(2.2)-3.chapter3酶工程酶工程酶工程

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EnzymeEngineering

第三章動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶是通過(guò)特定技術(shù)獲得優(yōu)良的動(dòng)物和植物細(xì)胞，然后在人工控制條件的反應(yīng)器中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，以獲得所需產(chǎn)物的技術(shù)過(guò)程。第三章動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶2內(nèi)容要點(diǎn)第一節(jié)動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶第三節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶掌握動(dòng)植物細(xì)胞合成酶特有的調(diào)節(jié)方式；熟悉植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶及動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的特性及生產(chǎn)工藝。重點(diǎn)：端粒酶，抗體酶，動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶流程；

難點(diǎn)：抗體酶;半抗原3學(xué)習(xí)要求4第一節(jié)動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)第一節(jié)動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)概述：共性：有關(guān)微生物細(xì)胞中酶合成的調(diào)節(jié)理論也基本適用于動(dòng)植物細(xì)胞：酶合成的誘導(dǎo)、酶合成的阻遏；5個(gè)性：動(dòng)植物細(xì)胞具有比微生物更多的調(diào)節(jié)方式如激素、神經(jīng)調(diào)節(jié)；1、細(xì)胞分化改變酶的生物合成2、基因擴(kuò)增加速酶的合成3、增強(qiáng)子促進(jìn)酶的生物合成4、抗原誘導(dǎo)抗體酶的生物合成第一節(jié)動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)61細(xì)胞分化改變酶的生物合成由于真核生物基因表達(dá)的時(shí)空差異，不同分化類(lèi)型的細(xì)胞中基因表達(dá)不同，酶的合成和表達(dá)不同。細(xì)胞分化可以改變酶的生物合成。7如端粒酶的合成。隨著細(xì)胞分化，端粒酶的生物合成發(fā)生了改變，分化程度越高，端粒酶活性越低。端粒是真核生物染色體的末端結(jié)構(gòu)，由富含GT的DNA序列不斷重復(fù)而成。如人的端粒重復(fù)單位為T(mén)TAGGG。

1.1端粒的結(jié)構(gòu)與功能8每次細(xì)胞分裂（DNA復(fù)制）每次染色體進(jìn)行復(fù)制的時(shí)候，末端的DNA總是會(huì)發(fā)生丟失，即留下一個(gè)末端空缺。1.1端粒的結(jié)構(gòu)與功能9隨著細(xì)胞不斷分裂，端粒的長(zhǎng)度將越來(lái)越短，當(dāng)達(dá)到一個(gè)臨界長(zhǎng)度時(shí)，染色體會(huì)失去穩(wěn)定性而被降解。1.1端粒的結(jié)構(gòu)與功能10端粒的功能：端?？梢员Ｗo(hù)真核生物染色體免遭破壞，保護(hù)染色體的完整性。1.1端粒的結(jié)構(gòu)與功能11隨著細(xì)胞不斷地進(jìn)行分裂，端粒的長(zhǎng)度將越來(lái)越短，當(dāng)達(dá)到一個(gè)臨界長(zhǎng)度時(shí)，染色體會(huì)被降解，細(xì)胞不再分裂而凋亡，端粒的長(zhǎng)度決定了細(xì)胞的壽命，因此可根據(jù)端粒重復(fù)序列的長(zhǎng)度來(lái)推測(cè)細(xì)胞可以進(jìn)行分裂的次數(shù)。1.1端粒的結(jié)構(gòu)與功能1210000對(duì)7500對(duì)4800對(duì)端?！吧鼤r(shí)鐘”13端粒的功能：端粒可以保護(hù)真核生物染色體免遭破壞，保護(hù)染色體的完整性。1.1端粒的結(jié)構(gòu)與功能14端粒酶是催化端粒合成和延長(zhǎng)的酶，為一種核糖核蛋白，包含蛋白質(zhì)和RNA兩種基本成分。1.2端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能15端粒酶是蛋白類(lèi)酶還是核酸類(lèi)酶？人類(lèi)端粒酶RNAhumantelomeraseRNAcomponent，hTERC人類(lèi)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶humantelomerasereversetranscriptase，hTERT16端粒酶是核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，以自身RNA為模板，合成端粒DNA，將端粒DNA加至真核細(xì)胞染色體末端，為細(xì)胞持續(xù)分裂提供遺傳基礎(chǔ)。1.2端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能17端粒酶具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，屬于蛋白類(lèi)酶。端粒酶是蛋白類(lèi)酶還是核酸類(lèi)酶？18端粒酶可以通過(guò)結(jié)合、延伸、移位三個(gè)步驟催化端粒的合成和延長(zhǎng),保證染色體復(fù)制的完整性。1.2端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能若端粒酶不失活？1.細(xì)胞分化改變酶的生物合成19隨著細(xì)胞分化，在人體的正常細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)不到端粒酶的活性，而在分化程度較低的細(xì)胞中可以檢測(cè)到。隨著細(xì)胞分化，端粒酶的生物合成發(fā)生了改變，分化程度越高，端粒酶活性越低。大約90%的癌細(xì)胞都有著不斷增長(zhǎng)的端粒及相對(duì)來(lái)說(shuō)數(shù)量較多的端粒酶。端粒酶為延緩衰老，治療疾病如治療癌癥帶來(lái)了希望20知識(shí)拓展——端粒酶與抗癌2009年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主是三位美國(guó)科學(xué)家，他們的研究主題是“染色體如何受到端粒和端粒酶的保護(hù)”

該研究可能對(duì)癌癥的治療和人類(lèi)的衰老之謎有貢獻(xiàn)。211.2端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能22知識(shí)拓展——端粒酶與抗癌1.2、基因擴(kuò)增加速酶的合成基因擴(kuò)增是通過(guò)增加基因的數(shù)量來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種方式。通過(guò)基因擴(kuò)增來(lái)調(diào)節(jié)酶的生物合成，可以在某種特殊條件下發(fā)生，作為應(yīng)激手段，使某種酶的合成大量增加。23Eg：非洲爪蟾卵細(xì)胞形成時(shí)，其rRNA基因增加了約4000倍。1.3增強(qiáng)子促進(jìn)酶的生物合成增強(qiáng)子是一段能高效增強(qiáng)或促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。增強(qiáng)子在酶的生物合成過(guò)程中，可以高效增強(qiáng)某些酶基因的表達(dá)。241、細(xì)胞分化改變酶的生物合成—端粒酶（telomerase）2、基因擴(kuò)增加速酶的合成3、增強(qiáng)子促進(jìn)酶的生物合成4、抗原誘導(dǎo)抗體酶的生物合成—抗體酶（abzyme）第一節(jié)動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)25知識(shí)回顧：抗體26抗體是B細(xì)胞在外界抗原物質(zhì)刺激下合成的一類(lèi)球狀蛋白質(zhì)，就是免疫球蛋白，其分子由兩條輕鏈和兩條重鏈由二硫鍵交聯(lián)構(gòu)成，N端的aa組成可變，它們可以專(zhuān)一第識(shí)別并結(jié)合抗原。1.4抗原誘導(dǎo)抗體酶的生物合成27抗體酶是一類(lèi)具有生物催化功能的抗體分子。

本質(zhì)上是一類(lèi)具有催化活力的免疫球蛋白，在抗體的可變區(qū)賦予了酶的屬性，因此又稱(chēng)催化性抗體（catalyticantibody）。1、半抗原誘導(dǎo)法以預(yù)先的過(guò)渡態(tài)底物類(lèi)似物作半抗原，與載體蛋白偶聯(lián)制備抗原，然后免疫動(dòng)物，再經(jīng)過(guò)單克隆抗體制備篩選得到的抗體酶。半抗原誘導(dǎo)法是制備抗體酶的主要方法。2、酶蛋白誘導(dǎo)法以某種酶蛋白作為抗原誘導(dǎo)抗體酶生產(chǎn)的方法。1.4抗原誘導(dǎo)抗體酶的生物合成——抗體酶的制備28抗體酶合成的理論基礎(chǔ)1948年，Pauling提出的過(guò)渡態(tài)理論。過(guò)渡態(tài)理論認(rèn)為,酶之所以能夠催化加速化學(xué)反應(yīng),在于它能夠和底物結(jié)合形成過(guò)渡態(tài)中間體,從而降低了反應(yīng)的活化能,使反應(yīng)加速進(jìn)行。29

1、在酶的催化反應(yīng)中，與酶的活性中心形成復(fù)合物的實(shí)際上是過(guò)渡態(tài)的底物。2、能與過(guò)渡態(tài)結(jié)合的物質(zhì)也具有酶的性質(zhì);抗體一旦能與過(guò)渡態(tài)相結(jié)合，它就具有酶的性質(zhì)。設(shè)計(jì)原理：設(shè)計(jì)和制備穩(wěn)定的過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物作為半抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，這樣產(chǎn)生的抗體就能識(shí)別反應(yīng)過(guò)程的真正過(guò)渡態(tài)，該抗體具有酶催化反應(yīng)的基本特征，成為一種具有酶活性的抗體也即抗體酶。301.4.1半抗原誘導(dǎo)法

半抗原：能與對(duì)應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)抗原-抗體反應(yīng)、又不能單獨(dú)激發(fā)人或動(dòng)物體產(chǎn)生抗體的抗原。它只有反應(yīng)原性，不具免疫原性（抗原性），又稱(chēng)不完全抗原。載體蛋白半抗原抗體酶抗體過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物制備半抗原制備單克隆抗體免疫動(dòng)物分離篩選抗體酶反應(yīng)過(guò)渡態(tài)底物311.4.1半抗原誘導(dǎo)法以預(yù)先的過(guò)渡態(tài)底物類(lèi)似物作半抗原，與載體蛋白偶聯(lián)制備抗原，然后免疫動(dòng)物，再經(jīng)過(guò)單克隆抗體制備篩選得到的抗體酶。半抗原誘導(dǎo)法2.1植物細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn)2.2植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝流程及控制獲得方式培養(yǎng)方式條件控制2.3植物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)例（略）

第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶322.1植物細(xì)胞的特點(diǎn)體積較大細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝速率低于微生物，周期長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單細(xì)胞生長(zhǎng)及合成次級(jí)代謝產(chǎn)物需要光照條件對(duì)剪切力較敏感主要用于產(chǎn)天然產(chǎn)物、色素、香精等有機(jī)物第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶2.2

植物細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)提高產(chǎn)率縮短周期易于管理，不受自然因素控制提高質(zhì)量

2.3植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及控制2.3.1植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝流程35

外植體

細(xì)胞的獲取

細(xì)胞培養(yǎng)

分離純化

產(chǎn)物1.外植體的獲?。哼x擇無(wú)病蟲(chóng)害、生長(zhǎng)力旺盛，生長(zhǎng)規(guī)則的植株

2.切成小段，用75%消毒處理無(wú)菌水漂洗2.2植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及控制2.3.1植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝流程36

外植體

細(xì)胞的獲取

細(xì)胞培養(yǎng)

分離純化

產(chǎn)物機(jī)械搗碎法：搗碎過(guò)濾離心

3.愈傷組織誘導(dǎo)法直接分離法愈傷組織誘導(dǎo)法原生質(zhì)體再生法2.酶解法：纖維素酶、果膠酶機(jī)械法、酶解法2.2植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及控制2.3.1植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝流程37

外植體

細(xì)胞的獲取

細(xì)胞培養(yǎng)

分離純化

產(chǎn)物1.細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

2.發(fā)酵罐培養(yǎng)3.1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)3.2動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制3.3動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)例（略）

第三節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶38第三節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶3.1動(dòng)物細(xì)胞特性沒(méi)有細(xì)胞壁，細(xì)胞脆弱在培養(yǎng)時(shí)具有群體效應(yīng)、貼壁依賴(lài)性、接觸抑制性、功能全能性營(yíng)養(yǎng)要求復(fù)雜（血清培養(yǎng)基）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)特性生長(zhǎng)緩慢；容易污染，培養(yǎng)過(guò)程中需加抗生素、對(duì)剪切力特別敏感、貼壁培養(yǎng)、培養(yǎng)基成分復(fù)雜，價(jià)格高昂；細(xì)胞生命有限，一般最多繼代培養(yǎng)50代即退化死亡。403.2動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝流程（1）將動(dòng)物組織切成碎片；（2）用胰蛋白酶處理，分散組織得到單個(gè)細(xì)胞（3）離心收集細(xì)胞；（4）植入營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，細(xì)胞增值到覆蓋瓶壁表面①②③④

獲取細(xì)胞懸浮細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)

分離純化

產(chǎn)物3.2.1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝流程413.2動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（5）胰蛋白酶消化使細(xì)胞脫落，再接種到培養(yǎng)瓶擴(kuò)大