《生物技術(shù)+核酸靶序列定量方法的性能評價要求+qpcr法和dpcr法gbt+42077-2022》

《生物技術(shù)核酸靶序列定量方法的性能評價要求qpcr法和dpcr法gb/t42077-2022》詳細解讀contents目錄1范圍2規(guī)范性引用文件3術(shù)語和定義4測量程序設(shè)計5樣品質(zhì)控—核酸總量、完整性和純度6核酸靶序列定量的方法設(shè)計和優(yōu)化contents目錄7數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與分析8核酸定量測量方法的驗證9核酸定量測量方法的溯源性和可比性10qPCR和dPCR測量的測量不確定度11報告附錄A(資料性)分光光度法contents目錄附錄B(資料性)核酸完整性附錄C(資料性)PCR擴增效率附錄D(資料性)測量不確定度附錄E(資料性)MIQE和dMIQE清單參考文獻011范圍血液、組織、細胞等臨床樣本病原體樣本動植物樣本其他生物樣本1.1適用的生物樣本類型DNARNA其他核酸類型1.2適用的核酸類型qPCR法dPCR法1.3適用的定量方法試劑生產(chǎn)企業(yè)臨床實驗室科研機構(gòu)1.4性能評價要求適用范圍其他需要進行核酸靶序列定量的單位或機構(gòu)注：該標(biāo)準(zhǔn)提供了qPCR法和dPCR法在核酸靶序列定量中的性能評價要求，包括準(zhǔn)確性、精密度、特異性、靈敏度、線性范圍、抗干擾能力等方面。這些要求適用于不同類型的生物樣本和核酸類型，旨在確保定量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。同時，該標(biāo)準(zhǔn)也適用于試劑生產(chǎn)企業(yè)、臨床實驗室、科研機構(gòu)等需要進行核酸靶序列定量的單位或機構(gòu)，為這些機構(gòu)提供了統(tǒng)一的性能評價標(biāo)準(zhǔn)。1.4性能評價要求適用范圍022規(guī)范性引用文件提供基礎(chǔ)和支持規(guī)范性引用文件為核酸靶序列定量方法（如qPCR法和dPCR法）的性能評價提供了基礎(chǔ)和支持，確保了評價結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)通過引用相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，使得不同實驗室和研究人員在進行性能評價時能夠遵循統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，提高了結(jié)果的可比性和一致性。引用文件的重要性核酸提取和純化方法01規(guī)范性引用文件中包括了核酸提取和純化的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，以確保實驗中所使用的核酸樣本的質(zhì)量和純度符合要求。qPCR和dPCR反應(yīng)體系和條件02規(guī)范性引用文件中詳細規(guī)定了qPCR和dPCR反應(yīng)體系和條件，包括引物、探針、酶、緩沖液等組分的選擇和濃度，以及反應(yīng)溫度、時間和循環(huán)數(shù)等參數(shù)的設(shè)置。數(shù)據(jù)處理和分析方法03規(guī)范性引用文件中提供了數(shù)據(jù)處理和分析的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，包括原始數(shù)據(jù)的收集、整理、統(tǒng)計和分析方法，以及結(jié)果的可視化和報告方式等。引用文件的內(nèi)容規(guī)范性引用文件可能會隨著科學(xué)技術(shù)的進步和實驗方法的改進而不斷更新，因此在使用時應(yīng)注意選擇最新版本的引用文件。規(guī)范性引用文件通常針對特定的實驗方法和應(yīng)用場景而制定，因此在使用時應(yīng)注意其適用范圍和限制條件，避免誤用或濫用。版本更新適用范圍引用文件的注意事項033術(shù)語和定義指特定生物體或病原體的核酸序列，通常用于生物技術(shù)的檢測和分析。定義具有特異性、穩(wěn)定性和可檢測性，是生物技術(shù)領(lǐng)域的重要研究對象。特點3.1核酸靶序列3.2定量方法定義指對核酸靶序列進行準(zhǔn)確定量的方法，包括qPCR法和dPCR法等。目的通過定量方法，可以確定樣品中核酸靶序列的絕對或相對數(shù)量，為生物技術(shù)的應(yīng)用提供重要數(shù)據(jù)支持。實時熒光定量PCR技術(shù)，是一種在PCR反應(yīng)過程中實時監(jiān)測熒光信號變化的方法。利用熒光染料或熒光探針與PCR產(chǎn)物結(jié)合，實時監(jiān)測熒光信號的變化，從而推算出樣品中核酸靶序列的數(shù)量。3.3qPCR法原理定義定義數(shù)字PCR技術(shù)，是一種將PCR反應(yīng)體系分配到大量微小反應(yīng)單元中進行擴增和檢測的方法。原理將PCR反應(yīng)體系分配到大量微小反應(yīng)單元中，每個反應(yīng)單元包含一個或多個核酸分子，通過擴增和檢測每個反應(yīng)單元的熒光信號，實現(xiàn)對核酸靶序列的絕對定量。3.4dPCR法044測量程序設(shè)計針對目標(biāo)核酸序列，設(shè)計特異性引物和探針，確保擴增效率和特異性。引物和探針設(shè)計優(yōu)化反應(yīng)體系中的各組分濃度，包括引物、探針、酶、緩沖液等，以獲得最佳擴增效果。反應(yīng)體系優(yōu)化根據(jù)引物和探針的特性，設(shè)置合適的擴增條件，如退火溫度、延伸時間等。擴增條件設(shè)置采用合適的數(shù)據(jù)分析方法，如標(biāo)準(zhǔn)曲線法、比較Ct值法等，對qPCR結(jié)果進行定量分析。數(shù)據(jù)分析方法4.1qPCR法測量程序設(shè)計引物和探針設(shè)計分液和加樣擴增條件設(shè)置數(shù)據(jù)分析方法4.2dPCR法測量程序設(shè)計同樣需要針對目標(biāo)核酸序列設(shè)計特異性引物和探針。根據(jù)引物和探針的特性，設(shè)置合適的擴增條件。將反應(yīng)體系均分到大量微小的反應(yīng)單元中，確保每個反應(yīng)單元中的核酸分子數(shù)符合泊松分布。采用泊松分布原理，對dPCR結(jié)果進行絕對定量分析，如計算目標(biāo)核酸分子的拷貝數(shù)等。確保樣本處理過程的規(guī)范性和一致性，避免樣本間的差異對測量結(jié)果產(chǎn)生影響。樣本處理使用高質(zhì)量的試劑和耗材，確保測量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。試劑和耗材定期對儀器進行校準(zhǔn)和維護，確保儀器的性能和精度符合要求。儀器校準(zhǔn)和維護對實驗人員進行專業(yè)培訓(xùn)，提高實驗技能和操作規(guī)范性。人員培訓(xùn)4.3測量程序的質(zhì)量控制055樣品質(zhì)控—核酸總量、完整性和純度03注意事項在測定核酸總量時，需要注意避免樣品污染、操作規(guī)范以及儀器的校準(zhǔn)等問題，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。01核酸總量的重要性核酸總量是評估樣品質(zhì)量的基礎(chǔ)指標(biāo)，對于后續(xù)的定量分析至關(guān)重要。02測定方法常用的測定方法包括紫外分光光度法和熒光染料法，這些方法可以快速、準(zhǔn)確地測定核酸總量。核酸總量核酸完整性是指核酸分子在提取過程中是否保持完整，對于PCR等需要完整核酸分子的實驗至關(guān)重要。核酸完整性的意義常用的評估方法包括凝膠電泳法和毛細管電泳法，這些方法可以檢測核酸分子的降解程度和大小分布。評估方法核酸完整性的影響因素包括樣品處理、提取方法、保存條件等，需要在實驗過程中進行嚴(yán)格控制。影響因素核酸完整性核酸純度是指樣品中核酸分子與雜質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多糖等）的比例，對于后續(xù)實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性有很大影響。核酸純度的定義常用的測定方法包括吸光值法和熒光法，這些方法可以快速、準(zhǔn)確地測定核酸純度。測定方法在提取過程中可以通過優(yōu)化裂解液成分、增加洗滌步驟、使用純化柱等方法來提高核酸純度。同時，避免反復(fù)凍融和長時間保存也可以減少雜質(zhì)的產(chǎn)生。提高純度的方法核酸純度066核酸靶序列定量的方法設(shè)計和優(yōu)化特異性確保所選的核酸靶序列在生物樣本中具有唯一性，避免非特異性擴增。準(zhǔn)確性定量結(jié)果應(yīng)準(zhǔn)確可靠，能夠真實反映樣本中核酸靶序列的濃度。靈敏度方法應(yīng)具有高靈敏度，能夠檢測到低濃度的核酸靶序列。重復(fù)性方法應(yīng)具有良好的重復(fù)性，不同實驗室或不同操作者應(yīng)能獲得一致的結(jié)果。方法設(shè)計原則通過優(yōu)化引物和探針的序列、長度、GC含量等參數(shù)，提高擴增效率和特異性。引物和探針設(shè)計優(yōu)化反應(yīng)體系中的各組分濃度，如酶、dNTPs、緩沖液等，以獲得最佳擴增效果。反應(yīng)體系優(yōu)化調(diào)整退火溫度、延伸時間等反應(yīng)條件，以提高擴增效率和準(zhǔn)確性。反應(yīng)條件優(yōu)化采用合適的數(shù)據(jù)處理和分析方法，如標(biāo)準(zhǔn)曲線法、比較Ct法等，對定量結(jié)果進行準(zhǔn)確解讀。數(shù)據(jù)處理和分析方法優(yōu)化策略077數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與分析樣本質(zhì)量控制確保樣本的完整性、純度和代表性，避免樣本污染或降解對實驗結(jié)果的影響。試劑和儀器質(zhì)量控制使用高質(zhì)量的試劑和校準(zhǔn)的儀器，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。實驗操作規(guī)范遵循標(biāo)準(zhǔn)的實驗操作規(guī)范，減少人為誤差對實驗結(jié)果的影響。7.1數(shù)據(jù)質(zhì)量控制對原始數(shù)據(jù)進行清洗、整理和標(biāo)準(zhǔn)化處理，消除異常值和噪聲對數(shù)據(jù)分析的影響。數(shù)據(jù)預(yù)處理統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果解讀采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法對數(shù)據(jù)進行分析，比較不同組別之間的差異，并計算置信區(qū)間和顯著性水平。結(jié)合專業(yè)知識和實驗?zāi)康模瑢Ψ治鼋Y(jié)果進行合理解讀和判斷，得出科學(xué)、準(zhǔn)確的結(jié)論。0302017.2數(shù)據(jù)分析088核酸定量測量方法的驗證01028.1驗證目的評估方法的準(zhǔn)確性、精密度和特異性，以滿足實際應(yīng)用的需求。確保所選的核酸定量測量方法適用于特定的實驗條件和目標(biāo)核酸。8.2驗證內(nèi)容驗證方法在不同濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系，確保測量結(jié)果的準(zhǔn)確性。評估方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性，包括批內(nèi)和批間的變異系數(shù)。驗證方法對于目標(biāo)核酸的特異性，排除非特異性擴增或干擾的影響。確定方法的最低檢測限和定量限，以滿足實際應(yīng)用中對低濃度核酸的定量需求。線性范圍精密度特異性靈敏度0102048.3驗證方法使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或參考物質(zhì)進行驗證，比較測量結(jié)果與理論值的一致性。通過重復(fù)實驗和多人操作來評估方法的精密度和再現(xiàn)性。設(shè)計特異性實驗，如使用不同種類的核酸或添加抑制劑來驗證方法的特異性。通過稀釋已知濃度的樣品來確定方法的靈敏度，并計算最低檢測限和定量限。03對驗證結(jié)果進行統(tǒng)計分析，計算線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，評估線性關(guān)系。計算批內(nèi)和批間的變異系數(shù)，評估方法的精密度和再現(xiàn)性。根據(jù)特異性實驗的結(jié)果判斷方法的特異性是否滿足要求。根據(jù)靈敏度實驗的結(jié)果確定方法的最低檢測限和定量限，為實際應(yīng)用提供參考依據(jù)。010203048.4驗證結(jié)果的處理和解釋099核酸定量測量方法的溯源性和可比性溯源性定義01指測量結(jié)果或測量標(biāo)準(zhǔn)的值能夠通過連續(xù)的比較鏈，與規(guī)定的參考標(biāo)準(zhǔn)（通常是國家標(biāo)準(zhǔn)或國際標(biāo)準(zhǔn)）聯(lián)系起來的特性。核酸定量方法的溯源性02在核酸定量測量中，溯源性是通過使用已知濃度的參考物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)品來實現(xiàn)的，這些參考物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣本在相同的條件下進行測量和比較。溯源性對于核酸定量的意義03確保測量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，使得不同實驗室、不同測量方法之間能夠進行有效的比較和交流。溯源性可比性定義指不同測量方法之間或同一測量方法在不同條件下進行測量時，所得結(jié)果之間的一致程度。核酸定量方法的可比性在核酸定量測量中，可比性是通過使用相同的參考物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)品、遵循相同的測量程序和規(guī)范來實現(xiàn)的。可比性對于核酸定量的意義提高測量結(jié)果的互認性和通用性，為科學(xué)研究、臨床診斷和治療等提供更為準(zhǔn)確和可靠的數(shù)據(jù)支持。同時，可比性也是評價不同測量方法性能優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一?？杀刃?010qPCR和dPCR測量的測量不確定度03注意事項需要關(guān)注實驗過程中的操作規(guī)范、試劑質(zhì)量、儀器校準(zhǔn)等因素，以減少測量不確定度。01影響因素包括反應(yīng)體系、引物與探針設(shè)計、模板質(zhì)量、擴增效率、熒光信號采集等。02評估方法通過重復(fù)測量、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線、使用內(nèi)參基因等方法來評估測量不確定度。qPCR測量的測量不確定度影響因素包括分區(qū)數(shù)量、泊松分布、反應(yīng)體系、模板質(zhì)量、擴增效率等。評估方法通過重復(fù)測量、建立標(biāo)準(zhǔn)品比較、使用統(tǒng)計模型等方法來評估測量不確定度。注意事項需要關(guān)注分區(qū)數(shù)量的選擇、反應(yīng)體系的優(yōu)化、模板的制備與保存等因素，以減少測量不確定度。同時，dPCR技術(shù)對于低濃度樣本的檢測具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，但也需要注意假陽性和假陰性的風(fēng)險。dPCR測量的測量不確定度1111報告方法性能評價的結(jié)果包括準(zhǔn)確性、精密度、靈敏度、特異性等指標(biāo)的評價結(jié)果。數(shù)據(jù)分析和解釋對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，解釋結(jié)果的意義和可能的影響因素。結(jié)論和建議根據(jù)評價結(jié)果得出結(jié)論，提出改進方法和應(yīng)用的建議。11.1報告內(nèi)容標(biāo)題頁包括方法名稱、實驗日期、實驗人員等信息。正文按照方法性能評價的指標(biāo)分別進行描述和分析。圖表和附件包括實驗數(shù)據(jù)表、標(biāo)準(zhǔn)曲線圖、擴增曲線圖等，以便更直觀地展示實驗結(jié)果。11.2報告格式03報告應(yīng)遵守相關(guān)的法律法規(guī)和倫理規(guī)范，保護實驗對象的隱私和權(quán)益。01報告應(yīng)客觀、準(zhǔn)確地反映實驗結(jié)果，避免主觀臆斷和誤導(dǎo)性陳述。02報告中的數(shù)據(jù)應(yīng)真實、可靠，不得隨意篡改或捏造數(shù)據(jù)。11.3報告注意事項12附錄A(資料性)分光光度法分光光度法是一種基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法。通過測定被測物質(zhì)在特定波長處的吸光度，可以推算出其濃度。原理分光光度計用于測定吸光度的主要儀器，需定期校準(zhǔn)以保證準(zhǔn)確性。比色皿用于盛放被測溶液，需選擇透光性好的材質(zhì)。其他輔助設(shè)備如移液器、洗瓶等。儀器與設(shè)備將待測核酸溶液稀釋至適當(dāng)濃度，以減小測量誤差。樣品準(zhǔn)備以純水或相應(yīng)緩沖液作為空白對照，消除背景干擾。空白對照設(shè)置在選定波長下，分別測定樣品和空白對照的吸光度值。吸光度測定根據(jù)吸光度值計算核酸濃度，并進行結(jié)果分析和解讀。數(shù)據(jù)處理與分析操作步驟選擇合適的測定波長不同物質(zhì)對光的吸收波長不同，需根據(jù)被測物質(zhì)選擇合適的波長。避免干擾物質(zhì)某些物質(zhì)可能會干擾吸光度測定，需采取措施消除干擾。保證儀器準(zhǔn)確性定期對分光光度計進行校準(zhǔn)和維護，以保證測量結(jié)果的準(zhǔn)確性。注意事項13附錄B(資料性)核酸完整性核酸分子結(jié)構(gòu)的保持核酸完整性指的是核酸分子（DNA或RNA）在特定條件下，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的相對穩(wěn)定性，即核酸鏈未發(fā)生斷裂或降解。功能性的維持核酸完整性還包括核酸分子在生物體內(nèi)或?qū)嶒烍w系中維持其特定生物學(xué)功能或?qū)嶒炗猛镜哪芰?。核酸完整性定義通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察核酸條帶的遷移距離和亮度，評估核酸的完整性和大小分布。凝膠電泳法利用與核酸結(jié)合的熒光染料，在特定波長下激發(fā)熒光信號，通過熒光強度或顏色變化評估核酸的完整性和濃度。熒光染料法利用生物傳感器技術(shù)，如表面等離子共振（SPR）或石英晶體微天平（QCM）等，實時監(jiān)測核酸與傳感器表面的相互作用，從而評估核酸的完整性和親和力。生物傳感器法核酸完整性評估方法擴增效率核酸完整性差可能導(dǎo)致PCR擴增效率降低，因為斷裂的核酸鏈可能無法與引物有效結(jié)合或延伸。定量準(zhǔn)確性核酸降解產(chǎn)生的短片段可能在PCR過程中產(chǎn)生非特異性擴增或競爭抑制，從而影響目標(biāo)序列的定量準(zhǔn)確性。數(shù)據(jù)可重復(fù)性核酸完整性不一致可能導(dǎo)致實驗結(jié)果的波動和不可重復(fù)性，因為不同完整性的核酸樣本在相同實驗條件下可能產(chǎn)生不同的PCR信號。核酸完整性對qPCR和dPCR的影響123在樣本采集和處理過程中，應(yīng)避免使用強酸、強堿或高溫等極端條件，以減少核酸的降解。樣本采集和處理選擇適當(dāng)?shù)暮怂崽崛『图兓椒?，以去除可能干擾PCR反應(yīng)的雜質(zhì)和抑制劑，同時保持核酸的完整性。核酸提取和純化將提取的核酸樣本儲存在適當(dāng)?shù)木彌_液中，并避免反復(fù)凍融和長時間儲存，以減少核酸的降解和損傷。儲存條件保證核酸完整性的措施14附錄C(資料性)PCR擴增效率PCR擴增效率是指PCR反應(yīng)中，每個循環(huán)內(nèi)DNA模板被復(fù)制的比例。它是評估PCR反應(yīng)性能的重要指標(biāo)之一。PCR擴增效率定義引物設(shè)計引物的特異性、長度、GC含量等都會影響PCR擴增效率。酶的選擇不同的DNA聚合酶具有不同的擴增效率和保真性。反應(yīng)條件退火溫度、延伸時間等反應(yīng)條件的優(yōu)化對于提高PCR擴增效率至關(guān)重要。影響PCR擴增效率的因素PCR擴增效率的測定方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法通過制備已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計算未知樣品的濃度和PCR擴增效率。實時熒光定量PCR法利用熒光染料或探針實時監(jiān)測PCR產(chǎn)物的生成，通過軟件分析得到PCR擴增效率。優(yōu)化引物設(shè)計選擇特異性高、長度適中、GC含量合理的引物。選擇合適的酶根據(jù)需要選擇具有高擴增效率和保真性的DNA聚合酶。優(yōu)化反應(yīng)條件通過調(diào)整退火溫度、延伸時間等反應(yīng)條件，提高PCR擴增效率。提高PCR擴增效率的方法15附錄D(資料性)測量不確定度表示被測量值分散性的非負參數(shù)，用于描述測量結(jié)果的可信程度。不確定度定義在生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是核酸檢測中，測量不確定度對于結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性至關(guān)重要。不確定度重要性不確定度概念及意義01020304樣本因素包括樣本來源、采集、處理及保存等環(huán)節(jié)引入的變異。試劑及耗材不同批次、品牌及質(zhì)量的試劑和耗材可能導(dǎo)致測量結(jié)果的差異。儀器設(shè)備儀器設(shè)備的精度、穩(wěn)定性及校準(zhǔn)情況等因素會影響測量結(jié)果。操作人員操作人員的技能水平、操作規(guī)范性及