熒光光譜儀原理及其使用方法

熒光光譜儀原理及其使用方法處于基態(tài)的分子吸收能量（電、熱、化學(xué)和光能）被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，然后從不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)并發(fā)射出光子，此種現(xiàn)象稱為發(fā)光。發(fā)光分析包括熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光等。

物質(zhì)吸收光能后所產(chǎn)生的光輻射稱之為熒光和磷光。分子發(fā)光第2頁,共50頁，2024年2月25日，星期天不同類型的發(fā)光最普通的是熒光.如果當(dāng)一個(gè)物質(zhì)吸收一定波長的光然后給出較長波長的光稱為熒光.一些油漆、紙張具有熒光特性.其次是磷光.當(dāng)一種物質(zhì)吸收光，然后再發(fā)出光稱為磷光.如果磷光物質(zhì)暴露在陽光下，然后再帶到暗室內(nèi),給出的光稱為磷光.化學(xué)發(fā)光：當(dāng)2種化學(xué)物質(zhì)混合后給出的光.螢火蟲發(fā)光是一種生物發(fā)光.螢火蟲會(huì)產(chǎn)生.熒光素酶，導(dǎo)致發(fā)光.類似化學(xué)發(fā)光，兩種生物化學(xué)物質(zhì)混合產(chǎn)生光.第3頁,共50頁，2024年2月25日，星期天分子吸收、熒光、磷光輻射躍遷第4頁,共50頁，2024年2月25日，星期天無輻射躍遷——去活化過程

處于激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，通過輻射或非輻射躍遷等去活化過程返回至基態(tài)。這些過程包括：1）振動(dòng)弛豫

在液相或壓力足夠高的氣相中，處于激發(fā)態(tài)的分子因碰撞將能量以熱的形式傳遞給周圍的分子，從而從高振動(dòng)能層失活至低振動(dòng)能層的過程，稱為振動(dòng)弛豫。2）內(nèi)轉(zhuǎn)換

對(duì)于具有相同多重度的分子，若較高電子能級(jí)的低振動(dòng)能層與較低電子能級(jí)的高振動(dòng)能層相重疊時(shí)，則電子可在重疊的能層之間通過振動(dòng)耦合產(chǎn)生無輻射躍遷，如S2-S1；T2-T1。第5頁,共50頁，2024年2月25日，星期天定性分析任何熒光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。它們是熒光定性分析的基礎(chǔ)。1）激發(fā)光譜改變激發(fā)波長，測量在最強(qiáng)熒光發(fā)射波長處的強(qiáng)度變化，以激發(fā)波長對(duì)熒光強(qiáng)度作圖可得到激發(fā)光譜。激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經(jīng)校正后二者完全相同！這是因?yàn)榉肿游展饽艿倪^程就是分子的激發(fā)過程。激發(fā)光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)；在定量時(shí)，用于選擇最適宜的激發(fā)波長。第6頁,共50頁，2024年2月25日，星期天2）發(fā)射光譜發(fā)射光譜即熒光光譜。一定波長和強(qiáng)度的激發(fā)波長輻照熒光物質(zhì)，產(chǎn)生不同波長的強(qiáng)度的熒光，以熒光強(qiáng)度對(duì)其波長作圖可得熒光發(fā)射光譜。由于不同物質(zhì)具不同的特征發(fā)射峰，因而使用熒光發(fā)射光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)。萘激發(fā)、熒光、磷光如右圖所示。第7頁,共50頁，2024年2月25日，星期天激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系i）波長比較與激發(fā)（或吸收）波長相比，熒光發(fā)射波長更長，即產(chǎn)生所謂Stokes位移。（振動(dòng)弛豫失活所致）ii）形狀比較熒光光譜形狀與激發(fā)波長無關(guān)。盡管分子受激到可到達(dá)不同能級(jí)的激發(fā)態(tài)，但由于去活化（內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫）到第一電子激發(fā)態(tài)的速率或幾率很大，好像是分子受激只到達(dá)第一激發(fā)態(tài)一樣。換句話說，不管激發(fā)波長如何，電子都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能層躍遷到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層。第8頁,共50頁，2024年2月25日，星期天iii）鏡像對(duì)稱通常熒光光譜與吸收光譜呈鏡像對(duì)稱關(guān)系。蒽的熒光光譜和吸收光譜第9頁,共50頁，2024年2月25日，星期天解釋：能層結(jié)構(gòu)相似性熒光為第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能層躍遷到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層而形成，即其形狀與基態(tài)振動(dòng)能級(jí)分布有關(guān)。吸收光譜是由基態(tài)最低振動(dòng)能層躍遷到第一電子激發(fā)單重態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層而形成，即其形狀與第一電子激發(fā)單重態(tài)的振動(dòng)能級(jí)分布有關(guān)。由于激發(fā)態(tài)和基態(tài)的振動(dòng)能層分布具有相似性，因而呈鏡像對(duì)稱。S1S0熒光吸收第10頁,共50頁，2024年2月25日，星期天產(chǎn)生熒光的條件i）分子具有與輻射頻率相應(yīng)的熒光結(jié)構(gòu)（內(nèi)因）；ii）吸收特征頻率的光后，應(yīng)可產(chǎn)生具一定量子效率的熒光。即量子效率

足夠大：發(fā)射的光量子數(shù)=————————吸收的光量子數(shù)

第11頁,共50頁，2024年2月25日，星期天

1）躍遷類型：具有

—*及n—*躍遷結(jié)構(gòu)的分子才會(huì)產(chǎn)生熒光。且具

—*躍遷的量子效率比n—*躍遷的要大得多。芳香屬分子2）共軛效應(yīng)：共軛度越大，熒光越強(qiáng)。平面環(huán)系統(tǒng)，絕大多數(shù)熒光物質(zhì)含有芳香環(huán)或雜環(huán)影響熒光及強(qiáng)度的因素第12頁,共50頁，2024年2月25日，星期天3）剛性結(jié)構(gòu)：分子剛性（Rigidity）越強(qiáng)，分子振動(dòng)少，與其它分子碰撞失活的機(jī)率下降，熒光量子效率提高。如熒光素（大）與酚酞（=0）；芴（=1）與聯(lián)苯（=0.18）。第13頁,共50頁，2024年2月25日，星期天4）取代基：

給電子取代基增強(qiáng)熒光（p-共軛），如-OH、-OR、-NH2、-CN、NR2等；吸電子基降低熒光，如-COOH、-C=O、-NO2、-NO、-X等；如苯環(huán)被鹵素取代，從氟苯到碘苯，熒光逐漸減弱到消失第14頁,共50頁，2024年2月25日，星期天5）溶劑效應(yīng)：溶劑極性可增加或降低熒光強(qiáng)度（改變—*及

n—*

躍遷的能量）；與溶劑作用從而改變熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)來增加或降低熒光強(qiáng)度。6）溫度：溫度增加，熒光強(qiáng)度下降（因?yàn)閮?nèi)、外轉(zhuǎn)換增加、粘度或“剛性”降低）。因此體系降低溫度可增加熒光分析靈敏度。7）pH值：具酸或堿性基團(tuán)的有機(jī)物質(zhì)，在不同pH值時(shí)，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強(qiáng)度將發(fā)生改變；對(duì)無機(jī)熒光物質(zhì)，因pH值會(huì)影響其穩(wěn)定性，因而也可使其熒光強(qiáng)度發(fā)生改變。8）熒光猝滅：碰撞猝滅；靜態(tài)猝滅；轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅；電子轉(zhuǎn)移猝滅；自猝滅。第15頁,共50頁，2024年2月25日，星期天測量過程

提供能量(光源)選擇激發(fā)波長(吸收)照射樣品樣品吸收與發(fā)射熒光(發(fā)射)選擇發(fā)射波長測量第16頁,共50頁，2024年2月25日，星期天激發(fā)光譜告訴我們什么？

化合物吸收波長吸收強(qiáng)度

溶劑吸收波長第17頁,共50頁，2024年2月25日，星期天激發(fā)光譜

第18頁,共50頁，2024年2月25日，星期天發(fā)射光譜告訴我們什么？化合物熒光波長熒光強(qiáng)度拉曼和瑞利散射第19頁,共50頁，2024年2月25日，星期天發(fā)射光譜

第20頁,共50頁，2024年2月25日，星期天哪些峰不是樣品峰瑞利散射激發(fā)波長峰發(fā)射和激發(fā)相同波長的峰拉曼散射溶劑發(fā)射波長(documented)與激發(fā)波長相差固定頻率的波長2次或3次光發(fā)生在激發(fā)波長的2倍或3倍波長處

第21頁,共50頁，2024年2月25日，星期天瑞利散射

顆粒的大小小于入射光的波長.光通過樣品后頻率不變.由于彈性碰撞不存在能量的轉(zhuǎn)移.光線只是簡單地改變方向，波長不變.

粉末、懸浮液等樣品.

第22頁,共50頁，2024年2月25日，星期天拉曼散射

樣品吸收和發(fā)射光并伴隨有能量轉(zhuǎn)移的產(chǎn)生.光通過樣品后光的波長、頻率發(fā)生了改變.與入射光相比發(fā)射光的頻率可能更高或者更低.第23頁,共50頁，2024年2月25日，星期天瑞利、拉曼散射和2次光

瑞利散射峰350拉曼峰397↙↙2次光699792↙↓第24頁,共50頁，2024年2月25日，星期天外來峰的校正截止濾光片去除2次、3次等高次光差譜法去除拉曼和瑞利散射峰用高純?nèi)軇?無熒光)掃描溶劑確定拉曼峰維持測定溫度與條件第25頁,共50頁，2024年2月25日，星期天高通和帶通濾光片套件第26頁,共50頁，2024年2月25日，星期天高通濾光片用于去除散射光第27頁,共50頁，2024年2月25日，星期天定量第28頁,共50頁，2024年2月25日，星期天熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系

If=2.3

fI0

bc=KCIf=熒光相對(duì)強(qiáng)度

f=量子效率I0=入射光強(qiáng)度

=吸收系數(shù)b=光程長c=濃度該式只有bc<<0.05時(shí)才成立，即熒光測定只有在極稀溶液中才可測定，否則校正曲線向濃度軸彎曲。第29頁,共50頁，2024年2月25日，星期天標(biāo)準(zhǔn)表與標(biāo)準(zhǔn)曲線

第30頁,共50頁，2024年2月25日，星期天

熒光分光光度計(jì)原理和結(jié)構(gòu)第31頁,共50頁，2024年2月25日，星期天熒光分光光度計(jì)示意圖發(fā)射單色器PMPM分束器光源激發(fā)單色器——光閘樣品池第32頁,共50頁，2024年2月25日，星期天光源：氙燈、高壓汞燈、激光；樣品池：石英（低熒光材料）；兩個(gè)單色器：選擇激發(fā)光單色器；

分離熒光單色器；兩個(gè)檢測器：光電倍增管。主要部件第33頁,共50頁，2024年2月25日，星期天RF-5301PC光路圖第34頁,共50頁，2024年2月25日，星期天儀器性能高水平靈敏度：蒸餾水的拉曼峰S/N比為150以上（EX350nm，狹逢5nm）狹逢10nm拉曼峰S/N＞600第35頁,共50頁，2024年2月25日，星期天利用先進(jìn)的直流式長驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)，可及為迅速的得到理想的光譜可進(jìn)行高速光譜監(jiān)控，最高掃描速度５５００ｎｍ／ｍｉｎ波長范圍：220-900nm及0次狹逢：1.5、3、5、10、15、20nm6檔及激發(fā)6nm半高波長精度：±1.5nm

波長掃描速度Survey,Super,VeryFast,Medium,Slow,VerySlow的7段轉(zhuǎn)換；Survey,約5,500nm/min.Super約3,000nm/min.儀器性能第36頁,共50頁，2024年2月25日，星期天功能強(qiáng)大、操作簡便的軟件系統(tǒng)功能：激發(fā)光譜、熒光、同時(shí)光譜測定

定量分析（１－３次標(biāo)準(zhǔn)曲線）

時(shí)間掃描—?jiǎng)恿W(xué)

第37頁,共50頁，2024年2月25日，星期天只需打開自動(dòng)檢索最佳激發(fā)光和熒光波長從瑞利散射、拉曼散射及２次光中自動(dòng)判斷出熒光使復(fù)雜的波長設(shè)置簡單化檢索最佳的激發(fā)光和熒光波長第38頁,共50頁，2024年2月25日，星期天四則運(yùn)算數(shù)據(jù)變換（1-4介導(dǎo)數(shù)，倒數(shù)，對(duì)數(shù)）曲線平滑峰值檢測面積計(jì)算活度值計(jì)算等計(jì)算平均值多樣的數(shù)據(jù)處理第39頁,共50頁，2024年2月25日，星期天擴(kuò)展功能和附件大樣品室可安裝各種樣品池架ＬＣ流動(dòng)樣品池偏光裝置等第40頁,共50頁，2024年2月25日，星期天豐富的任選附件：單一恒溫樣品池（帶攪拌器）該部件在恒溫狀態(tài)下攪拌試樣，進(jìn)行測定，最適合浮游細(xì)胞的熒光測定。利用恒溫水的循環(huán)，可使樣品池恒溫化。攪拌器的速度可調(diào)節(jié)恒溫水循環(huán)裝置使用溫度范圍：室溫—850C

溫度調(diào)節(jié)精確度：+0.050C

泵的流量：最大15L/18L/min(50/60Hz)

容器的容量：約6.8L第41頁,共50頁，2024年2月25日，星期天恒溫四連池架利用恒溫水的循環(huán)，一次可使4個(gè)樣品池恒溫化。適用的溫度范圍：50C--800C微量樣品池裝置取400ul的少量試樣就能測定。試樣可以放入與四面研磨樣品池大?。?0mm)的槽中，安裝在樣品池架上進(jìn)行測定。第42頁,共50頁，2024年2月25日，星期天測定偏光的輔助裝置

（用于紫外可見光或只用于可見光）利用熒光偏光度的測定獲得關(guān)于分子的大小、流動(dòng)性及分子周圍環(huán)境的信息。高靈敏度池架第43頁,共50頁，2024年2月25日，星期天固體（粉末）樣品架固體、粉末樣品，甚至樣品池中的溶液也能用反射方式進(jìn)行熒光測定。高臺(tái)樣品架第44頁,共50頁，2024年2月25日，星期天LC流動(dòng)樣品池（12ul)用于高速液相色譜分析的高靈敏度分光熒光監(jiān)控。自由選擇激發(fā)光波長和熒光波長，可進(jìn)行有選擇的檢測。LC流動(dòng)樣品池（120ul)用于分析鄰苯二酚胺。使用內(nèi)容積120ul的散射光少的雙面反射型石英微型的流動(dòng)樣品池。第45頁,共50頁，2024年2月25日，星期天光電倍增管換用光電倍增管，可進(jìn)行900nm以內(nèi)的熒光光譜的測定。直徑8mm的試管架可以安裝試管第46頁,共50頁，2024年2月25日，星期天熒光應(yīng)用領(lǐng)域—生命科學(xué)氨基酸、縮氨酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、維生素、輔酶