《食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)》課件-血清學(xué)反應(yīng)試劑制備

血清學(xué)反應(yīng)試劑制備目錄/Contents1基本概念pH指示劑的配制技術(shù)血清學(xué)鑒定2血清學(xué)反應(yīng)常用試劑和培養(yǎng)基的制備301基本概念血清是指血液凝固析出的淡黃色透明液體。血清蛋白是指為避免抗凝劑的干擾，血液中許多化學(xué)成分的分析，都以血清為樣品。血清學(xué)檢驗(yàn)就是利用抗原-抗體反應(yīng)的顯著特異性，進(jìn)行細(xì)菌的鑒別和血清學(xué)定型。細(xì)菌菌體或鞭毛等抗原的特異性抗體的存在，使得人們可以建立一些快速方法來(lái)檢測(cè)以食品為載體的病原。01基本概念血清學(xué)檢驗(yàn)指根據(jù)抗原與相應(yīng)的抗體在適宜的條件下，能在體外發(fā)生特異性結(jié)合的原理，在體外用已知抗體（或抗原）檢測(cè)抗原（或抗體）。01基本概念

2.血清學(xué)反應(yīng)的一般特點(diǎn)（1）抗原抗體的結(jié)合具有特異性，當(dāng)有共同抗原體存在時(shí)，會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。（2）抗原抗體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定，但是可逆的。01基本概念

2.血清學(xué)反應(yīng)的一般特點(diǎn)（3）抗原抗體的結(jié)合是按一定比例進(jìn)行的，只有比例適當(dāng)時(shí)，才能出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。（4）血清學(xué)反應(yīng)大體分為兩個(gè)階段進(jìn)行，但其間無(wú)嚴(yán)格界限。反應(yīng)速度慢，需幾分、幾十分以至更長(zhǎng)時(shí)間。01基本概念3.血清學(xué)檢驗(yàn)的類型血清學(xué)試驗(yàn)可分為血清學(xué)鑒定和血清學(xué)診斷兩部分。血清學(xué)試驗(yàn)既可定性，又可定量。用已知抗體（即含特異抗體的免疫血清或單克隆抗體等）檢測(cè)標(biāo)本中或分離培養(yǎng)物中未知細(xì)菌的種、型或細(xì)菌抗原，稱為血清學(xué)鑒定；而用已知細(xì)菌或特異性抗原檢測(cè)患者血清中有無(wú)相應(yīng)抗體及其效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化，作為某些感染性疾病的輔助診斷，稱為血清學(xué)診斷。02血清學(xué)鑒定1．凝集反應(yīng)（1）直接凝集反應(yīng)①玻片凝集法方法是取已知抗體（診斷血清）滴加在載玻片上，直接從培養(yǎng)基上刮取待檢菌混勻于診斷血清中，數(shù)分鐘后，如出現(xiàn)細(xì)菌凝集成塊或肉眼可見(jiàn)的顆粒，即為反應(yīng)陽(yáng)性。02血清學(xué)鑒定1．凝集反應(yīng)（1）直接凝集反應(yīng)②試管凝集法此法是一種定量試驗(yàn)方法。多用已知抗原來(lái)檢測(cè)血清中有無(wú)相應(yīng)抗體及其含量。常用于協(xié)助診斷某些傳染病及進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。02血清學(xué)鑒定（2）間接凝集反應(yīng)法此反應(yīng)法是指將可溶性抗原或抗體吸附于某種與免疫無(wú)關(guān)一定大小的顆粒載體表面，制成致敏載體，再與相應(yīng)抗體或抗原作用，在電解質(zhì)存在的適宜條件下，被動(dòng)地使致敏載體凝集的反應(yīng)。02血清學(xué)鑒定（2）間接凝集反應(yīng)法間接凝集反應(yīng)主要可分為正向間接凝集試驗(yàn)、反向間接凝集試驗(yàn)、間接凝集抑制試驗(yàn)和協(xié)同凝集試驗(yàn)。但根據(jù)載體的不同，還可以分為乳膠凝集、血球凝集、炭凝集、SPA協(xié)同凝集等。02血清學(xué)鑒定①正向間接凝集試驗(yàn)即將已知可溶性抗原吸附于載體顆粒上，然后與相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生顆粒凝集現(xiàn)象，用以檢測(cè)未知抗體。②反向間接凝集試驗(yàn)此試驗(yàn)是將已知抗體吸附于載體顆粒表面，以檢測(cè)相應(yīng)可溶性抗原的凝集反應(yīng)。適用于可溶性和顆粒性抗原的檢出，如從食品中檢出肉毒毒素和葡萄球菌腸毒素等菌體。02血清學(xué)鑒定③間接凝集抑制試驗(yàn)它是將已知抗體或可溶性抗原先與被測(cè)的抗原或抗體混合，然后加入有關(guān)抗原或抗體致敏的載體顆粒，如果已知抗體或可溶性抗原與被測(cè)的抗原或抗體相結(jié)合后，不出現(xiàn)顆粒凝集的現(xiàn)象，也可稱為正向或反向間接凝集抑制試驗(yàn)。02血清學(xué)鑒定④協(xié)同凝集試驗(yàn)協(xié)同凝集反應(yīng)屬于間接凝集反應(yīng)的一種類型。它所用的載體是含SPA（葡萄球菌A蛋白）金黃色葡萄球菌。本試驗(yàn)法操作簡(jiǎn)便、快速、敏感性高，易于觀察結(jié)果，已廣泛用于細(xì)菌的快速鑒定和分群（型），如腦膜炎奈瑟菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、布魯氏菌、沙門氏菌及志賀菌等細(xì)菌。02血清學(xué)鑒定2．沉淀反應(yīng)（1）環(huán)狀沉淀反應(yīng)此反應(yīng)是一種定性試驗(yàn)方法，可用已知抗體檢測(cè)未知抗原。將已知抗體注入特制小試管中，然后沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原與抗體對(duì)應(yīng)，則在兩液界面出現(xiàn)白色的沉淀圓環(huán)。02血清學(xué)鑒定2．沉淀反應(yīng)（2）絮狀沉淀反應(yīng)將已知抗原與抗體在試管（如凹玻片）內(nèi)混勻，如抗原抗體對(duì)應(yīng)，而又二者比例適當(dāng)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的絮狀沉淀，此為陽(yáng)性反應(yīng)。02血清學(xué)鑒定2．沉淀反應(yīng)（3）瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)利用可溶性抗原抗體在半固體瓊脂內(nèi)擴(kuò)散，若抗原抗體對(duì)應(yīng)，且二者比例合適，在其擴(kuò)散的某一部分就會(huì)出現(xiàn)白色的沉淀線。每對(duì)抗原抗體可形成一條沉淀線。有幾對(duì)抗原抗體，就可分別形成幾條沉淀線。瓊脂擴(kuò)散可分為單向擴(kuò)散和雙向擴(kuò)散兩種類型。02血清學(xué)鑒定3．補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)此反應(yīng)法是一種在補(bǔ)體參與下，以綿羊紅細(xì)胞和溶血素為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。血清學(xué)反應(yīng)的判定是這樣的：在試驗(yàn)時(shí)，先將定量補(bǔ)體（使用新鮮的豚鼠血清）加入待檢系統(tǒng)中，使抗原抗體優(yōu)先結(jié)合補(bǔ)體。01血清學(xué)鑒定3．補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)如果待檢系統(tǒng)中抗原與抗體相對(duì)應(yīng)，加入的補(bǔ)體可被抗原抗體復(fù)合物所結(jié)合而固定，不再與以后加入的溶血系統(tǒng)起反應(yīng)，不出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，為補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)陽(yáng)性；如待檢系統(tǒng)中的抗原抗體不相對(duì)應(yīng)，則游離的補(bǔ)體與后面加入的溶血系統(tǒng)反應(yīng)，從而出現(xiàn)溶血，為補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)陰性。03血清學(xué)反應(yīng)常用試劑和培養(yǎng)基的制備1．0.1％十二烷基磺酸鈉（用于制備沙門氏菌樣品）用電子天平稱取0.2884g十二烷基磺酸鈉（SDS）溶于100mL水中，并轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，定容至1000mL，搖勻即可。2．營(yíng)養(yǎng)肉湯（用于培養(yǎng)沙門氏菌）蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化鈉5.0g，加熱溶解于1000mL蒸餾水中，25℃條件下調(diào)整PH值7.2±0.2，配制好的溶液分裝進(jìn)三角瓶或試管，121℃高壓滅菌15分鐘備用。03血清學(xué)反應(yīng)常用試劑和培養(yǎng)基的制備3．1.2%~1.5%瓊脂培養(yǎng)基稱取12g-15g的瓊脂，溶于1000mL的蒸餾水中，加熱使之溶解，室溫條件下慢慢冷卻即可。4．生理鹽水稱取0.9克氯化鈉，溶解在少量蒸餾水中，稀釋到100毫升，即得濃度為0.9%的生理鹽水。5．15%氯化鈉稱取15克氯化鈉，溶解在少量蒸餾水中，稀釋到100毫升即得。03血清學(xué)反應(yīng)常用試劑和培養(yǎng)基的制備7．PCA平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（用于菌落總數(shù)測(cè)定的）稱取胰蛋白胨5.0g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖1.0g，瓊脂15.0g，加入蒸餾水1000mL，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH7.0士0.2，然后分裝試管或錐形瓶，121℃高壓滅菌15min。即得。8．月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（金黃色葡萄球菌的檢測(cè)）稱取胰蛋白胨或胰酪胨20.0g，氯化鈉5.0g，乳糖5.0g，磷酸氫二鉀2.75g，磷酸二氫鉀2.75g，月桂基磺酸鈉0.1g，溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)整PH6.8士0.2，然后分裝到有玻璃小導(dǎo)管的試管中，每管10mL。121℃高壓滅菌15min。03血清學(xué)反應(yīng)常用試劑和培養(yǎng)基的制備9．腦心浸出液肉湯（用于金黃色葡萄球菌的檢測(cè)）（1）配方胰蛋白質(zhì)胨10.0g，氯化5.0g，磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O)2.5g，葡萄糖2.0g，牛心浸出液500mL。（2）制法加熱溶解，調(diào)節(jié)pH7.4±0.2，分裝16mmX160mm試管，每管5mL，置121℃高壓滅菌15min。03血清學(xué)反應(yīng)常用試劑和培養(yǎng)基的制備10．10％氯化鈉胰酪胨大豆肉湯（LST）（用于金黃色葡萄球菌的檢測(cè)）（1）配方胰酪胨（或胰蛋白胨）17g，植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）3g，氯化鈉100g，磷酸氫二鉀2.5g，丙酮酸鈉10g，葡萄糖2.5g，蒸餾水1000mL。（2）制法將上述成分混合，加熱，輕輕攪拌并溶解，調(diào)節(jié)pH7.3±0.2，分裝，每瓶50mL,121℃高壓滅菌。03血清學(xué)反應(yīng)常用試劑和培養(yǎng)基的制備11．緩沖蛋白胨水（BPW）（用于沙門氏菌的前增菌）稱取蛋白胨10g，氯化鈉5g，磷酸氫二鈉9g，磷酸二氫鉀1.5g，蒸餾水1000mL。加熱攪拌至溶解，調(diào)節(jié)pH7.2，121℃高壓滅菌15min。12．250μg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)確稱取250mg標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白，用0.03mol/LpH7.8的磷酸緩沖液溶解并定