基因工程大實(shí)驗(yàn)

基因工程及分子生物學(xué)

大實(shí)驗(yàn)邢萬(wàn)金蘇慧敏內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系5/8/20241基因工程大實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)基因操作的基本技術(shù)熟悉基因克隆常規(guī)儀器的使用學(xué)習(xí)科研項(xiàng)目的開(kāi)題論證培養(yǎng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)的獨(dú)立操作能力建立做好原始實(shí)驗(yàn)記錄的習(xí)慣練習(xí)撰寫(xiě)研究論文5/8/20242基因工程大實(shí)驗(yàn)二、教學(xué)組織學(xué)生自主設(shè)計(jì)方案教師審查方案可行學(xué)生獨(dú)立實(shí)驗(yàn)操作教師現(xiàn)場(chǎng)巡回指導(dǎo)學(xué)生失敗互相救助教師把關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果5/8/20243基因工程大實(shí)驗(yàn)三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容目的基因的亞克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建、在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)。5/8/20244基因工程大實(shí)驗(yàn)1.目的基因納豆激酶成熟肽（NK）（原核）

位于pMD18-T-NK(full)

綠色熒光蛋白（EGFP）（真核）

位于pEGFP-N1上紅色熒光蛋白（DsRed2）（真核）位于pDsRed2-1上其它基因（教師在研課題）5/8/20245基因工程大實(shí)驗(yàn)pMD18-T-NK(full):3.8kp納豆激酶全長(zhǎng)1181bpDNA已插入pMD18-T5/8/20246基因工程大實(shí)驗(yàn)2.載體pMD19-T（TA克?。﹑UCm-T（TA克隆）pET-Trx（融合表達(dá)）pGEX-4T1（融合表達(dá)）克隆載體：表達(dá)載體：5/8/20247基因工程大實(shí)驗(yàn)pMD18/19-T5/8/20248基因工程大實(shí)驗(yàn)pUCm-T5/8/20249基因工程大實(shí)驗(yàn)pET-Trx3.3kbMCSAmpT7PT7RBS

TRX(his-patch)

CTCGAAGTTCTGTTTCAGGGTCCAGCAGGATCCGCAGAATTCAGCGCT

AGC

TAACATCATCATCATCATTAAGCTT

LeuGluValLeuPheGlnGlyProBamHIEcoRINheIHindIIIBamHIEcoRINheIstopHindIIIP3Ccutsite5/8/202410基因工程大實(shí)驗(yàn)pGEX-4T1pGEX-4T1~4950bpLacIAmpPtacGSTBamHI

EcoRI

SmaIXhoISalINotIGTCGTTCCGCGTGGATCCCCGGAATTCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCGCATCGTGACTGALeuValProArgGlySerProGluPheProGlyArgLeuGluArgProHisArgAspThrombine5/8/202411基因工程大實(shí)驗(yàn)四、實(shí)驗(yàn)流程提取目的基因模板提取表達(dá)載體質(zhì)粒PCR擴(kuò)增目的基因EcoRI+BamHI雙酶切回收T載體目的基因亞克隆載體EcoRI+BamHI雙酶切回收目的基因片段目的基因表達(dá)載體IPTG誘導(dǎo)表達(dá)酶切鑒定酶切鑒定SDS檢測(cè)感受態(tài)DH5α感受態(tài)BL21(DE3)5/8/202412基因工程大實(shí)驗(yàn)參考計(jì)劃觀察，轉(zhuǎn)入清水，照相下午灌膠加樣電泳，染色45min，脫色過(guò)夜上午第九天OD600=0.5時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)3h，離心集菌下午早晨7：00搖菌[包括空BL21（DE3）]，練習(xí)組裝SDS電泳模具上午第八天講解實(shí)驗(yàn)論文寫(xiě)作要求下午提重組表達(dá)載體質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，涂平板過(guò)夜上午第七天挑重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化克隆，搖菌過(guò)夜下午作感受態(tài)BL21(DE3)上午第六天搖BL21(DE3)下午“目的基因-表達(dá)載體”連接液轉(zhuǎn)化DH5a，涂平板過(guò)夜上午第五天回收目的基因片段，與表達(dá)載體連接過(guò)夜下午提重組T載體，EcoRI和BamHI雙酶切驗(yàn)證上午第四天挑重組T載體平板克隆，搖菌過(guò)夜下午上午第三天“目的基因-T載體”連接液轉(zhuǎn)化涂板，回收pET-Trx，下午作感受態(tài)DH5a，EcoRI和BamHI雙酶切并回收表達(dá)載體上午第二天PCR擴(kuò)增目的基因，然后與克隆載體連接過(guò)夜，倒平板，搖DH5a下午提質(zhì)粒（表達(dá)載體和目的基因模板質(zhì)粒）上午第一天講解儀器，發(fā)放移液器等，搖菌管和培養(yǎng)皿滅菌，搖表達(dá)載體和目的基因菌第零天下午5/8/202413基因工程大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒DNA的小量制備（1）提取目的基因載體（作PCR模板）pMD18-T-NK(full)pEGFP-N1pDsRed2-1（2）提取表達(dá)載體pET-Trx（備酶切）pET-TrxpGEX-4T15/8/202414基因工程大實(shí)驗(yàn)5/8/202415基因工程大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)二質(zhì)粒DNA電泳鑒定5/8/202416基因工程大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)三質(zhì)粒DNA的酶切37℃5/8/202417基因工程大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)四PCR擴(kuò)增制備目的基因ddwater32μl10×PCRbuffer（不含MgCl2）5μl25mMMgCl23μl2.5mmol/LdNTP4μl10μmol/LPrimer12μl10μmol/Lprimer22μl

模板質(zhì)粒1μl3U/μlTaq酶1μl（3u）總體積50μl1.PCR體系5/8/202418基因工程大實(shí)驗(yàn)2.PCR儀的循環(huán)程序設(shè)置：①94℃5min②94℃1min③60℃1min④72℃1min30s⑤goto②34cycles⑥72℃10min復(fù)性溫度比引物的Tm值低2-5℃。5/8/202419基因工程大實(shí)驗(yàn)3.PCR產(chǎn)物電泳5/8/202420基因工程大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)五從瓊脂糖凝膠中回收DNA片斷表達(dá)載體T載體目的基因EBEBnoEB表達(dá)載體BamHI+EcoRIT載體+目的基因BamHI+EcoRI5/8/202421基因工程大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)六目的基因片段與載體連接表達(dá)載體BamHI+EcoRI目的基因BamHI+EcoRI重組表達(dá)載體T4ligase，14℃目的基因（PCR產(chǎn)物）T載體重組克隆載體14℃5/8/202422基因工程大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)七感受態(tài)菌的制備DH5a和BL21（DE3）4℃5/8/202423基因工程大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)八細(xì)菌轉(zhuǎn)化42℃重組載體感受態(tài)菌37℃37℃5/8/202424基因工程大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)九轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定提取質(zhì)粒酶切37℃37℃5/8/202425基因工程大實(shí)驗(yàn)電泳鑒定結(jié)果載體目的基因PCR產(chǎn)物重組載體滯后BamHI+EcoRI5/8/202426基因工程大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)十外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)OD600IPTG5/8/202427基因工程大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)十一SDS檢測(cè)表達(dá)蛋白低分子量蛋白MarkerBL21(DE3)對(duì)照BL21(DE3)誘導(dǎo)4-8.重組表達(dá)載體誘導(dǎo)9.表達(dá)載體誘導(dǎo)20.1314366.297.41234567895/8/202428基因工程大實(shí)驗(yàn)樹(shù)立質(zhì)量法制觀念、提高全員質(zhì)量意識(shí)。2024/5/82024/5/8Wednesday,May8,2024人生得意須盡歡，莫使金樽空對(duì)月。2024/5/82024/5/82024/5/85/8/20249:23:45AM安全象只弓，不拉它就松，要想保安全，常把弓弦繃。2024/5/82024/5/82024/5/8May-2408-May-24加強(qiáng)交通建設(shè)管理，確保工程建設(shè)質(zhì)量。2024/5/82024/5/82024/5/8Wednesday,May8,2024安全在于心細(xì)，事故出在麻痹。2024/5/82024/5/82024/5/82024/5/85/8/2024踏實(shí)肯干，努力奮斗。2024年5月8日2024/5/82024/5/82024/5/8追求至善憑技術(shù)開(kāi)拓市場(chǎng)，憑管理增創(chuàng)效益，憑服務(wù)樹(shù)立形象。08五月20242024/5/82024/5/82024/5/8嚴(yán)格把控質(zhì)量關(guān)，讓生產(chǎn)更加有保障。五月242024/5/82024/5/82024/5/85/8/2024作業(yè)標(biāo)準(zhǔn)記得牢，駕輕就熟除煩惱。2024/5/82024/5/808May2024好的事情馬上就