馬鈴署脫毒種署生產(chǎn)-莖尖脫毒

馬鈴薯脫毒種薯生產(chǎn)

—莖尖脫毒

主講人：姜放軍湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院植物組織培養(yǎng)技術(shù)

解剖鏡下剝?nèi)∏o尖并培養(yǎng)任務(wù)1莖尖初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)

任務(wù)2脫毒苗鑒定，確定核心種苗

任務(wù)3無(wú)病毒苗快速繁殖培養(yǎng)

任務(wù)4誘導(dǎo)試管薯

任務(wù)5試管苗扦插生產(chǎn)微型薯

任務(wù)6脫毒馬鈴薯原種生產(chǎn)

任務(wù)7工作任務(wù)材料選擇和消毒莖尖剝離和接種初代培養(yǎng)繼代增殖生產(chǎn)脫毒原種

莖尖脫毒技術(shù)誘導(dǎo)試管薯、微型薯脫毒苗的鑒定操作流程（一）材料選擇和消毒選擇：注意品種的典型性，選取病癥最輕的接近健康的植株。直接切取植株的分枝頂芽和腋芽剝離培養(yǎng)。切取4-6cm長(zhǎng)的頂芽或側(cè)芽，除去外部可見的小葉。消毒：先用自來水沖洗1h左右，再用70%酒精處理30s，然后用10%漂白粉溶液浸泡5-10min，最后用無(wú)菌水沖洗2-3次即可。（二）莖尖剝離和接種

將消毒后的材料在10-40倍的雙筒解剖鏡下，用解剖鏡剝?nèi)⊥獠坑兹~赫大的葉原基，直接露出圓點(diǎn)是生長(zhǎng)點(diǎn)，再用解剖刀切取0.1-0.3mm，帶有1-2個(gè)葉原基，并迅速接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。解剖時(shí)注意：使莖尖迅速變干，在材料下墊上一塊濕潤(rùn)的無(wú)菌紙也可達(dá)到保持莖尖新鮮的目的。另外：莖尖脫毒效果與切取的莖尖大小直接相關(guān)，莖尖脫毒效果越好，但莖尖越小再生植株的形成也越困難。解剖鏡下剝?nèi)∏o尖

以馬鈴薯試管苗或微型薯的萌芽為材料，在雙筒解剖鏡下剝0.2-0.5mm帶1-2個(gè)葉原基的莖尖培養(yǎng)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方：MS+GA30.2

+NAA0.05+6-BA0.5+肌醇100g/L+2%蔗糖+0.6%瓊脂培養(yǎng)條件：25℃，2000Lx，10h/d，3-6個(gè)月。（三）莖尖初代培養(yǎng)

備用苗在培養(yǎng)的莖尖中選取轉(zhuǎn)綠的莖尖轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上作為病毒待檢材料備用。（四）脫毒苗鑒定，確定核心種苗

病毒鑒定的常用方法有目測(cè)法、指示植物鑒定法和血清法。目測(cè)法：根據(jù)脫毒苗和帶毒苗在形態(tài)、長(zhǎng)勢(shì)上差異來鑒定。脫毒苗生長(zhǎng)快，葉色濃，葉平展，植株健壯。帶毒苗長(zhǎng)勢(shì)弱、葉色淡，葉片出現(xiàn)花葉和褪綠斑。在培養(yǎng)過程中應(yīng)時(shí)常觀察，及時(shí)將帶病毒癥狀明顯的試管苗去除。

指示植物法：常用的馬鈴薯病毒鑒定指示植物有莧科植物千日紅和藜屬植物莧色藜。方法：

1、取被鑒定植株幼葉1～3g，置于等容積（W/V）的緩沖液（0.1mol/L磷酸鈉）中研成勻漿，再在汁液中加入少許600號(hào)金剛砂，作為指示植物摩擦劑，使葉片造成小的傷口，又不破壞表皮細(xì)胞。2、然后用棉球沾取汁液在指示葉面上輕輕涂抹幾次進(jìn)行接種。把接種后的植物放在溫室或者防蟲網(wǎng)內(nèi)，保溫15～25℃，株間與其他植物間都要留一定距離。3、癥狀的表現(xiàn)取決于病毒性質(zhì)和汁液中病毒的數(shù)量，一般需要6～8d或是幾周，指示植物即可表現(xiàn)癥狀。4、凡是出現(xiàn)枯斑、花葉等病毒癥狀的莖尖苗為帶毒苗，將相應(yīng)的試管苗淘汰。

采用酶聯(lián)血清免疫吸附反應(yīng)(ELISA）鑒定由莖尖培養(yǎng)獲得的試管苗是否帶有馬鈴薯主要病毒。確定無(wú)毒核心種苗。經(jīng)鑒定脫毒的馬鈴薯試管苗，采用固體、液體培養(yǎng)基相結(jié)合方法擴(kuò)繁，要求切段為1-2片葉的莖段，繁殖系數(shù)達(dá)到1：3，25d繼代一次。（五）脫毒苗繼代增殖

誘導(dǎo)試管薯將健壯的試管苗轉(zhuǎn)到含8%糖濃度的MS培養(yǎng)基上，18-20℃，光照8h/d黑暗條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)試管薯，要求每株誘導(dǎo)1.5粒，每瓶達(dá)到10粒以上，每粒不小于0.5g。（六）誘導(dǎo)試管薯、微型薯

用蛭石和珍珠巖按1：0.5的比例準(zhǔn)備扦插床，高密度扦插試管苗（10*5cm），業(yè)余時(shí)間進(jìn)行溫度、濕度控制、培埋蛭石等管理，平均每株生產(chǎn)微型薯1.2粒，每粒2g以上。試管苗扦插生產(chǎn)微型薯

播種微型薯生