新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件

實時熒光定量PCR技術(shù)

原理、應(yīng)用及實踐(RealtimeQuantitativePCR)RealtimeQuantitativePCR新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.15/8/2024主要內(nèi)容

Real-timeqPCR的定量原理2Real-timeqPCR的檢測方法3Real-timeqPCR的基本概念1Real-timeqPCR的解析方法4新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.25/8/2024PCR：基本原理Denaturation:94–96°CAnnealing:50–65°CExtension:70–75°C基本要素：

TemplatePrimersDNApolymerasedNTP,N=A,G,CorT新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.35/8/2024

PCR：基本原理理想的PCR反應(yīng)：

N=N0*2n實際的PCR反應(yīng)：

N=N0*(1+E)nN0：初始模板量N：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量n：擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)

E：擴增效率S形曲線，具有平臺效應(yīng)新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.45/8/2024

與普通PCR的對比同一個樣本進行96次重復(fù)傳統(tǒng)PCR檢測RealtimePCR檢測RealtimePCR--起點檢測：--起點量是樣本中起始的DNA量--“加入了500個拷貝”--具有重現(xiàn)性，誤差小傳統(tǒng)PCR--終點檢測：--終點產(chǎn)物量經(jīng)過PCR放大的DNA量--“生成了500，0000，0000個拷貝”--不恒定，誤差大傳統(tǒng)PCR檢測新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.55/8/2024Real-timeqPCR激發(fā)光發(fā)射光--在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團。--熒光基團在激發(fā)光的作用下，產(chǎn)生波長更長的發(fā)射光。--利用熒光信號的變化動態(tài)監(jiān)測整個反應(yīng)過程。

熒光基團新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.65/8/2024

擴增曲線（primarycurve）擴增曲線：隨著PCR反應(yīng)的進行，擴增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強度不斷增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一次熒光信號，通過熒光強度的變化監(jiān)測擴增產(chǎn)物量的變化，從而得到擴增曲線圖?？v坐標：Rn（熒光值）橫坐標：cyclenumber（循環(huán)數(shù)）線性圖對數(shù)圖新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.75/8/2024

熒光閾值（threshold）基線(baseline)：一般以PCR反應(yīng)前15個循環(huán)的熒光信號作為本底信號熒光閥值(threshold)：擴增曲線上人為設(shè)定的一個值--缺省設(shè)置：PCR反應(yīng)前3-15個循環(huán)熒光本底信號標準偏差的10倍--手動設(shè)置：大于樣本的熒光背景值新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.85/8/2024Ct

值(CycleThreshold)Ct值：PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時，熒光值所對應(yīng)的PCR循環(huán)次數(shù)。起始模板量基線閾值Ct值新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.95/8/2024

Ct

值(CycleThreshold)Ct值的特點：相同模板進行96次擴增，平臺期DNA拷貝數(shù)波動很大，但Ct值相對固定；Ct值則極具重現(xiàn)性新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.105/8/2024Ct值可以確定初始模板量？

Rn=RB+X0

(1+E)N*RS第n個循環(huán)的總信號=本底信號+起始DNA數(shù)目*PCR擴增效率*單位信號強度當循環(huán)次數(shù)n=Ct時RCt=RB+X0

(1+E)Ct*RS兩邊同時取對數(shù)得:lg(RCt-RB)=lgX0+Ctlg(1+E)+lgRSCt=-lgX0/lg(1+E)+lg(RCt-RB)-lgRS/lg(1+E)

Ct=-klgX0+blgX0與Ct值呈線性關(guān)系根據(jù)Ct值可以計算出樣本中起始模板所含有的拷貝數(shù)起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.115/8/2024Rnvs.Cyclenumber--擴增曲線LogDNAvs.Ct--標準曲線.未知10410310610510210標準曲線(standardcurve)標準曲線分析--對已知或未知樣本進行系列濃度梯度稀釋新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.125/8/2024y=-ax+b測定熒光定量PCR反應(yīng)的有效性--線性的標準曲線：相關(guān)系數(shù)R2--擴增效率：擴增效率(E)=10-1/斜率-1標準曲線分析新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.135/8/2024

熒光定量PCR檢測方法染料標記：

SYBRGreenI探針標記：水解探針：

TaqMan非水解探針：Molecularbeacon

新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.145/8/2024SYBRGreenI工作原理SYBRGreenI

是一種與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料。SYBRGreenI只與雙鏈DNA結(jié)合才能發(fā)出熒光。熒光信號與雙鏈DNA分子數(shù)成正比，隨著擴增產(chǎn)物增加而增加。熒光信號強度與反應(yīng)體系中所有雙鏈DNA分子成正比。新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.155/8/20245’3’5’3’SGSGSGSG5’3’5’3’SGSGSGSGEmissionExcitation--變性時，DNA雙鏈分開，無熒光信號。--延伸結(jié)束時，采集熒光信號。SYBRGreenI工作原理新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.165/8/2024SYBRGreenI優(yōu)點：

使用方便，成本低--僅需設(shè)計兩個引物通用性好--對DNA模板沒有選擇性需要在反應(yīng)結(jié)束時，對產(chǎn)物做融解曲線分析。缺點：SYBRGreen與所有雙鏈DNA結(jié)合--引物二聚體或錯誤擴增產(chǎn)物造成假陽性--只能檢測單一模板，無法進行多重檢測新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.175/8/2024將溫度對熒光強度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)

融解曲線(dissociationcurve)確認PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性對數(shù)圖譜原始圖譜新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.185/8/2024融解曲線分析--非特異性產(chǎn)物--引物二聚體新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.195/8/2024

Taqman

工作原理探針與靶序列配對（一段序列，兩個基團，5’

報告基團、3’淬滅基團）完整的探針，報告基團R發(fā)射的熒光被淬滅基團Q淬滅，沒有熒光產(chǎn)生。聚合酶的5’外切酶活性報告基團R與淬滅基團Q分離，發(fā)射熒光。RQReporterQuencherRQ熒光信號強度與結(jié)合探針的DNA分子成正比。新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.205/8/2024Taqman工作原理

在退火過程中，探針與靶序列結(jié)合探針被Taq酶的5’-3’外切酶活性剪切成片斷游離報告基團發(fā)出熒光在延伸過程中，探針部分與靶序列分離新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.215/8/2024

SYBRGreenI與Taqman對比Taqman特異性高--與特異靶序列結(jié)合對模板有選擇性--可進行多重PCR反應(yīng)

SYBRGreenI

使用方便，成本低--僅需設(shè)計兩個引物通用性好--對DNA模板沒有選擇性新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.225/8/2024

熒光定量PCR解析方法絕對定量

樣本中核酸的量（拷貝數(shù)、微克）--檢測某給定血液樣本中的病毒顆粒數(shù)，有6000個拷貝相對定量

不同樣本中目的基因表達量的差異--腫瘤組織和正常組織相比

某個基因的表達量mRNA改變了多少倍，改變了60倍新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.235/8/2024絕對定量的步驟

拷貝數(shù)計算對標準品進行梯度濃度稀釋熒光定量PCR反應(yīng)建立標準品未知樣品Ct代入標準曲線確定拷貝數(shù)質(zhì)粒提取OD值測定計算待測樣本濃度/樣本分子量/待測樣本拷貝數(shù)標準品進行5-6個梯度稀釋標準品稀釋倍數(shù)為10新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.245/8/2024絕對定量Sample--樣本起始濃度與Ct呈線性關(guān)系，根據(jù)已知拷貝的標準品作出標準曲線。--根據(jù)未知樣品的Ct值，推算出未知樣本量。以標準品為標桿新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.255/8/2024相對定量參照樣本Calibrator用于比較結(jié)果的基準。新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.265/8/2024相對定量特點選擇內(nèi)參基因內(nèi)參基因beta-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因housekeepinggene在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響較小--文獻檢索--實驗篩選內(nèi)參基因--同樣體積或重量的樣本所來源的細胞數(shù)目不同。--RNA抽提、反轉(zhuǎn)效率不同，操作中存在誤差。對樣本初始濃度差異進行均一化校正。新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.275/8/20242-ΔΔCt法成立條件：假設(shè)擴增效率為100%滿足條件：1）內(nèi)參基因和目標基因的擴增效率接近2）內(nèi)參基因和目標基因的擴增效率均為90%-110%假設(shè)條件：內(nèi)參基因和目標基因擴增效率差異大于5%1）優(yōu)化實驗條件，使擴增效率接近2）使用其他方法

相對定量方法新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.285/8/20242-ΔΔCt法

相對定量舉例新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.295/8/2024

相對定量分析

待測樣品目的基因濃度待測樣品內(nèi)參基因濃度

F=對照樣品目的基因濃度

對照樣品內(nèi)參基因濃度假設(shè)條件：內(nèi)參基因和目標基因擴增效率不同優(yōu)點：實驗優(yōu)化簡單缺點：每一輪實驗都必需做標準曲線

雙標準曲線法80%新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.305/8/2024

相對定量舉例

雙標準曲線法新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.315/8/2024

實驗流程新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.325/8/2024

SYBRGreen法實驗流程樣本處理RNA提取qPCR數(shù)據(jù)分析逆轉(zhuǎn)錄新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.335/8/2024樣本處理與RNA提取外界刺激

–10min

–可檢測的表達改變樣品離開定義環(huán)境–2min–裂解、固定細胞TRIzon（酚、異硫氰酸胍）

裂解液（氰酸胍，異硫氰酸胍，SDS）液氮RNA保存液小心DNA污染！使用DNase陰性對照新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.345/8/2024逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄引物選擇下游應(yīng)用：是否檢測其它基因？AbundantRNA的干擾：mRNAortotalRNA？檢測靈敏度是否足夠？新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.355/8/2024

RT-PCR一步法還是兩步法？兩步法:反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增分兩步進行。步驟多但靈活多樣。cDNA可長期保留檢測多個基因。便于反應(yīng)優(yōu)化。在工作的初期。一步法：反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增在同一管內(nèi)完成。

簡便、快捷但只做一個基因，一旦失敗難以查找原因。在工作的成熟階段。新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.365/8/2024熒光定量PCR體系Template

PrimersDNA聚合酶BufferanddNTPsDye新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.375/8/2024總原則與普通PCR相同：避免引物二聚體，避免二級結(jié)構(gòu)擴增片段長度（80-300bp)推薦做跨intron設(shè)計引物設(shè)計原則新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.385/8/2024Mastermix使用Mastermix有效降低系統(tǒng)誤差--熱啟動酶Hotstar化學(xué)修飾，低溫下酶活抑制性強，熱復(fù)活需10minFastHotstar抗體修飾，熱復(fù)活僅需幾十秒--Buffer反應(yīng)增強劑減少模板二級結(jié)構(gòu)影響控制Mg2+濃度穩(wěn)定劑--DyeRealSYBRGreenmixRealSupermix新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.395/8/2024Mastermix的優(yōu)化

新型熒光染料(SuperGreen)激發(fā)、發(fā)射波長與SYBRGreen近似對PCR反應(yīng)抑制更輕微可使用較高濃度(>1uM,SYBRgreen<0.3uM)更亮，靈敏度更高較短的鏈延長時間對小片段DNA和ssDNA結(jié)合更弱減少背景，有效信號更強與更強的信號協(xié)同，使溶解曲線峰更窄，適合于HRM分析化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定致突變性與毒性更弱SYBRGreenSuperGreen新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.405/8/2024MasterMixROXPassiveReference不參與、不干擾PCR反應(yīng)恒定發(fā)射熒光信號用于校正因信號檢測器到各孔間光路不同而導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差。有不同系統(tǒng)，需參照儀器要求選擇。新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.415/8/2024

誤差控制使用Mastermix配置預(yù)混體系設(shè)置生物學(xué)重復(fù)（不同個體）

技術(shù)性重復(fù)（復(fù)孔）陽性和陰性對照實驗環(huán)境控制試劑準備區(qū)核酸制備區(qū)反應(yīng)液制備區(qū)熒光定量PCR反應(yīng)區(qū)熒光定量PCR體系新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.425/8/2024數(shù)據(jù)分析融解曲線：單一特異性產(chǎn)物擴增曲線：--Ct值大小--各復(fù)孔之間重復(fù)性--不同濃度梯度稀釋的間隔性標準曲線：--R2＞0.980或∣

r∣

＞0.990--反應(yīng)效率盡可能高：90%-110%--目的基因的擴增效率接近內(nèi)參基因新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.435/8/2024操作注意事項為避免加樣誤差，保證重復(fù)性，配制預(yù)混體系配制反應(yīng)體系時，液體要緩慢加至管底，減少吹打低速離心，充分混勻，如有氣泡短暫離心不要直接在八連管上進行標記避光保存，試劑分裝避免反復(fù)凍融酒精擦拭移液器的吸頭設(shè)置反應(yīng)重復(fù)（至少二個）設(shè)置對照新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.445/8/2024案例分析總體原則偶然因素--操作原因?qū)嶒炛貜?fù)–

生物學(xué)重復(fù)、技術(shù)性重復(fù)機器因素–

儀器加樣孔結(jié)合擴增曲線、融解曲線、標準曲線分析單孔和多孔分析內(nèi)參基因和目的基因?qū)Ρ确治鲂掳鎸崟r熒光定量PCR技術(shù)原理課件.455/8/2024案例分析–擴增曲線曲線拐點清楚，特別是低濃度樣本指數(shù)期明顯。擴增曲線整體平行性好，基線平而無上揚現(xiàn)象。模板進行梯度稀釋時，各濃度間隔性好。

Ct15-35重復(fù)性

新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.465/8/2024擴增曲線--低濃度樣本沒有稀釋好--重復(fù)性差，加樣存在誤差案例分析–擴增曲線新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.475/8/2024案例分析–擴增曲線無信號或Ct值偏大內(nèi)參基因和目的基因均無信號--RNA降解內(nèi)參基因和目的基因均偏大--模板量低--對未知濃度的樣品應(yīng)從稀釋最高濃度做起內(nèi)參基因正常，而目的基因偏大或無信號

--引物設(shè)計--目的基因表達量低新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.485/8/2024案例分析Q．內(nèi)參基因與目的基因的Ct值之差在多大范圍內(nèi)可以接受？A：--在使用2-△△Ct法計算的前提是，公式成立的條件是內(nèi)參基因和目的基因的擴增效率相接近并且足夠高，在90%-110%之間，因此內(nèi)參基因與目的基因的差值是可以接受的。--內(nèi)參基因和目的基因的Ct值在15-35以內(nèi)，并且重復(fù)管之間的重復(fù)性很好，這樣的數(shù)據(jù)都是可以接受的。新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.495/8/2024案例分析–擴增曲線擴增曲線不平滑--樣本濃度太低--原始信號弱關(guān)閉ROX校正信號新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.505/8/2024案例分析–擴增曲線擴增曲線很早揚起--樣本濃度太高（稀釋樣品濃度）新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.515/8/2024案例分析–熔解曲線熔解曲線出現(xiàn)雙峰引物峰：--陰性對照（體系污染，配合擴增曲線）--降低引物濃度--重新設(shè)計引物非特異性擴增--基因組污染--非特異片段（重新設(shè)計引物）新版實時熒光定量PCR技術(shù)原理課件.525/8/2024案例分析–熔解曲線非正常熔解曲線--試劑污染