體內(nèi)藥物分析-生物樣品與樣品制備課件

第一節(jié)生物樣品的種類、采集、制備與貯存

一、生物樣品的種類、采集和制備

第三章生物樣品與樣品制備1

體內(nèi)藥物分析采用的生物樣品包括各種體液和組織，常用的是血液（血漿、血清、全血）、尿液、唾液、頭發(fā)、臟器組織、乳汁、精液、腦脊液、淚液、膽汁、胃液、胰液、淋巴液、糞便等樣品。其中最常用的是血漿或血清，因為它們可以較好地體現(xiàn)藥物濃度和治療之間的關系。2（一）血液

1.血樣的采集

供測定的血樣應能代表整個血藥濃度，因而應待藥物在血液中分布均勻后取樣。

動物實驗時，可直接從動脈或心臟取血。

對于病人，通常采取靜脈血。

當血藥濃度高和分析方法靈敏時，也可從毛細管（手指、耳垂、腳趾）采少量血。

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測定血中藥物濃度，通常是指測定血漿或血清中的藥物濃度，而不是指含有血細胞的全血中的藥物濃度。

一般認為，當藥物在體內(nèi)達到穩(wěn)定狀態(tài)時，血漿中藥物濃度與藥物在作用點的濃度緊密相關，即血漿中的藥物濃度反映了藥物在體內(nèi)（靶器官）的狀況，因而血漿濃度可作為作用部位藥物濃度的可靠指標。4藥物動力學參數(shù)測定中常用的取樣次數(shù)見示意圖：

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（1）血漿(plasma)的制備：

血液置含有抗凝劑（如：肝素、草酸鹽等）的試管中，混合后，離心，分離血細胞，淡黃色上清液即為血漿。

肝素是一種含硫酸的粘多糖，常用其鈉鹽、鉀鹽，它能阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，從而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白。一般1ml的全血需加0.1—0.2mg的肝素。加入血樣后立即輕輕旋搖，但勿太猛烈，以免導致血細胞破裂。6(2)血清的制備

采集的靜脈血液置試管中，放置30min到1h，由于激活了一系列凝血因子，血中的纖維蛋白原形成纖維蛋白，血液逐漸凝固，離心后上層澄清的淡黃色液體即為血清。

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血漿比血清分離快，而且制取的量約為全血的50%～60%（血清只有30%～40%），多數(shù)研究者喜用血漿進行分析測定。若血漿中含有的抗凝劑對藥物的測定有影響，則應使用血清樣品。血漿只比血清多含一種纖維蛋白原，而血纖維蛋白幾乎不與藥物結(jié)合，因此兩者的藥物濃度是一樣的，且測定血藥濃度的方法也是通用的。注意：血漿或血清有溶血時可能會影響測定藥物不穩(wěn)定時，用血漿更好8（3）全血的制備

采集的血液置于

含有抗凝劑的試管中，輕輕混勻，不離心，防止凝血，保持血漿和血細胞混合在一起。

需要測全血中血藥濃度的情況：

測定平均分布于血細胞內(nèi)、外的血藥濃度

血漿藥物濃度波動大，且難以控制

血漿藥物濃度太低9（二）尿液

尿藥測定的目的與血液、唾液樣品不同，主要用于藥物劑量回收研究、藥物尿清除率、生物利用度的研究，并可推斷患者是否違反醫(yī)囑用藥，預測藥物的代謝過程及測定代謝類型

體內(nèi)藥物清除主要是通過尿液排出，藥物可以原型（母體藥物）或代謝物及其綴合物（conjugates）等形式排出。10尿液中藥物濃度較高，收集量可以很大；因?qū)儆诜菗p傷性采樣方式，收集方便。但由于易受食物種類、飲水多少、排汗情況等影響，并且在尿液排出過程中，不僅包括腎小球的濾過，還包括腎小管的重新吸收，因此，尿藥濃度變化較大，與血藥濃度的相關性很不理想。11

尿藥濃度變化大，應測定一定時間內(nèi)排入尿中藥物的總量。健康人排出的尿液是淡黃色或黃褐色，成人一日的排尿量為1-5L，尿液的密度為1.105—1.020，PH值在4.8—8.0之間。放置后會析出鹽類，并有細菌繁殖、固體成分的崩解，因而使尿液變渾濁。由于這些原因，必須加入適當?shù)姆栏瘎┍４妗?/p>

動物試驗中用代謝籠收集尿、糞，只能以時間段采集，有時會有收集不到的情況。12

尿樣

優(yōu)點：容易獲得，屬非損傷性取樣，且樣品量大；尿中藥物濃度高，含有綴合物或代謝物，是研究代謝物結(jié)構(gòu)的首選樣品；蛋白含量極低，不需去蛋白處理。缺點：與血藥濃度不相關，難以反映藥物作用過程；受腎功能、pH影響；難以定時定量取樣，易污染；所含成分復雜，已知其中有紫外吸收的化合物就達數(shù)十種。尿樣測定多用于藥物排泄、生物轉(zhuǎn)化研究。13（三）唾液

唾液是無損傷性采樣，易收集。一些藥物的唾液藥濃（S）與血漿游離藥濃(P)密切相關，因此，在TDM中可利用測定S代替P監(jiān)測；唾液樣品也可用于藥代動力學研究。14腮腺分泌水、淀粉酶舌下腺、頜下腺分泌粘液和漿液質(zhì)的混合液唾液分泌量1200ml蛋白含量為血漿的十分之一PH6.2-～7.4，變化大

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唾液的采集應盡可能在刺激少的安靜狀態(tài)下進行。一般在漱口后15min收集，至少采集10min。

采集混合唾液也可用物理或化學的方法刺激，在短時間內(nèi)得到大量的唾液。非刺激法條件下唾液直接流入容器內(nèi)，流速慢，僅約0.05mL/min。物理刺激法唾液分泌流速為1～3mL/min;

化學刺激法是用酸刺激味覺或者毛果蕓香堿刺激唾液分泌，流速可達5～10mL/min。

唾液的采集16

Crouch研究發(fā)現(xiàn)：采集方法對唾液中藥物濃度有顯著影響，實驗證明唾液中可待因的平均濃度在非刺激條件下比酸刺激條件下高3.6倍，比機械性刺激低50%，是商品化采集裝置的77%。

shellee的實驗證明：酸刺激組和非刺激組相比，非刺激組唾液與血液藥物濃度相關度(0.901)明顯高于酸刺激組(0.872)，說明酸刺激采集對唾液與血液藥物濃度相關性有不利影響。17

優(yōu)點：不受時間和地點的限制，可反復采集，采集時無痛苦、無感染危險；唾液成分比血液、尿液簡單，提取方便，有時可直接上樣測定；有些唾液中藥物濃度可以反映血漿中游離型藥物濃度。18缺點：

唾液是各腺體分泌的的混合液體，其組成發(fā)生經(jīng)時變動；因此，唾液中的藥物濃度與血漿中的游離型藥物濃度相比就容易變動；

唾液中藥物濃度與血漿中藥物濃度的比值(S/P)只有少數(shù)藥物是恒定值。

有些與蛋白結(jié)合率較高的藥物，藥物在唾液中的濃度比血漿濃度低得多，需要高靈敏度的分析方法才能檢測到

對有些患者（昏迷）不能采集唾液樣品。19

唾液在體內(nèi)藥物分析中的應用：唾液樣品比血液樣品易采集，樣品成分簡單，前處理方便。有的藥物在血液與唾液中的濃度密切相關，可以考慮用唾液代替血液作為藥物監(jiān)測的樣本。唾液與血液中藥物含量的相關性研究，可以為藥物的檢測和法醫(yī)學鑒定提供理論基礎林中等對四種抗癲癇藥物在唾液與血清中濃度的相關性進行了研究，結(jié)果顯示,四種藥物在唾液與血清中的濃度之間有較好的線性關系，其r分別為:卡馬西平0.9730；苯妥英鈉0.9556；苯巴比妥0.9620；丙戊酸鈉0.9286，可根據(jù)唾液藥物濃度來計算相應的血藥濃度值。20(四)組織在藥物動物試驗及臨床上由于過量服用藥物而引起的中毒死亡時，藥物在臟器中的分布情況可為藥物的吸收、分布、代謝、排泄等體內(nèi)過程提供重要信息。首先，將檢材均勻化，制成水基質(zhì)溶液，再用適當方法提?。?/p>

5.有機溶劑萃取法4.酶水解法3.酸水解或堿水解2.沉淀蛋白法1.勻漿化法21（五）頭發(fā)

頭發(fā)樣品具有廣譜性、積累性、穩(wěn)定性、依時性、相關性、指紋性毛發(fā)樣品取樣方便，無傷害，檢樣摻偽可能性低，能得到以往較長時間的用藥情況信息，可用于體內(nèi)微量元素的含量測定，但預處理復雜，分析對象含量低，需要精密儀器測定。毛發(fā)通過毛根的毛細血管供應營養(yǎng)，藥物、微量元素就是從這些毛細血管進入毛發(fā)中。

22濫用藥物、抗抑郁藥和抗精神病藥等藥物都有長期用藥的方式，由于藥物在頭發(fā)中的積累和儲存,為這些藥物的檢測提供了可能性。

尼古丁、卡馬西平、阿米替林、多慮平、安坦、氯丙嗪、泰爾登、三氟拉嗪、氯氮平和氟哌啶醇等精神藥物均能進入頭發(fā)，但進入頭發(fā)的難易程度是不一致的。藥物進入頭發(fā)的難易程度可能與藥物的分子量、極性和脂溶性有關。指甲與頭發(fā)類似23二、生物樣品的貯存與處理（一）冷藏或冷凍采樣后除立即分析外，為防止藥物發(fā)生變化，應：短期保存，可4℃冷藏長期保存，可―20℃冷凍，不要反復凍融。小技巧：按測定時需要的體積分裝一支！24（二）有時，還應考慮加入穩(wěn)定劑：酶抑制劑：一些酯類藥物，如普魯卡因、阿糖胞苷，易受血漿酯酶作用而發(fā)生水解，則應在采樣后立即加入酶抑制劑如氟化鈉等?？寡趸瘎阂恍┮籽趸乃幬?，可加入維生素C或其它抗氧化劑。如血漿中兒茶酚類藥物常規(guī)保存僅4周，若加入適量VC，則能保存10周。奧氮平很容易被空氣氧化，因此在樣品的儲存和提取時加入了25%的維生素C溶液10ul作為抗氧劑25第二節(jié)生物樣品的預處理與制備

進行體內(nèi)藥物分析時，除了極少數(shù)情況下只需將樣品進行簡單處理就可以直接測定外，都要采取分離、凈化、濃縮、化學衍生化等預處理技術，為測定創(chuàng)造良好的條件。樣品預處理是體內(nèi)藥物分析中極為重要的環(huán)節(jié)，也是分析中最困難、最繁復的工作。由于藥物在體內(nèi)存在形式不同、待測藥物濃度低、生物介質(zhì)組份繁雜、待測藥物類型眾多、理化性質(zhì)各異等原因，對生物樣品的預處理很難規(guī)定固定的程序和模式，而必須結(jié)合實際情況，采取適當?shù)姆蛛x、凈化、濃集、化學衍生化等技術。2660%以上工作和費用用在樣品前處理上27（一）將藥物從綴合物（尿）或結(jié)合物中釋放出來，以測定藥物的總濃度（二）將微量藥物從復雜的介質(zhì)中純化、富集出（三）為適應和符合分析方法所要求的專屬性、靈敏度等。（四）防止分析儀器的污染，提高測定靈敏度、準確度、精密度和選擇性等一、生物樣品預處理的目的28二、樣品制備時應考慮的問題預處理時要考慮以下問題：1.被測組分的理化性質(zhì)、存在形式、濃度范圍2.測定目的3.生物樣品種類和基質(zhì)干擾類型4.樣品的化學組成5.藥物的蛋白結(jié)合率6.被測組分在預處理過程中的穩(wěn)定性7.樣品在收集、儲存和預處理過程中的容器污染8.預處理過程盡量簡單、盡可能高的精密度和準確度9.預處理的最后一步應使被測組分富集10.選用的分析方法是否具有專屬性、是否滿足靈敏度要求29（一）藥物的理化性質(zhì)和存在形式（二）待測藥物的濃度范圍（三）藥物測定的目的（四）選用的生物樣品類型（五）樣品預處理與分析技術的關系二、樣品制備時應考慮的問題其中5個重點問題：30（一）經(jīng)有機破壞的方法1.濕法破壞硝酸-高氯酸法；電熱消化器法；電熱板消化法；烘箱消化法。2.干法破壞高溫電阻爐灰化法；低溫等離子灰化法3.氧瓶燃燒法三、生物樣品的預處理技術以上方法將有機物破壞，只能進行元素分析31（二）去除蛋白質(zhì)

目的：

去除蛋白質(zhì)可使結(jié)合型的藥物釋放出來，以便測定藥物的總濃度；去除蛋白質(zhì)也可預防提取過程中蛋白質(zhì)發(fā)泡，減少乳化的形成，以及可以保護儀器性能，延長使用期限32去除蛋白質(zhì)有以下幾種方法1.溶劑解法---加入與水相混溶的有機溶劑操作簡單，快速，精密度好常用，特別在LC-MS法中√乙腈∶血漿=1.5∶1，99.4%蛋白沉淀，顆粒大，易離心除去甲醇∶血漿=3.0∶1，98.9%蛋白沉淀，顆粒小，不易離心除去2.加入中性鹽常用飽和硫酸銨、硫酸鈉333.加入強酸10%三氯醋酸、6%高氯酸4.加入含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑5.超濾法蛋白質(zhì)大分子不能通過半透膜游離藥物6.酶水解法枯草桿菌酶，貴，時間長少用7.加熱法少用疑問：2、4法中的鹽使溶液的極性更強，藥物會游離出？在色譜法中，高濃度的鹽會析出，把柱子堵了34以上去除蛋白質(zhì)法僅去除了蛋白質(zhì)（只起到保護色譜柱的作用），但內(nèi)源性的雜質(zhì)都在，樣品濃度還被稀釋?；旧喜荒苡霉庾V法測定。若用色譜法分離，干擾嚴重，就得花更多的精力才能分離好。對色譜法來說，它不是好方法35（三）分離、純化與濃集

有差別才有可能分離！生物樣品含有大量可影響測定的內(nèi)源性雜質(zhì)，加上服用的藥物、代謝物、同時服用的其他藥物，組成一個極其復雜的混合物。如何將微量的藥物從如此復雜的混合物中分離出來？361.液-液萃取法（LLE）原理：多數(shù)藥物是親脂性的，在適當?shù)挠袡C溶劑中的溶解度大于在水相中的溶解度，而生物樣品中的大多數(shù)內(nèi)源性雜質(zhì)是強極性的水溶性物質(zhì)（差別）。因而用有機溶劑萃取一次即可除去大部分雜質(zhì)，從大量的樣品中提取藥物經(jīng)濃集后測定。37采用LLE要考慮的幾個問題（1）溶劑的選擇與純度要求純度AR以上①了解藥物與溶劑的化學結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，按相似相溶原則選用②對藥物的未電離分子可溶，而對電離形式的分子不溶（光譜分析法）③沸點低、易揮發(fā)、濃集④與水不相混溶⑤無毒，不易燃燒⑥不易形成乳化（氯仿易乳化，毒性大）⑦具有較高的化學穩(wěn)定性和惰性⑧不影響紫外測定表3-6毒性大的盡量不用38（3）水相的PH值

主要由藥物的pKa決定！當pH與pKa相當時，50%藥物以非電離形式存在。對于堿性藥物，最佳pH值要高于pKa1-2單位；對于酸性藥物來說，則要低于pKa值1-2單位。這樣就可使90%的藥物以非電離的形式存在從而更易溶于有機溶劑中！（丙戊酸的pKa4.95）

但生物樣品一般多在堿性下提取。因為多數(shù)藥物是親脂性的堿性物質(zhì)，而生物樣品中內(nèi)源性物質(zhì)多是酸性的，在堿性下用有機溶劑提取時內(nèi)源性雜質(zhì)不會被提取出來（2）有機溶劑相和水相的體積比1∶1或2∶1由實際情況決定，文獻中有的10∶1以上39由于血藥濃度較低，提取時需濃集傳統(tǒng)的濃集方法主要有兩種：一種是在末次提取時加入的提取液盡量少，使被測組分提取到小體積溶劑中，然后直接吸出適量供測定。另一種是揮去提取溶劑后，再用少量適合的溶劑溶解后測定。40補充幾點科研中的心得（1）乳化問題（2）在水相中加入中性鹽，提高萃取效率（3）在有機相中加入另一種改性的有機溶劑，提高萃取效果（4）使用EP管作為提取容器41

衡量提取方法優(yōu)劣的一個重要指標就是提取回收率，它是指藥物從生物樣品中被分離出來用于測定的比例，一般應高于60%中科院上海藥物藥檢所藥物代謝中心李川博士說“乙酸乙酯、叔丁基甲基醚可用于80%藥物的萃取”42液-液回提（多次提?。?/p>

對于堿、酸性藥物，在有機溶劑初次提取后，調(diào)節(jié)適當?shù)膒H值，使藥物變成離子型，用水把藥物回提（反提?。╞ackextraction）到水相：然后調(diào)節(jié)水相pH，使藥物變成分子型，再用有機溶劑萃取水相中的藥物。一些酸、堿性雜質(zhì)，可用此法除去。

光譜法測定時，常采用此法凈化樣品。但多次提取，得率低43

離子對提取

一些電離性較強（調(diào)PH沒用）的藥物在水溶液中主要以電離形式存在，很難被提取，此時，若加適當?shù)姆措x子（counterion）與其形成離子對（大分子復合物），則成為一種偽中性分子，能從水相進入有機相中，就可用萃取法提取。常用的反離子有：季銨鹽R4N+（陽離子）；苦味酸C6H3（NO2）3O-有機磺酸鹽CH3--SO3-（陰離子）；常用的提取溶劑為鹵代烴類，如CH2Cl244文獻上常提到的LLE的缺點傳統(tǒng)萃取方式回收率低、樣品用量大、繁瑣費時、溶劑用量大、溶劑毒性大、易乳化、不能自動化操作45試驗設計：現(xiàn)有1.9mL空白血漿，為篩選9種有機溶劑中哪一種對某藥物的萃取效果最好，該如何將藥物標準溶液加入血漿中？畫示意圖即可。（9支EP管，每管0.19mL血漿及10μL藥物標準溶液）小測試462.固相萃取法固相萃取(SolidPhaseExtraction，簡稱SPE)是從八十年代中期開始發(fā)展起來的一項樣品前處理技術。由液固萃取和液相色譜技術相結(jié)合發(fā)展而來。主要通過固相填料對樣品組分的選擇性吸咐及解吸過程，實現(xiàn)對樣品的分離，純化和富集。主要目的在于降低樣品基質(zhì)干擾，提高檢測靈敏度。47固相萃取的基本原理和方法：

SPE技術基于液-固相色譜理論，采用選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對樣品進行富集、分離、純化，是一種包括液相和固相的物理萃取過程；也可以將其近似地看作一種簡單的色譜過程。較常用的方法是使液體樣品通過一吸附劑，保留其中被測物質(zhì)，再選用適當強度溶劑沖去雜質(zhì)，然后用少量良溶劑洗脫被測物質(zhì)，從而達到快速分離凈化與濃縮的目的。也可選擇性吸附干擾雜質(zhì)，而讓被測物質(zhì)流出。差別48關于固相萃取小柱：a.常見的固相萃取柱分為三部分：醫(yī)用聚丙烯柱管，多孔聚丙烯篩板(20μm)和填料(多為40-60μm，80-100μm)。b.常用規(guī)格：100mg/1ml，200mg/3ml，500mg/3ml，1g/6ml等。以100mg/1ml為例：其中100mg為填料的質(zhì)量，1ml是空柱管的體積。c.一次性使用：為避免交叉污染，保證檢測可靠性，SPE柱通常是一次性使用的。49SPE填料吸附型:活性炭，硅膠，硅藻土，硅酸鎂，氧化鋁等。化學鍵合相硅膠，正相：氨基，腈基，二醇基等；反相：C1，C2，C6，C8，C18，腈基，環(huán)己基，苯基離子交換：季胺，氨基，二氨基，苯磺酸基，羧基等。聚合物：苯乙烯-二乙烯苯共聚物XAD-2及PRP-1等；乙烯吡咯烷酮和二乙烯萃共聚得到的高分子聚合物。相對于鍵合相填料，聚合物具有高純度，高比表面的特點。因而具有比硅膠基質(zhì)更強的吸附性，適用于全部pH范圍，因而用途更廣50固相萃取操作一般有五步：活化——甲醇潤濕小柱，活化填料，除去雜質(zhì)并創(chuàng)造一定的溶劑環(huán)境。平衡——水或適當緩沖液沖洗小柱，保持濕潤？上樣——將樣品用一定的溶劑溶解，轉(zhuǎn)移入柱并使組分保留在柱上。棄去廢液淋洗——水或緩沖液最大程度除去干擾物。洗脫——用小體積的溶劑將被測物質(zhì)洗脫下來并收集。親脂性鍵合相硅膠SPE柱的實驗步驟：5152WATERS公司的OasisHLB柱（聚合物基質(zhì)）53離子交換樹脂對弱酸性的藥物，可在中性或堿性的條件下用陰離子交換樹脂提取，用水及有機溶劑清洗后用酸性的溶液洗脫；堿性藥物則相反。離子交換法萃取的回收率?？蛇_90%以上，而且有較好地選擇性，但較麻煩，費時。54親水型填料用作SPE的親水型填料有硅藻土、硅膠、棉纖維等，其原理為分配作用。填料為支持物，水基質(zhì)中極性強的成分與填料結(jié)合牢固，流動相為與水不相混溶的有機溶劑，較親脂的藥物易分布于流動相，從而達到萃取的目的。親水型填料SPE有較高的萃取回收率（大于80%），但洗脫劑用量較大（一般大于5ml），無濃集作用，萃取液較干凈。55固相萃取裝置真空SPE裝置(SPEVacuumManifolds)組成：有機玻璃缸體，真空壓力表，真空泵，真空緩沖瓶，收集管架，小柱連接頭12孔6500元24孔11000元5696孔板96孔板是高通量的SPE產(chǎn)品，每孔含少量吸附劑(10-100mg),樣品載量約2ml/孔

主要用于生物，醫(yī)藥等行業(yè)小量的多樣品的凈化處理。且多與自動化的樣品處理處理裝置連用(如Tomtec液體處理工作站)。其基本原理和使用方法與SPE柱相似。96孔板57SPE優(yōu)點：1、不發(fā)生乳化；2、適應的極性范圍較廣；3、提取效率高；4、方便快速；5、溶劑用量少；6、易于自動化；7、室溫下操作，尤其適于處理揮發(fā)性及對熱不穩(wěn)定的藥物。目前，商品化固相提取小柱（cartridge）的應用已比較普遍。最大的缺點：貴20多元/支58三種方法的優(yōu)缺點比較59以液-液萃取去除內(nèi)源性雜質(zhì)的效率最高，固相萃取次之，蛋白沉淀最差。但蛋白沉淀（用有機溶劑）由于操作步驟少，樣品處理快，數(shù)據(jù)精密度高，在有液質(zhì)的高靈敏度、高選擇性作保證的前提下，該種方法使用最多（LC-MS/MS）。魏敏吉（北大附屬第一醫(yī)院臨床藥理研究所）綜述另外，在所查的24篇抗癲癇藥物的HPLC分析中，溶劑萃取法22篇，蛋白沉淀法2篇，無SPE法！60OasisHLB固相萃取柱王朝虹，公安部物證鑒定中心乙酸乙酯萃取高效液相色譜法測定血漿中雷公藤內(nèi)酯醇內(nèi)源性雜質(zhì)都有固相萃取與液-液萃取的比較613.自動化SPE技術自動化固相萃取裝置了解400樣品/小時沒實際意義臨床藥學測定的品種多儀器昂貴624.固相微萃取法類似于氣相色譜微量進樣器的萃取裝置熔融石英纖維上面涂有有機聚合物(如聚二甲基硅氧烷，PDMS)SPME集萃取、濃縮、進樣于一身，極大地提高了分析速度。萃取模式可分為直接固相微萃取和頂空固相微萃取了解63用固相微萃取一氣相色譜聯(lián)用分離、分析尿中痕量毒鼠強。方法的線性范圍為10一500ng/ml，最低檢出濃度<10ng/ml，RSD<10%。用該法監(jiān)測了1例毒鼠強中毒幼兒尿中毒鼠強含量，在中毒后3個月內(nèi)仍從尿中檢出毒鼠強成分，適用于臨床和法庭毒物分析。案例：645.膜萃取徽粒填料薄膜(Particle-loadedmembrane)固定相填料有C8、C18鍵合硅膠、SDB、離子交換劑、碳微粒等；薄膜介質(zhì)為多孔網(wǎng)狀聚四氟乙烯(PLFE)、聚氯乙烯等高分子材料或玻璃纖維。PLM截面積較大，厚度小，壓差小，樣品流速可達同類型填料柱型SPE10倍左右，而且在高流速條件下不會像柱型SPE一樣造成回收率下降。這主要由于PLM填料粒較小，多為8μm，且填料緊密而均勻，穩(wěn)固不易產(chǎn)生縫隙，每0.5mm薄膜可提供4一9理論塔板數(shù)；而SPE柱填料粒徑多為40μm，每厘米只能提供5一15理論塔板數(shù)。了解656.微透析技術（Microdialysis）

微透析技術實質(zhì)上是一種膜分離技術，是一種利用膜透析原理，微量地對細胞液進行流動性連續(xù)采樣的新型采樣和色譜樣品制備技術。

由于微透析針很細，可在基本不干擾生物體內(nèi)正常生命過程的情況下，直接插到生物活體內(nèi)采樣進行在體(invivo)、實時(realtime)和在線(online)的取樣和檢測，用來研究生物體在活動時體液組成的變化。66（1）原理

微透析的取樣裝置主要由注射泵、微透析探針、連接管和收集器組成。將微透析探針埋植于需要取樣的部位，用與細胞間液非常接近的生理溶液以慢速（0.5-5μl/min）灌注探針，由于半透膜的存在，與蛋白相結(jié)合的藥物及其他大分子物質(zhì)不能通過半透膜而被排斥在探針外，只有游離的小分子物質(zhì)(如游離態(tài)藥物)會經(jīng)半透膜彌散進入灌流液而被連續(xù)不斷地帶出，儲于樣品收集器中，達到在體取樣的目的。67微透析取樣系統(tǒng)的組成(A)及探針取樣的局部放大圖(B)68（2）微透析技術的特點(1)時間分辨性----可連續(xù)跟蹤體內(nèi)多種化合物濃度隨時間的動態(tài)變化，可使藥代動力學資料更準確；(2)空間分辨性-----取樣無需勻漿過程，可真實代表取樣位點目標化合物的濃度。同時，可以對同一動物進行多個部位取樣，研究目標化合物的體內(nèi)分布；(3)樣品純凈，不含蛋白質(zhì)、酶等大分子物質(zhì)，可不經(jīng)預處理，與多種分析儀器聯(lián)用，實現(xiàn)在線持續(xù)分析；69(4)直接測定游離藥物濃度，與血液取樣技術相比，游離藥物濃度與其藥理或毒理作用的相關性更大；(5)可在清醒、自由活動的動物個體上取樣，在接近正常生理條件下得到實驗結(jié)果，更有科學性和實際意義；(6)能夠避免傳統(tǒng)血液取樣后由于體液容量減少而引起的藥物PK．PD行為的改變，能夠?qū)崿F(xiàn)對組織長時間持續(xù)取樣而不造成體液損失；(7)組織損傷小，不破壞機體完整性。707.超臨界流體萃取SFE超臨界流體：處于臨界溫度和臨界壓力以上，介于氣體和液體之間的流體。超臨界流體同時具有氣體和液體的雙重特點影響SFE的因素有：溫度、壓力、提攜劑、提取時間等缺點：特殊的實驗設備、使用高純的超臨界流體。了解71尿中藥物多數(shù)呈綴合狀態(tài)。

含羥基、羧基、氨基和巰基的藥物，可與內(nèi)源性物質(zhì)葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷綴合物；

含酚羥基、芳胺及醇類藥物與內(nèi)源性物質(zhì)硫酸形成硫酸酯綴合物。

由于綴合物較原型藥物具有較大的極性，不易被有機溶劑提取，常用酸水解或酶水解的方法。（四）綴合物的水解

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3）溶劑解：綴合物（主要是硫酸酯）往往可通過加入的溶劑在萃取過程中被分解。2）酶水解：葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶，也可用二者的混和物。一般在pH4.5-7，37℃數(shù)小時，條件溫和，選擇性強，但費用較高。1）酸水解：0.1NHCl，100℃，30min，條件較劇烈，易致藥物分解，空白值也高。為測定尿液中藥物總量，要將綴合物水解：73

值得注意的是，目前對綴合物的分析，逐漸趨向于直接測定綴合物的含量，以獲得體內(nèi)以綴合物形式存在的量，以及當排出體外時，綴合物占所有排出藥物總量的比率，從而為了解藥物代謝情況提供更多的信息。74（五）化學衍生化

藥物分子中含有活潑H者均可被化學衍生化，如含一COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH等官能團的藥物都可被衍生化。色譜分析法光譜分析法？

色譜分析是分離分析方法，大部分樣品處理后就可上樣分析，但某些藥物或代謝物極性大、揮發(fā)性低、對熱不穩(wěn)定、與其它物質(zhì)分離不好或?qū)z測器不夠靈敏，因此，需要先進行衍生化反應，然后測定衍生物。751.GC法中的化學衍生化法目的：①使極性藥物變成非極性的、易于揮發(fā)的藥物，使具有能被分離的性質(zhì)；②增加藥物的穩(wěn)定性；③含-NH2、-COOH、-OH官能團的藥物常使色譜峰拖尾；④為提高對光學異構(gòu)體的分離能力。

主要的衍生化反應有烷基化、?；⒐柰榛?、及生成非對映異構(gòu)體衍生化法等。其中以硅烷化用得最廣泛。76

常用的烷基化試劑：碘庚烷、疊氮甲烷、氫氧化三甲基苯胺（TMAH）等；

常用的?；噭阂宜狒?、丙酸酐等；

硅烷化試劑：三甲基氯硅烷（TMCS）、雙-三甲基硅烷乙酰胺（BSA）、雙-三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基硅咪唑（TMSI）等。77具有光學異構(gòu)體藥物的分離可采用不對稱試劑，使其生成非對映異構(gòu)體衍生物，然后用GC法進行分析測定。常用的不對稱試劑有：（S）-N-三