99頁，2024年2月25日，星期天系統(tǒng)適用性試驗(yàn)柱效

n=5.54(tR/Wh/2)2分離度

R=拖尾因子

T=重復(fù)性取對(duì)照品或樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD應(yīng)小于2.0%2(tR2-tR1)W1+W2W0.05h2d1(R≥1.5)(T=0.95～1.05)其中分離度和重復(fù)性是更具實(shí)際意義的參數(shù)(ChP.2005)第80頁,共99頁，2024年2月25日，星期天定量分析方法內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)物要求：樣品中不含有的組分。保留時(shí)間與待測(cè)物相近，但分離度R≥1.5。（理化性質(zhì)相近）有足夠的純度。

第81頁,共99頁，2024年2月25日，星期天外標(biāo)法---標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法

C樣=A樣/A標(biāo)×C標(biāo)第82頁,共99頁，2024年2月25日，星期天日常維護(hù)和常見色譜故障溶劑及樣品的準(zhǔn)備－－過濾溶劑的目的濕防止固體顆粒損傷儀器或柱頭；未經(jīng)過濾的溶劑或者溶劑瓶中生長微生物，，都會(huì)降低溶劑入口過濾頭的壽命，并影響泵的性能，一般要求兩天過濾一次。注意：過濾水相或有機(jī)相應(yīng)該選用不同的濾膜－－聚四氟乙烯幾乎可以過濾所有的溶劑、酸和堿－－尼龍66可以和大多數(shù)的有機(jī)物、水相容，但是建議不要用于強(qiáng)酸、二氯甲烷和DMF－－纖維素濾膜用于水相第83頁,共99頁，2024年2月25日，星期天溶劑脫氣的方法－－氦氣脫氣－－真空脫氣－－回流加熱脫氣－－超身脫氣（最為常用）避免使用的溶劑－－鹵化物堿金屬溶液及相應(yīng)的酸溶液－－高濃度的無機(jī)酸如硝酸、硫酸－－能形成自由基的試劑及其混合物－－四氯化碳和異丙醇或THF混合液－－含強(qiáng)絡(luò)合劑的溶液第84頁,共99頁，2024年2月25日，星期天色譜柱的平衡為了確保分析結(jié)果的再現(xiàn)性，對(duì)于反相柱應(yīng)使用5～10倍柱體積的流動(dòng)相平衡色譜柱。注意：新裝到系統(tǒng)的色譜柱需要進(jìn)行初始化。先斷開柱子和檢測(cè)器間的管路，用流動(dòng)相將色譜柱中的原有流動(dòng)相或氣泡移出色譜柱，然后再將色譜柱和檢測(cè)器間的管路接好。第85頁,共99頁，2024年2月25日，星期天保護(hù)色譜柱過濾所有的溶劑和樣品使用保護(hù)柱儀器使用完畢，要沖洗整個(gè)系統(tǒng)，移走系統(tǒng)中緩沖液柱子不使用時(shí)，兩端密封注意柱子使用的pH范圍不要高壓沖洗柱子，不要高溫下過長時(shí)間的使用硅膠鍵合相第86頁,共99頁，2024年2月25日，星期天常見色譜故障－基線噪音可能的原因－檢測(cè)池臟－檢測(cè)器燈能量下降－由泵引起的脈沖－檢測(cè)器上的溫度效應(yīng)－檢測(cè)池中有氣泡通過第87頁,共99頁，2024年2月25日，星期天常見色譜故障－基線漂移可能原因－梯