GBZ-T 328-2023 放射工作人員職業(yè)健康檢查外周血淋巴細(xì)胞微核檢測方法與受照劑量估算標(biāo)準(zhǔn)

13.100CCS

C

60GBZ中華人民共和國家職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GBZ/T

328—2023代替

WS/T

187—1999放射工作人員職業(yè)健康檢查外周血淋巴細(xì)胞微核檢測方法與受照劑量估算標(biāo)準(zhǔn)Standard

the

of

exposure

dose

中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會 發(fā)

布GBZ/T

328—2023 前言

.............................................................................

II1

...........................................................................

12 規(guī)范性引用文件

.................................................................

13 術(shù)語和定義

.....................................................................

14

.........................................................

25 微核標(biāo)本制備

...................................................................

26

.......................................................................

27 檢測結(jié)果判斷

...................................................................

38 檢測報告與歸檔

.................................................................

39 -效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

........................................................

310 劑量估算

......................................................................

411 質(zhì)量控制

......................................................................

512

微核法估算劑量的原則........................................................

5附錄

A（規(guī)范性） 主要儀器設(shè)備和試劑配制...........................................

6附錄

B（資料性） 微核分析記錄表和微核檢測報告單...................................

7附錄

C（資料性） 放射事故受照人員生物劑量估算應(yīng)用示例.............................

9附錄

D（規(guī)范性） 正確使用本標(biāo)準(zhǔn)的說明............................................

10參考文獻(xiàn)

.........................................................................

11GBZ/T

328—2023 本標(biāo)準(zhǔn)代替WS/T

187—《淋巴細(xì)胞微核估算受照劑量方法》。與WS/T

187—1999相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動外，主要技術(shù)變化如下：a) 在范圍中增加了“放射工作人員職業(yè)健康檢查和受照劑量估算中，外周血淋巴細(xì)胞微核的標(biāo)本制備、微核檢測、結(jié)果評價、劑量估算方法和質(zhì)量控制?！边m用范圍增加了“放射工作人員職業(yè)健康檢查微核檢測”（見第

1

章）；b) 增加了規(guī)范性引用文件（見第

2

章）；c) 術(shù)語和定義中刪除了“生物劑量計”和“松胞素-B”（見

WS/T

187—1999

的

2.1

和

3.1、

和

3.6“微核”（見

187—1999

的

2.3）d) 刪除了“劑量-效應(yīng)曲線的建立方法”（見

WS/T

—1999

3

章）；e) 增加了“標(biāo)本采集與微量全血培養(yǎng)”“微核標(biāo)本制備”“微核分析”“檢測結(jié)果判斷”“檢測報告與歸檔”“劑量-

4

章～第11

章）；f) 更改了“

微核法估算受照劑量的原則”（見第

章，WS/T

—1999

4

章）；g) 更改了正確使用本標(biāo)準(zhǔn)的說明（見附錄

D，WS/T

—

的附錄

Ah) 增加了附錄

A

主要儀器設(shè)備和試劑配制（見附錄

A）；i) 增加了附錄

B

微核分析記錄表和微核檢測報告單（見附錄

Bj) 增加了附錄

C

放射事故受照人員生物劑量估算應(yīng)用示例（見附錄

C）；k) 增加了參考文獻(xiàn)。理。所、河南省職業(yè)病防治研究院、蘇州大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)于年首次發(fā)布為WS/T

187—1999，本次為第一次修訂。IIGBZ/T

328—20231 范圍核檢測、結(jié)果評價、劑量估算方法和質(zhì)量控制。本標(biāo)準(zhǔn)適用于放射工作人員職業(yè)健康檢查微核檢測和急性全身外照射受照人員的劑量估算。2 規(guī)范性引用文件標(biāo)準(zhǔn)。GBZ/T

248 放射工作人員職業(yè)健康檢查外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變檢測與評價3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1生物劑量估算

dose

estimation用具有穩(wěn)定劑量-效應(yīng)關(guān)系的分子或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化等生物學(xué)指標(biāo)定量估算受照射個體的輻射吸收劑量的方法。3.2微核 micronucleus由于基因組DNA損傷導(dǎo)致細(xì)胞分裂后期滯后的染色體斷片、一個或多個染色體不能隨有絲分裂進(jìn)入子細(xì)胞，而在細(xì)胞質(zhì)中形成直徑小于主核的三分之一且完全與主核分開的圓形或橢圓形小核。3.3常規(guī)培養(yǎng)微核法

micronucleus

method方法。3.4胞質(zhì)分裂阻斷微核法 cytokinesis-block

micronucleus

CB

微核法-B后經(jīng)低滲、固定、制片和染色，只計數(shù)和分析雙核淋巴細(xì)胞中微核的方法。3.5微核細(xì)胞 micronucleus

cellCB的雙核淋巴細(xì)胞。3.6微核率 micronucleus

1000CB1000個雙核淋巴細(xì)胞中含有的微核數(shù)。GBZ/T

328—20233.7劑量-效應(yīng)曲線 dose-effect

curve描述生物效應(yīng)依賴于劑量變化方式的曲線。4 標(biāo)本采集與微量全血培養(yǎng)4.1 主要儀器和試劑配制主要儀器和試劑配制參見附錄A。4.2 外周靜脈血采集采集靜脈血約2

mL18

℃～

h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。4.3 微量全血培養(yǎng)步驟4.3.1 將采集的靜脈血

0.3～mL

加入

4mL～5mL

含植物血凝素和

10%～20%胎牛血清的洛斯維帕克紀(jì)念研究所-1640（RPMI-164037

0.5

℃恒溫培養(yǎng)。4.3.2 如采用常規(guī)培養(yǎng)微核法，培養(yǎng)至

68

h～72

h

收獲細(xì)胞。4.3.3 如采用胞質(zhì)分裂阻斷微核法，培養(yǎng)至

40

h～

h，加入松胞素-B，使其終濃度為

6

μg/mL續(xù)培養(yǎng)至

h

收獲細(xì)胞。5 微核標(biāo)本制備5.1 低滲吸棄培養(yǎng)液上清，搖勻，每管加入4

mL

℃預(yù)溫的KCl低滲液（常規(guī)培養(yǎng)法低滲液濃度宜為mol/L，CB微核法低滲液濃度宜為0.1

），輕輕吹打均勻，立即加入新配制的固定液

～1

mL（甲醇：冰醋酸體積比3：1），混勻，移至10

mL～

mL離心管中，水平離心機(jī)離心8

min～10

心力為200

g～

g。5.2 固定棄上清，搖勻，加入4.5

固定液，固定20

～

min，水平離心機(jī)離心8

～10

min，離心力為200

g～

g。離心后可用固定液洗滌細(xì)胞，以減少細(xì)胞懸液中的雜質(zhì)。5.3 制片溫干燥。5.4 編號對每一張微核標(biāo)本玻片進(jìn)行編號，并做好記錄。5.5 染色用體積比為8%～10%的瑞氏-吉姆薩染液或吉姆薩染液染色8

min～10

，輕輕沖洗，室溫干燥。6 微核分析6.1 閱片GBZ/T

328—2023盲法閱片。按顯微鏡載物臺刻度坐標(biāo)，從右至左逐列或逐行對每張微核標(biāo)本玻片進(jìn)行掃描式閱片，CB少分析1000個轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞。6.2 雙核淋巴細(xì)胞的判定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)橋連接，核質(zhì)橋不超過核直徑的1/4，兩個細(xì)胞核重疊時，應(yīng)看到各自的完整核膜。雙核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)邊界或細(xì)胞膜應(yīng)完整，并與相鄰細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)邊界明顯區(qū)分。6.3 微核的判定標(biāo)準(zhǔn)微核應(yīng)游離于胞質(zhì)中，與主核完全分開，直徑為主核的1/16～，與主核不連接，不重疊（重疊淺。6.4 分析和記錄常規(guī)培養(yǎng)微核法觀察轉(zhuǎn)化的單核淋巴細(xì)胞，CB析記錄表中記錄顯微鏡坐標(biāo)，有條件的機(jī)構(gòu)可拍照，在微核分析記錄表中記錄圖片文件名，以備復(fù)核。微核分析記錄表樣式參見附錄B。7 檢測結(jié)果判斷7.1 常規(guī)培養(yǎng)法微核率的正常參考值范圍

0～6CB

法微核率的正常參考值范圍

0～30?。7.2 對檢測結(jié)果超出正常參考值范圍者，可檢查外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變。8 檢測報告與歸檔8.1 對每位受檢者應(yīng)出具外周血微核檢測報告單。檢測報告單樣式參見附錄

B。8.2 檢測的微核標(biāo)本應(yīng)保存兩年。微核記錄表等原始資料應(yīng)建檔長期保存，并建立電子檔案。9 劑量-效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立9.1 樣品要求2418歲～60史。抽取靜脈血6

mL～8

，注入肝素抗凝管。9.2 照射、培養(yǎng)和分析9.2.1 應(yīng)提供可靠的、明確的照射樣品的物理劑量。受照樣品應(yīng)與照射源保持一定的距離以達(dá)到均勻(如

X

射線、γ

)(低

輻射)的劑量-LET0.25

Gy～5.0

Gy0.3

～1.O

Gy/min

之間，選擇不少于

8

個劑量點(diǎn)，其中，0.25

Gy～

Gy

范圍內(nèi)刻度曲線的劑量點(diǎn)不少于

4個。劑量點(diǎn)可選擇

0.25

、0.5

Gy、0.75

Gy、1.0

Gy、2.0

Gy、3.0

Gy、

Gy

和

。對于高LET

輻射，劑量范圍選擇

～

，劑量點(diǎn)可選擇

Gy、0.1

Gy、

Gy、1.0

Gy、

、2.0

Gy、

和

。9.2.2 培養(yǎng)方法同本標(biāo)準(zhǔn)第

4

9.2.3 微核標(biāo)本制備、分析和記錄按照本標(biāo)準(zhǔn)第

5

6

章中所述方法進(jìn)行。9.2.4 按照公式（1）計算各劑量點(diǎn)應(yīng)分析的細(xì)胞數(shù)。??

(1)GBZ/T

??

(1)??

=

式中：n——應(yīng)分析的細(xì)胞數(shù)；p——微核率，可在計數(shù)分析一定數(shù)量的細(xì)胞后求得。9.3 劑量-效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合對X或γ射線誘導(dǎo)的微核與受照射劑量之間的劑量-照公式（2）或公式（3）進(jìn)行擬合。a)

一次方程模式y(tǒng)

=

??

+???????????????????????（2）式中：y——微核率，（?）；a——本底微核率；b——回歸系數(shù)；D——吸收劑量，單位為戈瑞（Gy）。b)

二次多項式模式y(tǒng)

=

??

+????

+????2????????????????（3）式中：y——微核率，（?）；a——本底微核率；b——回歸系數(shù)；D——吸收劑量，單位為戈瑞（Gy）；c——回歸系數(shù)。10 劑量估算10.1 微核標(biāo)本的制備所要估算劑量樣品的微核標(biāo)本制備方法均應(yīng)與建立劑量-效應(yīng)曲線的方法相同。10.2 微核率、微核率的不確定度的計算1000??

=

??×1000‰??

=

??×1000‰?????????????????（4）式中：p——微核率，（‰）；x——檢測到的微核數(shù)；n——分析的細(xì)胞數(shù)。

????(??)

??(??)

=

√

×1000‰????????????????（5）??式中：??(p)——微核率的不確定度，（‰）；p——微核率，（‰）；GBZ/T

328—2023n——分析的細(xì)胞數(shù)。10.3 微核率的置信限計算置信水平為95%時，微核率的置信限按照公式（6）計算：95%置信水平微核率的置信限

=

??

±1.96??(??)?????????????????（6）式中：p——微核率，（?）；??(??)——微核率的不確定度，（‰當(dāng)置信限下限<0時，覆蓋區(qū)間下限默認(rèn)為0。10.4 受照劑量的估算將所要估算劑量的標(biāo)本中得到的微核率及95%置信限的上下限代入建立的劑量-出受照劑量。放射事故受照人員生物劑量估算示例參見附錄C。11 質(zhì)量控制11.1 進(jìn)行微核標(biāo)本制備與分析的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有

2

細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)知識，熟練掌握顯微鏡下微核分析技術(shù)。每個微核需

2

名專業(yè)技術(shù)人員相互確認(rèn)。11.2 標(biāo)本應(yīng)有唯一性編號，標(biāo)本分析完畢后，應(yīng)置于玻片盒內(nèi)保存，并做好記錄。11.3 分析細(xì)胞數(shù)應(yīng)滿足本標(biāo)準(zhǔn)第

6.1

條的要求。11.4 正確使用本標(biāo)準(zhǔn)的說明參見附錄

D。12 CB

微核法估算劑量的原則12.1 事故后應(yīng)盡早取血，不宜超過

4

周。12.2 培養(yǎng)條件、制片方法和微核的判斷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)與建立劑量-效應(yīng)曲線時相同。對估算劑量的個體，至少應(yīng)分析

雙核淋巴細(xì)胞。12.3 應(yīng)選擇和事故條件接近的刻度曲線進(jìn)行劑量估算，在曲線劑量范圍內(nèi)應(yīng)用，不應(yīng)外推。12.4 估算劑量時，除給出平均值以外，同時給出劑量的

95%置信限。GBZ/T

328—2023

附 錄 A（規(guī)范性）主要儀器設(shè)備和試劑配制A.1 主要儀器設(shè)備A.1.1

超凈工作臺：用于細(xì)胞接種。A.1.2

恒溫培養(yǎng)箱：用于細(xì)胞培養(yǎng)。A.1.3

普通水平式離心機(jī)：用于細(xì)胞分離。A.1.4

光學(xué)顯微鏡：帶坐標(biāo)刻度，用于細(xì)胞觀察。A.1.5

冰箱：至少具備-20℃和4

℃條件，用于儲存實(shí)驗(yàn)用試劑。A.1.6

水浴鍋：用于細(xì)胞低滲。A.1.7

通風(fēng)櫥或通風(fēng)柜：用于實(shí)驗(yàn)中的排風(fēng)。A.2 主要試劑的配制A.2.1 RPMI-1640

248的規(guī)定。A.2.2 松胞素-B-B的分子式為C29H37NO5胞素-B2mg/mL，-20終濃度為6μg/mL。

6.6/136.5,1為坐標(biāo)值，“”為微核數(shù)

）。有圖像采集設(shè)備的機(jī)構(gòu)，可代之以圖片保存的文件名（命名格式：受檢者姓名001,1表B.1表B.1

微核分析記錄表（樣式）GBZ/T

328—2023

附 錄 B（資料性）微核分析記錄表和微核檢測報告單B.1 微核分析記錄表微核分析記錄表（樣式）見表。

GBZ/T

328—2023B.2 微核檢測報告單微核檢測報告單（樣式）見表。表B.2表B.2

微核檢測報告單（樣式）某人受

Co

γ射線一次全身照射，照后48h內(nèi)取血，采用微量全血法培養(yǎng)淋巴細(xì)胞,分析個雙核某人受

Co

γ射線一次全身照射，照后48h內(nèi)取血，采用微量全血法培養(yǎng)淋巴細(xì)胞,分析個雙核根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室所建立的

γ射線照射離體血建立的CB微核劑量-效應(yīng)曲線：

附 錄 C（資料性）放射事故受照人員生物劑量估算應(yīng)用示例淋巴細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)微核個，估算其生物劑量。每細(xì)胞微核數(shù)為0.6425×1000??，微核率的不確定度為√ /800×1000?=28.3微核率的置信限為?±1.96×28.3?，即698.060Y

=

17.9119+33.3838D+42.8809D2，該曲線的劑量范圍為

Gy～

Gy，劑量率為0.38

，Y為微核率（?），D為劑量（