《抗體工程制藥》

抗體工程制藥5/9/20241《抗體工程制藥》抗體工程藥物的概念又稱抗體藥物、單克隆抗體治療劑、抗體治療劑。

通過細(xì)胞工程或基因工程方法制備，用于治療的單克隆抗體、抗體片段、基因工程改造的抗體，以及抗體免疫偶聯(lián)物或抗體融合蛋白,稱為抗體工程藥物。5/9/20242《抗體工程制藥》美國FDA已批準(zhǔn)的治療抗體藥物OrthocloneReoProRituxanZenapaxSimulectSynagisRemicadeHerceptinMylotargCampath-1HZevalin移植排斥心絞痛B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤移植排斥移植排斥嬰兒呼吸道合胞病毒類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎乳腺癌急性復(fù)發(fā)性髓性白血病難治性慢性淋巴細(xì)胞白血病難治性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤198619941997199719981998199819982000200120025/9/20243《抗體工程制藥》抗體藥物的重要地位。惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人們的生命健康，是導(dǎo)致人類死亡的重要因素。全球每年有700萬人死于腫瘤，且逐年增長。傳統(tǒng)的腫瘤臨床治療有三種：手術(shù)、放療和化療。近幾年里，以單克隆抗體為基礎(chǔ)的抗腫瘤導(dǎo)向治療藥物開發(fā)領(lǐng)域發(fā)生了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展。單克隆抗體藥物能特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞，能有效提高藥物殺傷力、減少毒副作用。1997年以來，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)10種單克隆抗體藥物，占有市場(chǎng)所有生物技術(shù)藥品的四分之一。一年的綜合銷售超過10億美金。

5/9/20244《抗體工程制藥》隨著生物技術(shù)的發(fā)展，單克隆抗體在疾病治療方面的作用越來越受到人們的重視。在同種異體免疫排斥、自身免疫反應(yīng)抑制、抗血小板治療、癌癥治療、感染性疾病治療等方面應(yīng)用最為廣泛。目前全球從事人源化單克隆抗體開發(fā)的企業(yè)260家左右，研究中的產(chǎn)品達(dá)700多個(gè)，其中進(jìn)入臨床階段的約100個(gè)，估計(jì)占研制中的生物技術(shù)藥物的25%。據(jù)美國制藥工業(yè)協(xié)會(huì)的調(diào)查報(bào)告顯示，單克隆抗體藥物居所有醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品之首。5/9/20245《抗體工程制藥》2000年底，在美國藥品市場(chǎng)上生物技術(shù)藥物有76種，其中抗體藥物有15種；正處于臨床研究階段的369種生物技術(shù)藥物中，抗體藥物有70種。

中國已有2個(gè)治療性單抗產(chǎn)品獲準(zhǔn)生產(chǎn)，3個(gè)治療性產(chǎn)品處在臨床試驗(yàn)階段，多個(gè)抗體藥物處于臨床前研究階段，已批準(zhǔn)的診斷性單抗有31個(gè)。5/9/20246《抗體工程制藥》抗體分子的應(yīng)用抗體分子是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用途最為廣泛的蛋白分子。以腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)性抗原、抗體獨(dú)特型決定簇、細(xì)胞因子及其受體、激素及一些癌基因產(chǎn)物等均作為靶分子，利用傳統(tǒng)的免疫方法或通過細(xì)胞工程、基因工程等技術(shù)制備的多克隆抗體、單克隆抗體、基因工程抗體廣泛應(yīng)用在疾病診斷、治療及科學(xué)研究等領(lǐng)域。完整鼠源抗體容易引起機(jī)體排異反應(yīng)，而基因工程抗體由于分子量小，通過改造可以降低鼠源性，所以是生物技術(shù)制藥領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。5/9/20247《抗體工程制藥》目前正在進(jìn)行開發(fā)和已經(jīng)投入市場(chǎng)的抗體性藥物主要有以下幾種用途：

1．器官移植排斥反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)；

2．腫瘤免疫診斷；

3．腫瘤免疫顯像；

4．腫瘤導(dǎo)向治療；

5．哮喘、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、急性心梗、膿毒癥、多發(fā)性硬化癥及其他自身免疫性疾?。?/p>

6．抗獨(dú)特型抗體作為分子瘤苗治療腫瘤；

7．多功能抗體（雙特異抗體、三特異抗體、抗體細(xì)胞因子融合蛋白、抗體酶等）的特殊用途。

5/9/20248《抗體工程制藥》根據(jù)美國藥物研究和生產(chǎn)者協(xié)會(huì)（PhRMA）的調(diào)查報(bào)告，癌癥是威脅人類健康的主要疾病之一，預(yù)防和治療癌癥是研究和開發(fā)抗體藥物的主要目標(biāo)之一。最初抗體主要被用于腫瘤體外免疫診斷和體內(nèi)免疫顯像，隨著抗體工程技術(shù)的不斷進(jìn)步，近年來人們將更多的目光集中在治療腫瘤的抗體藥物開發(fā)上。第一個(gè)被美國批準(zhǔn)用于人腫瘤治療的基因工程抗體－Rituxan（r）最初被用于非何杰金氏淋巴瘤，總有效率達(dá)60％，現(xiàn)在正在探索用于治療艾滋病相關(guān)淋巴瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤。

5/9/20249《抗體工程制藥》目前在臨床中使用的腫瘤治療藥物多數(shù)存在“敵我不分”的問題，即在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也破壞了人體正常細(xì)胞?！吧飳?dǎo)彈”為解決這個(gè)難題提供了一個(gè)理想的思路?！吧飳?dǎo)彈”，即將各種毒素、放射性同位素、化療藥物與識(shí)別腫瘤特異抗原或偶聯(lián)腫瘤相關(guān)的抗原后，能夠特異殺傷腫瘤細(xì)胞的一類藥物。這種藥物經(jīng)由靜脈注入人體內(nèi)，藥效分子集中作用于腫瘤細(xì)胞，既增強(qiáng)療效又減少對(duì)機(jī)體的毒副作用。放射性同位素與抗體的偶聯(lián)物在體內(nèi)能將前者運(yùn)至藥靶部位，并通過其放射性活性殺傷靶細(xì)胞，還可通過X射線照相機(jī)拍攝核素放射線圖像，用于體內(nèi)治療和定位診斷。5/9/202410《抗體工程制藥》抗體與化療藥物分子的偶聯(lián)方法一般采用化學(xué)法。這些偶聯(lián)物對(duì)結(jié)腸癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤、腎癌、卵巢癌、宮頸癌、乳癌、肺癌、骨肉瘤等有一定的抗癌效應(yīng)。抗體與生物毒素交聯(lián)制備的偶聯(lián)物稱為免疫毒素。免疫毒素抗體部分對(duì)相應(yīng)抗原有特異識(shí)別作用，及免疫毒素部分具有對(duì)細(xì)胞毒作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷效應(yīng)，是很有潛力的免疫治療方法。5/9/202411《抗體工程制藥》抗腫瘤血管生成抗體治療腫瘤的研究最近也取得了很大的進(jìn)展。在動(dòng)物模型中用抗血管生成因子、抗體封閉血管內(nèi)皮生長因子取得了抑制腫瘤生長作用；抗癌基因產(chǎn)物抗體Herceptin（r）作為生物技術(shù)藥品已經(jīng)在美國上市，配合化療用于乳腺癌和卵巢癌的治療，并獲得較好療效。5/9/202412《抗體工程制藥》1．單克隆抗體（McAb）抗體作為免疫治療的生物制劑，在臨床應(yīng)用已有一個(gè)世紀(jì)。以前抗體主要來自于經(jīng)抗原免疫的異種動(dòng)物（如馬）的血清。淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，可以大量制備針對(duì)任何抗原決定基的單克隆抗體。5/9/202413《抗體工程制藥》抗T細(xì)胞及其亞類的抗CD3、抗CD4、抗CD8單克隆抗體，它們?cè)谝浦才懦饧澳承┳陨砻庖卟〉膽?yīng)用中，已取得了明顯的療效。抗各種細(xì)胞表面分子的單克隆抗體，如抗IL-2受體的單克隆抗體，抗粘附分子的單克隆抗體都有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，在自身免疫病的治療，防止腫瘤轉(zhuǎn)移等方面都有重要的使用潛力。5/9/202414《抗體工程制藥》單克隆抗體的另一重要應(yīng)用是腫瘤診斷及分型。在過去10多年來，抗各種人腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體得到了廣泛的研究。針對(duì)各種人腫瘤細(xì)胞的單克隆抗體都能較特異地識(shí)別腫瘤細(xì)胞，而基本上不與正常組織起反應(yīng)?？鼓[瘤單克隆抗體在腫瘤的診斷及分型方面是一種有用的工具；但在腫瘤的治療上，由于大多抗腫瘤單克隆抗體不能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，所以單獨(dú)應(yīng)用腫瘤沒有明顯效果。5/9/202415《抗體工程制藥》2．導(dǎo)向藥物（targeteddrug）利用抗腫瘤單克隆抗體特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)，將它作為導(dǎo)向載體與各種殺傷分子，如毒素、抗癌藥物、放射性核素等，進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，可以構(gòu)建成一種對(duì)腫瘤細(xì)胞具有高度特異的強(qiáng)殺傷活性的雜交分子，稱為導(dǎo)向藥物。5/9/202416《抗體工程制藥》抗腫瘤單抗與毒素的交聯(lián)物又稱免疫毒素(IT)。用于制備IT的毒素主要有：①植物毒蛋白這類毒素主要有篦麻毒素（ricin）、相思子毒素（abrin）以及苦瓜毒素（mormordin）、商陸抗病毒蛋白（PAP）、天花粉蛋白等。它們都可以通過滅活核糖體，阻斷蛋白質(zhì)合成，殺傷靶細(xì)胞。。5/9/202417《抗體工程制藥》②細(xì)胞毒素主要有白喉外毒素（DT），綠膿桿菌外毒素（PE）等。它們主要通過抑制延長因子-2阻斷蛋白質(zhì)合成，殺死靶細(xì)胞。上述這些毒素都具有極強(qiáng)的毒性，1個(gè)分子的篦麻毒素進(jìn)入細(xì)胞，就足以殺死該細(xì)胞5/9/202418《抗體工程制藥》抗腫瘤單克隆抗體與抗癌藥物的交聯(lián)物，又稱免疫交聯(lián)物(immunoconjugate)。用以制備這類導(dǎo)向藥物的抗癌藥物主要有阿霉素（adriamycin）、氨甲蝶呤（MTX）等。它們主要通過阻斷DNA合成來殺死靶細(xì)胞。抗癌藥物殺細(xì)胞作用比毒素低得多，增加抗體分子攜帶的藥物分子數(shù)，可以增強(qiáng)其殺傷活性，但常會(huì)導(dǎo)致抗體活性的下降與喪失。這類導(dǎo)向藥物的優(yōu)點(diǎn)是分子較小，同時(shí)如有非特異殺傷不會(huì)有嚴(yán)重后果。缺點(diǎn)：殺傷力不高，臨床應(yīng)用前景不被看好。5/9/202419《抗體工程制藥》Ⅰ、放射性免疫交聯(lián)物可用于腫瘤的診斷。與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的放射性免疫交聯(lián)物放出的γ射線，可以用γ照像機(jī)攝像，獲得清晰的腫瘤顯像。此技術(shù)稱為放射免疫顯像。Ⅱ、放射性免疫交聯(lián)物也可用于腫瘤治療。標(biāo)記了大量高能核素的抗腫瘤單克隆抗體與腫瘤細(xì)胞結(jié)合后，可以通過輻射損傷殺死靶細(xì)胞及其周圍的腫瘤細(xì)胞。此技術(shù)又稱為放射免疫治療。用于與抗腫瘤單克隆抗體交聯(lián)的放射性核素主要有125Ⅰ、131Ⅰ、111In等。5/9/202420《抗體工程制藥》（四）腫瘤疫苗腫瘤疫苗與傳統(tǒng)疫苗在概念上不同，它主要不是用于腫瘤的預(yù)防，而是通過瘤苗的接種來刺激機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答來治療腫瘤。由于人腫瘤相關(guān)抗原的免疫原性很弱，不足以有效地刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答，因此單純用自身或同種腫瘤細(xì)胞作瘤苗治療腫瘤的效果不好。用腫瘤細(xì)胞卡介苗等佐劑聯(lián)合應(yīng)用，能提高免疫應(yīng)答效果，在一些晚期腫瘤患者取得了一定的治療效果。5/9/202421《抗體工程制藥》腫瘤疫苗主要有二類：第一類對(duì)腫瘤抗原表位性質(zhì)的研究，導(dǎo)致了腫瘤分子疫苗的產(chǎn)生。具有腫瘤抗原決定基的肽疫苗和多糖疫苗已在研制，有的已在臨床試用。第二類，確定了抗腫瘤免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞是TC細(xì)胞，導(dǎo)致了基因轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞疫苗的出現(xiàn)。5/9/202422《抗體工程制藥》TC細(xì)胞識(shí)別腫瘤表面的肽抗原（peptide）與MHCⅠ類分子的復(fù)合物，必需要有第二信號(hào)才能活化。這個(gè)第二信號(hào)可以由TC細(xì)胞表面的CD28分子與粘附分子B7的結(jié)合來提供。（B7分子主要存在于活化的B細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞表面。）在通常性況下，腫瘤細(xì)胞合成的胞內(nèi)抗原經(jīng)胞內(nèi)降解、處理后，形成的腫瘤肽抗原與MHCⅠ類分子結(jié)合復(fù)合物，共表達(dá)于瘤細(xì)胞表面。5/9/202423《抗體工程制藥》大多數(shù)腫瘤細(xì)胞由于沒有B7分子，因此腫瘤細(xì)胞雖具有肽抗原與MHCⅠ類分子的復(fù)合物，但由于不能提供第二信號(hào)，所以不能活化TC細(xì)胞。IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ等基因轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞本身可以分泌細(xì)胞因子，導(dǎo)致抗腫瘤免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，接種了工程化的腫瘤細(xì)胞后，原先已生長的親本野生型腫瘤細(xì)胞開始消退；并且以后再接種野生型的腫瘤細(xì)胞也不再生長，這說明工程化的腫瘤細(xì)胞具有典型的抗腫瘤疫苗效應(yīng)。有意義的是，用放射線將這種工程瘤苗殺傷死后，仍然可以獲得相同的抗腫瘤效果。5/9/202424《抗體工程制藥》免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說的提出

這一學(xué)說是Jerne（1972）根據(jù)現(xiàn)代免疫學(xué)對(duì)抗體分子獨(dú)特型的認(rèn)識(shí)而提出的。這一學(xué)說認(rèn)為在抗原刺激發(fā)生之前，機(jī)體處于一種相對(duì)的免疫穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)抗原進(jìn)入機(jī)體后打破了這種平衡，導(dǎo)致了特異抗體分子的產(chǎn)生，當(dāng)達(dá)到一定量時(shí)將引起抗Ig分子獨(dú)特型的免疫應(yīng)答，即抗體的產(chǎn)生。5/9/202425《抗體工程制藥》抗體分子在識(shí)別抗原的同時(shí)，也能被其他抗體分子所識(shí)別。在同一動(dòng)物體內(nèi)一組抗體分子上獨(dú)特型決定簇可被另一組抗獨(dú)特型抗體分子所識(shí)別。而一組淋巴細(xì)胞表面抗原受體分子亦可被另一組淋巴細(xì)胞表面抗獨(dú)特型抗體分子所識(shí)別。這樣在體內(nèi)就形成了淋巴細(xì)胞與抗體分子所組成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。網(wǎng)絡(luò)學(xué)說認(rèn)為：這種抗體的產(chǎn)生在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起著重要作用。使受抗原刺激增殖的克隆受到抑制，而不至于無休止地進(jìn)行增殖，藉以維持免疫應(yīng)答的穩(wěn)定平衡。

5/9/202426《抗體工程制藥》抗體藥物的特異性特異性與相關(guān)抗原的特異性結(jié)合對(duì)腫瘤等靶細(xì)胞的選擇性殺傷作用多樣性抗原的多樣性抗體結(jié)構(gòu)的多樣性抗體活性的多樣性免疫偶聯(lián)物的多樣性制備時(shí)的定向性針對(duì)特定的靶分子定向制備抗體藥物根據(jù)需要選擇抗體藥物的“效應(yīng)分子”5/9/202427《抗體工程制藥》單克隆抗體針對(duì)特定的單一抗原表位，具有高度的特異性，這是抗體藥物發(fā)揮治療作用的重要基礎(chǔ)。單克隆抗體技術(shù)由英國劍橋的科學(xué)家米爾斯坦（Milstein）和科勒（Kohler）于1975年首度研制。單抗作為治療劑的研究經(jīng)歷了比較曲折的發(fā)展過程，上個(gè)世紀(jì)80年代迅猛發(fā)展；90年代初期又一度處于低谷；近年再度成為生物技術(shù)藥物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。目前，單抗藥物的品種數(shù)量位居前列。5/9/202428《抗體工程制藥》單抗藥物具有下列重要特點(diǎn)：其一，特異性。單抗針對(duì)特定的單一抗原表位，具有高度的特異性，這是單抗藥物發(fā)揮治療作用的重要基礎(chǔ)。對(duì)于抗腫瘤抗體藥物的研究表明，其特異性主要表現(xiàn)為特異性結(jié)合、選擇性殺傷、體內(nèi)靶向性分布以及具有更強(qiáng)的療效。其二，多樣性。主要表現(xiàn)在抗原的多樣性、抗體結(jié)構(gòu)的多樣性，作用機(jī)理的多樣性等方面。5/9/202429《抗體工程制藥》其三，制備單抗藥物的定向性。單抗藥物的重要特點(diǎn)之一是可以定向制造。即根據(jù)需要，可以制備具有不同治療作用的單抗藥物。可以針對(duì)特定的靶分子，定向制備相應(yīng)的抗體；也可以根據(jù)需要選擇相應(yīng)的“效應(yīng)分子”，制備相應(yīng)的免疫偶聯(lián)物或融合蛋白。5/9/202430《抗體工程制藥》抗體工程的發(fā)展簡史多克隆抗體階段，早在1890年，培林(vonBehring)和北里(Kitasato)，就在實(shí)驗(yàn)室制造出抗白喉?xiàng)U菌外毒素的血清用于治療白喉。1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出均一性的單克隆抗體，叫細(xì)胞工程抗體。在80年代初，抗體基因結(jié)構(gòu)和功能的研究成果與重組DNA技術(shù)相結(jié)合，產(chǎn)生了基因工程抗體技術(shù)，1984年第一個(gè)基因工程抗體人－鼠嵌合抗體誕生。1994年，Winter等人的抗體庫技術(shù)：噬菌體抗體庫技術(shù)；核糖體展示抗體庫技術(shù)。5/9/202431《抗體工程制藥》抗體工程發(fā)展歷程抗體作為疾病預(yù)防、診斷和治療的制劑已有上百年的發(fā)展歷史。早期制備抗體的方法是將某種天然抗原經(jīng)各種途徑免疫動(dòng)物，成熟的B細(xì)胞克隆受到抗原刺激后，將抗體分泌到血清和體液中。實(shí)際上血清中的抗體是多種單克隆抗體的混合物，因此稱之為多克隆抗體。多克隆抗體是人類有目的利用抗體第一步。多克隆抗體的不均一性，限制了對(duì)抗體結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步研究和應(yīng)用。5/9/202432《抗體工程制藥》這種單克隆抗體多是由鼠B細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞分泌的，具有鼠源性，進(jìn)入人體會(huì)引起機(jī)體的排異反應(yīng)；完整抗體分子的分子量較大，在體內(nèi)穿透血管的能力較差；生產(chǎn)成本太高，不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出均一性的單克隆抗體。雜交瘤單克隆抗體又稱細(xì)胞工程抗體。雜交瘤技術(shù)的誕生被認(rèn)為是抗體工程發(fā)展的第一次質(zhì)的飛躍，也是現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的一個(gè)里程碑。

5/9/202433《抗體工程制藥》基因工程抗體的優(yōu)點(diǎn)：1．通過基因工程技術(shù)的改造，可以降低甚至消除人體對(duì)抗體的排斥反應(yīng)；

2．基因工程抗體的分子量較小，可以部分降低抗體的鼠源性，更有利于穿透血管壁，進(jìn)入病灶的核心部位；

3．根據(jù)治療的需要，制備新型抗體；

4．可以采用原核細(xì)胞、真核細(xì)胞和植物等多種表達(dá)方式，大量表達(dá)抗體分子，大大降低生產(chǎn)成本。

5/9/202434《抗體工程制藥》自從1984年第一個(gè)基因工程抗體人－鼠嵌合抗體誕生以來，新型基因工程抗體不斷出現(xiàn)。如人源化抗體、單價(jià)小分子抗體（Fab、單鏈抗體、單域抗體、超變區(qū)多肽等）、多價(jià)小分子抗體（雙鏈抗體，三鏈抗體，微型抗體）、某些特殊類型抗體（雙特異抗體、抗原化抗體、細(xì)胞內(nèi)抗體、催化抗體、免疫脂質(zhì)體）及抗體融合蛋白（免疫毒素、免疫粘連素）等。用于構(gòu)建基因工程抗體的抗體基因最初來源于雜交瘤細(xì)胞，因此同樣必須經(jīng)過動(dòng)物免疫，細(xì)胞融合及克隆篩選這樣一個(gè)長期、復(fù)雜的工藝流程；仍然不能制備針對(duì)稀有抗原的抗體和人源性抗體，無法改善抗體的親和力。5/9/202435《抗體工程制藥》這些缺點(diǎn)限制了基因工程抗體更為廣泛的應(yīng)用。噬菌體抗體庫是應(yīng)用最為普遍的抗體庫技術(shù)。采用噬菌體抗體庫技術(shù)篩選抗體不必進(jìn)行動(dòng)物免疫，易于制備稀有抗原的抗體、篩選全人源性抗體和高親和力抗體。5/9/202436《抗體工程制藥》噬菌體抗體庫技術(shù)是生命科學(xué)研究的突破性進(jìn)展之一，同時(shí)也將抗體工程的研究推想了一個(gè)新的高潮。在噬菌體抗體庫基礎(chǔ)上，近幾年又發(fā)展了核糖體展示抗體庫技術(shù)。利用核糖體展示技術(shù)篩選抗體的整個(gè)過程均在體外進(jìn)行，不經(jīng)過大腸桿菌轉(zhuǎn)化的步驟，因此可以構(gòu)建高容量、高質(zhì)量的抗體庫，更易于篩選高親和力抗體和采用體外進(jìn)化的方法對(duì)抗體性質(zhì)進(jìn)行改造。核糖體展示抗體庫技術(shù)代表了抗體工程的未來發(fā)展趨勢(shì)。

5/9/202437《抗體工程制藥》抗體5/9/202438《抗體工程制藥》抗體的概念定義一：抗原誘導(dǎo)由淋巴細(xì)胞合成和分泌的，具有特殊氨基酸序列和結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白分子(lg)。定義二：能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。5/9/202439《抗體工程制藥》人體中主要的抗體及性質(zhì)?2002byBruceAlberts,AlexanderJohnson,JulianLewis,MartinRaff,KeithRoberts,andPeterWalter.5/9/202440《抗體工程制藥》抗原

抗體由抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生，抗原是抗體藥物的靶分子?？贵w所針對(duì)的抗原可包括：半抗原。蛋白如糖蛋白或脂蛋白。多糖如脂多糖。人體疾病相關(guān)基因及其編碼的蛋白。各種病原體如病毒、支原體、細(xì)菌、原蟲、寄生蟲。5/9/202441《抗體工程制藥》抗體的主要作用結(jié)合抗原中和毒素促進(jìn)吞噬功能5/9/202442《抗體工程制藥》結(jié)合抗原和中和毒素?2002byBruceAlberts,AlexanderJohnson,JulianLewis,MartinRaff,KeithRoberts,andPeterWalter.5/9/202443《抗體工程制藥》促進(jìn)吞噬功能5/9/202444《抗體工程制藥》自然界中可作為抗原的物質(zhì)數(shù)不勝數(shù)，機(jī)體中可產(chǎn)生大量的抗體來對(duì)付各種抗原，每個(gè)漿細(xì)胞每秒鐘可分泌2000多個(gè)抗體，免疫蛋白占血漿總蛋白的20％，是血液中豐度最高的蛋白。5/9/202445《抗體工程制藥》抗體的結(jié)構(gòu)?2002byBruceAlberts,AlexanderJohnson,JulianLewis,MartinRaff,KeithRoberts,andPeterWalter.5/9/202446《抗體工程制藥》Lg分子是由二硫鍵連接起來的約4條（2對(duì)）多肽鏈構(gòu)成，長的一對(duì)稱為重鏈H，有450-570個(gè)Aa殘基，短的一對(duì)稱為輕鏈L，約有214個(gè)Aa殘基。5/9/202447《抗體工程制藥》抗體多樣性-抗體編碼基因較多SourcesfromMolecularCellBiology

9.MolecularStructureofGenesandChromosomes

9.4.FunctionalRearrangementsinChromosomalDNA輕鏈L編碼區(qū)由V、J和C區(qū)組成，其中V、J組成可變區(qū)5/9/202448《抗體工程制藥》抗體多樣性SourcesfromMolecularCellBiology

9.MolecularStructureofGenesandChromosomes

9.4.FunctionalRearrangementsinChromosomalDNA重鏈H編碼區(qū)由V、D、J和C區(qū)組成，其中V、D、J組成可變區(qū)5/9/202449《抗體工程制藥》抗體多樣性Lg分子氨基端L鏈1／2與H鏈的1／4區(qū)段的氨基端組成及排列順序多變，稱為可變區(qū)（V區(qū)）。Lg分子氨基端L鏈1／2與H鏈的3／4區(qū)段的氨基端組成及排列比較恒定，稱為恒定區(qū)（C區(qū)）?？勺儏^(qū)中互補(bǔ)決定區(qū)CDR

具有很大的變異性，而恒定區(qū)中FR

保守。FR1FR2FR3CDR1CDR2CDR3H2NCOOH5/9/202450《抗體工程制藥》抗體多樣性

SourcesfromMolecularBiologyoftheCell

V.CellsinTheirSocialContext

24.TheAdaptiveImmuneSystem

BCellsandAntibodies恒定區(qū)FR

保守恒定區(qū)5/9/202451《抗體工程制藥》抗體獨(dú)特性編碼重鏈和輕鏈的基因重排后，進(jìn)行表達(dá)生成細(xì)胞表面受體并能與抗原發(fā)生作用。只有這些Bcell表達(dá)的表面Lg與一個(gè)外源抗原結(jié)合后才會(huì)引發(fā)進(jìn)一步的反應(yīng)。在這些識(shí)別過程中將自身抗原識(shí)別掉排除。識(shí)別外源抗原的Bcell被誘導(dǎo)增殖并分泌抗體，在此過程中，可變的結(jié)構(gòu)域CDR的特定部位被誘導(dǎo)發(fā)生隨機(jī)突變，Bcell在反向于那些與抗原有高親和力的突變抗體的分泌。這個(gè)過程非常高效，使免疫系統(tǒng)具有產(chǎn)生對(duì)抗任何外來分子抗體的能力?？勺儏^(qū)這種獨(dú)特的裝配方式叫做抗體的獨(dú)特性。5/9/202452《抗體工程制藥》抗體多樣性體細(xì)胞突變，B細(xì)胞分化過程中點(diǎn)突變可反復(fù)進(jìn)行，使分化中的B細(xì)胞受抗原壓力選擇。體細(xì)胞內(nèi)重組?；蜣D(zhuǎn)換。核苷酸摻入。

5/9/202453《抗體工程制藥》

?2002byBruceAlberts,AlexanderJohnson,JulianLewis,MartinRaff,KeithRoberts,andPeterWalter抗體多樣性－其他機(jī)制5/9/202454《抗體工程制藥》雜交瘤技術(shù)和單克隆抗體5/9/202455《抗體工程制藥》單克隆抗體的概念雜交細(xì)胞：在誘導(dǎo)物的作用下同一細(xì)胞或不同細(xì)胞間的融合，融合的細(xì)胞具有雙親本細(xì)胞的染色體和全部或部分特性。雜交瘤細(xì)胞：B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后產(chǎn)生的雜交細(xì)胞。單克隆抗體：具有分泌抗體能力的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)無性繁殖形成的細(xì)胞系分泌產(chǎn)生的活性、親和力均相同的抗體。5/9/202456《抗體工程制藥》單克隆抗體的特點(diǎn)多克隆抗體的不足：假陽性、制備困難、產(chǎn)量低。單抗中抗體分子在Aa序列和空間構(gòu)型上均相同。單抗具有高度的特異性。產(chǎn)生單抗的細(xì)胞系可長期傳代并保存，可持續(xù)生產(chǎn)同一性質(zhì)的抗體。5/9/202457《抗體工程制藥》制備針對(duì)特異抗原的單克隆抗體制備抗原凡具有抗原性的物質(zhì)均可免疫時(shí)抗原純度可不高純度高的抗原利于以后篩選骨髓瘤細(xì)胞常用的骨髓瘤細(xì)胞系小鼠的BALB/c細(xì)胞系大鼠的Lou細(xì)胞系免疫動(dòng)物應(yīng)與骨髓瘤細(xì)胞供體相一致5/9/202458《抗體工程制藥》制備針對(duì)特異抗原的單克隆抗體一般選40-50%的PEG進(jìn)行誘導(dǎo)。細(xì)胞融合后培養(yǎng)液中有脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤、脾、瘤等細(xì)胞。常用的選擇性培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基。5/9/202459《抗體工程制藥》制備針對(duì)特異抗原的單克隆抗體將經(jīng)融合的混合細(xì)胞用HAT培養(yǎng)液懸浮稀釋。一般在含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中進(jìn)行。在融合后7d用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，7-14d用HT培養(yǎng)基培養(yǎng)，14d后用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。5/9/202460《抗體工程制藥》制備針對(duì)特異抗原的單克隆抗體選擇培養(yǎng)后，只有雜交瘤細(xì)胞才能生存。但不是所有的雜交瘤細(xì)胞均能產(chǎn)生所需的抗體。產(chǎn)生特定抗原的抗體的B細(xì)胞只占所有脾細(xì)胞的5％左右。用抗原對(duì)所有小孔的培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體檢測(cè)，篩出能產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤細(xì)胞。5/9/202461《抗體工程制藥》制備針對(duì)特異抗原的單克隆抗體將能產(chǎn)生目的抗體的培養(yǎng)小孔中的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行稀釋?？捎糜邢尴♂尫ê蛙洯傊āＳ行♂寱r(shí)，將細(xì)胞稀釋液分加到96孔板中，使每個(gè)小孔在理論上只有一個(gè)細(xì)胞。軟瓊脂法。5/9/202462《抗體工程制藥》制備針對(duì)特異抗原的單克隆抗體培養(yǎng)后，取上清進(jìn)行抗體檢測(cè)，獲得能產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。大量生產(chǎn)目的單克隆抗體。體外培養(yǎng)法，10μg/ml。動(dòng)物體內(nèi)誘生法，5-20mg/ml。5/9/202463《抗體工程制藥》小結(jié)1.用特定的抗原免疫動(dòng)物2.從脾中取出B淋巴細(xì)胞2.骨髓瘤細(xì)胞3.獲得雜交瘤細(xì)胞4.培養(yǎng)并篩選能產(chǎn)生抗體的單個(gè)雜交瘤細(xì)胞5.優(yōu)化培養(yǎng)目的雜交瘤細(xì)胞6.純化單克隆抗體5/9/202464《抗體工程制藥》單克隆抗體的不足目前單克隆抗體均是鼠源性抗體，應(yīng)用于人體內(nèi)可產(chǎn)生人抗鼠抗體（humanantimouseantibody,HAMA)人體的排斥反應(yīng)人體內(nèi)半衰期只有5-6小時(shí)到達(dá)靶組織的藥量僅有1％完整的抗體分子的相對(duì)分子量較大，穿透力不強(qiáng)，難以到達(dá)病灶的核心部位5/9/202465《抗體工程制藥》基因工程抗體5/9/202466《抗體工程制藥》基因工程改造抗體的目標(biāo)降低免疫原性。降低相對(duì)分子量，增加穿透力。5/9/202467《抗體工程制藥》人－鼠嵌合抗體(human-mousechimericantibody)在基因水平上將鼠源性單克隆抗體的可變區(qū)和人源性抗體恒定區(qū)連接起來，并在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)形成的抗體。5/9/202468《抗體工程制藥》人－鼠嵌合抗體鼠源性鼠源性人源性人源性5/9/202469《抗體工程制藥》人－鼠嵌合抗體構(gòu)建能產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤細(xì)胞系mRNAcDNA根據(jù)VL和VH基因兩端序列設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增VH基因VL基因連人Ig的CH基因連人Ig的CL基因等量混合后，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞SP2/0,篩選獲得共轉(zhuǎn)染細(xì)胞5/9/202470《抗體工程制藥》人－鼠嵌合抗體不足

雖然人－鼠嵌合抗體與鼠源性抗體相比，在一定程度上減弱了人抗鼠抗體反應(yīng)，但仍不能完全消除。5/9/202471《抗體工程制藥》抗體的CDR區(qū)

SourcesfromMolecularBiologyoftheCell

V.CellsinTheirSocialContext

24.TheAdaptiveImmuneSystem

BCellsandAntibodies框架區(qū)框架區(qū)CDR5/9/202472《抗體工程制藥》

改形抗體又叫CDR移植抗體。將鼠單抗的CDR移植到人Ig分子的骨架區(qū)中，換下其CDR序列而形成的抗體。改形抗體(reshapedantibody)5/9/202473《抗體工程制藥》具有鼠源性單克隆抗體的抗原結(jié)合特異性。抗體分子中鼠源部分只占很小的比例，可基本消除免疫原性。到目前，約有100種鼠單抗通過CDR移植獲得人源化的改形抗體，其中超過40種已進(jìn)行或正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。改形抗體的特點(diǎn)5/9/202474《抗體工程制藥》構(gòu)建改形抗體除較復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力外，最大的問題是人Ig分子的框架區(qū)中的一些氨基酸與鼠單抗的CDR區(qū)不協(xié)調(diào)，從而使改形抗體的親和力下降，甚至喪失活性。改形抗體的不足5/9/202475《抗體工程制藥》在人－鼠嵌合抗體的基礎(chǔ)上，將來自鼠單抗可變區(qū)中決定免疫原性的暴露于抗體表面的Aa，用相應(yīng)位置的人Ig的Aa代替而形成的抗體。鑲面抗體（resurfacingantibody）5/9/202476《抗體工程制藥》1991年，Padlan等分析了大量鼠單抗可變區(qū)Aa和人抗體可變區(qū)Aa的表面暴露情況，發(fā)現(xiàn)抗體表面所暴露的Aa位置和數(shù)量都很保守，不因種屬和型別而改變。抗體表面暴露的Aa是鼠源可變區(qū)免疫源性的主要來源。鑲面抗體的理論基礎(chǔ)5/9/202477《抗體工程制藥》FcFdFabFv小分子抗體5/9/202478《抗體工程制藥》Fab片段和重組Fab片段Fab片段由重鏈Fd段和完整輕鏈通過鏈間二硫鍵形成的異二聚體，整個(gè)分子約占整個(gè)抗體分子的1/3。如果Fab片段的恒定區(qū)為人源性的，則稱為重組Fab片段。S－SVLCLVHCH5/9/202479《抗體工程制藥》小分子抗體－抗體的片段化Fab:Fragmentationofantigenbinding胃蛋白酶木瓜蛋白酶5/9/202480《抗體工程制藥》Fv和單鏈抗體(single-chainFv,scFv)Fv片段由重鏈可變區(qū)VH段和輕鏈可變區(qū)VL通過非共價(jià)鍵結(jié)合在一起，是抗體中具有抗原結(jié)合活性的最小功能片段。scFv是指在DNA的水平上用一段長度合適的寡核苷酸序列將重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)連接起來，形成單一鏈的分子。VLVHVLVHVLVH5/9/202481《抗體工程制藥》雙體分子(diabody)

一條單鏈抗體分子上的VH和VL與另一條相同的單鏈抗體分子上的VL和VH分別配對(duì)形成的雙價(jià)抗體分子。VLVHVHVL5/9/202482《抗體工程制藥》單域抗體

比Fv更小的亞單位結(jié)構(gòu)組成的具有抗原結(jié)合活性的分子，重鏈可變區(qū)是典型的單域抗體，其具有較高的抗原結(jié)合活性。VH5/9/202483《抗體工程制藥》最小識(shí)別單位比單域抗體更小的分子，如CDR3仍能與抗原結(jié)合，只是其親和力相當(dāng)?shù)汀DR35/9/202484《抗體工程制藥》小分子抗體的優(yōu)點(diǎn)分子質(zhì)量小，免疫原性低。易于進(jìn)入實(shí)體瘤周圍的微循環(huán)甚至進(jìn)入實(shí)體瘤的內(nèi)部。無Fc片段，不易與具有Fc受體的非靶細(xì)胞結(jié)合，用于免疫診斷時(shí)成像清晰。構(gòu)建較簡單，易于操作和改造?？稍诩?xì)菌中表達(dá)，易于大量生產(chǎn)。可與多種效應(yīng)分子如毒素、前體藥物轉(zhuǎn)化酶等構(gòu)建多種雙功能抗體分子。5/9/202485《抗體工程制藥》小分子抗體的缺點(diǎn)多為單價(jià)抗體，與抗原結(jié)合活性相對(duì)較弱。半衰期短，能很快從血液中清除，從而可能影響治療的有效濃度。5/9/202486《抗體工程制藥》抗體庫技術(shù)(antibodylibrary)用基因克隆技術(shù)克隆全套抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)基因，然后重組到特定的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化特定的宿主細(xì)胞表達(dá)有功能的抗體分子，并通過親和篩選獲得特異性抗體可變區(qū)基因的技術(shù)。利用抗體庫技術(shù)篩選到的抗體可變區(qū)