DNS法測定還原糖的含量

DNS法測定復原糖的含量

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3，5-二硝基水楊酸溶液與復原糖溶液共熱后被復原成棕紅色的氨基化合物，在一定范實驗圍內(nèi)反響的復原糖的量和棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度成一定比例關系，可測定生成化合物的吸光度，由標準曲線反推出復原糖的濃度。操作簡便，快速，雜質(zhì)干擾較少，適于生物制氫中復原糖含量的測定。實驗原理Chemistry

顯色條件包括:波長選擇，顯色劑用量，顯色時間，溶液酸度，顯色溫度，有機絡合物的穩(wěn)定性及共存離子的干擾等。此次實驗選擇波長選擇，顯色劑用量，顯色時間，溶液酸度進行實驗。一．試劑的配置DNS試劑：稱量18.1992g酒石酸鉀鈉溶于50ml蒸餾水中，加熱，趁熱參加0.6313g3，5-二硝基水楊酸〔DNS〕，另配制2mol/lNaOH溶液，取26.2ml參加上述溶液中，稱量0.5128g苯酚和0.5064g無水亞硫酸鈉移入配置好的溶液中，蒸餾水定容至100ml，該試劑避光保存7～10天。葡萄糖標準溶液〔1.0*10-2mol/l〕：準確稱量0.1990g無水葡萄糖，待溶解后定容至100ml容量瓶中。葡萄糖標準溶液〔1.0*10-3mol/l〕：取10ml上述10-2mol/l溶液，稀釋至100ml容量瓶中。葡萄糖標準溶液〔1.0*10-4mol/l〕：取10ml上述10-3mol/l溶液，稀釋至100ml容量瓶中。試管號01234DNS/ml02221水/ml31糖/ml001（10-3mol/l）

1（10-4mol/l）2（10-2mol/l)二.顯色條件的選擇1.波長選擇取5支試管按下表加相應溶液，沸水浴15min,均參加7ml水定容為10ml，流水冷卻，在不同波長處分別進行掃描。圖1為不同條件下溶液的波長——吸光度圖〔水調(diào)零〕。由圖1可以看出白色與綠色曲線幾乎重合，說明0.0001mol/l葡萄糖溶液與DNS反響生成的氨基化合物極少，用比色法很難區(qū)分，故此法所能夠測量的葡萄糖濃度應大于0.0001mol/l。由DNS＋H2O曲線可以看出當波長大于530nm時，DNS的吸光度已經(jīng)很小，這時DNS對反響生成的氨基化合物吸光度的影響可以忽略。

Fig.24號試管稀釋10倍后波長掃描吸光度A

λ/nm圖2為4號試管稀釋10倍后波長掃描圖4號試管用高濃度的葡萄糖溶液和少量的DNS試劑反響，使生成大量的氨基化合物，但其吸光度太大，儀器無法測定，故將其稀釋10倍。以水調(diào)零未出現(xiàn)最頂峰，以DNS調(diào)零時〔圖2〕在540nm處有最頂峰，這說明在該濃度下，DNS可能會對氨基化合物吸光度的測量有較大影響，故測量時以DNS調(diào)零較準確。選擇540nm作為最正確吸收波長。2.DNS用量選擇取試管按下表加相應溶液，沸水浴30min,參加適量水使定容為10ml，流水冷卻，以1號試管中DNS溶液為參比，在540nm處測吸光度。

試管號01234567DNS/ml0211.522.533.5水/ml31

11*10-4mol/l葡萄糖00111111

由圖3可以看出溶液的吸光度隨著DNS用量的增大而增大，但當DNS用量到達3.5ml時，吸光度反而下降，這說明DNS的用量不是越多越好，只要在與糖的反響中DNS有剩余即可。如果DNS用量過多，會使測量時DNS溶液濃度過大，造成測量不準。綜合考慮，此次實驗選定的DNS用量為2ml。

3.反響時間(水浴時間)取試管按下表加相應溶液，沸水浴相應時間后,參加7ml水定容為10ml，流水冷卻，以6號試管中的DNS試劑調(diào)零，在540nm處測吸光度。

試管號0123456789DNS/ml0222222222水/ml3

1

11*10-4mol/l糖/ml0111110111煮沸時間/min1551015202515304050

由圖4可以看出，隨著煮沸時間的加長，吸光度加大，另有實驗說明單純加熱DNS試劑也會使其吸光度增大，故在制作標準曲線和測定未知濃度時，煮沸時間必須相同。此次實驗確定最正確煮沸時間為30min。4反響溶液的酸度范圍的選擇取試管按下表加相應試劑，由于所用器皿為試管，不方便用PH計調(diào)節(jié)PH，此次實驗采用參加不同量的6%的鹽酸溶液的方法，以PH試紙調(diào)節(jié)溶液的酸度。煮沸20min后，各參加7ml水定容為10ml，流水冷卻，以DNS試劑調(diào)零，在540nm處測吸光度。試管號01234567DNS/ml02222222水/ml31

11*10-4mol/l葡萄糖00111111PH/〉141189107〉14圖5中的PH是用PH試紙調(diào)出的，該曲線只能反映變化趨勢。由圖5可以看出，溶液的堿性越強，反響進行的越完全，溶液的酸度越小，越有利于氨基化合物的生成。另外由于DNS試劑就是用NaOH溶液配制的，單純DNS與水的混合液的PH值已經(jīng)超過14。且DNS在反響中是過量的，反響時間是足夠長的，故測量時只需將被測溶液調(diào)至中性，無需刻意調(diào)節(jié)反響混合物溶液的PH值，保證測量時DNS試劑、糖的用量與制作標準曲線時相同即可。三．標準曲線的建立取試管按下表加相應試劑，由0.01mol/l葡萄糖標準液配制x*10-4mol/l〔3<=x<=27〕的葡萄糖，煮沸30min后，各參加7ml水定容為10ml，流水冷卻，以DNS試劑調(diào)零，在540nm處測吸光度。試管號01234567891011121314DNS/ml022222222222222水/ml31

葡萄糖/ml001111111111111濃度/10-4mol/l

3579111315171921232527以下圖1為葡萄糖標準曲線圖，葡萄糖含量〔mol/l〕與相應的吸光度〔A〕有一定的線性關系，且其回歸方程為：y=-0.14971+0.035786x，R=0.9954。另外采用較高濃度的葡萄糖來制作標準曲線，得到以下圖2：其回歸方程為：y=-0.104