DNS法測定還原糖的含量

DNS法測定復(fù)原糖的含量

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3，5-二硝基水楊酸溶液與復(fù)原糖溶液共熱后被復(fù)原成棕紅色的氨基化合物，在一定范實(shí)驗(yàn)圍內(nèi)反響的復(fù)原糖的量和棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度成一定比例關(guān)系，可測定生成化合物的吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線反推出復(fù)原糖的濃度。操作簡便，快速，雜質(zhì)干擾較少，適于生物制氫中復(fù)原糖含量的測定。實(shí)驗(yàn)原理Chemistry

顯色條件包括:波長選擇，顯色劑用量，顯色時間，溶液酸度，顯色溫度，有機(jī)絡(luò)合物的穩(wěn)定性及共存離子的干擾等。此次實(shí)驗(yàn)選擇波長選擇，顯色劑用量，顯色時間，溶液酸度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。一．試劑的配置DNS試劑：稱量18.1992g酒石酸鉀鈉溶于50ml蒸餾水中，加熱，趁熱參加0.6313g3，5-二硝基水楊酸〔DNS〕，另配制2mol/lNaOH溶液，取26.2ml參加上述溶液中，稱量0.5128g苯酚和0.5064g無水亞硫酸鈉移入配置好的溶液中，蒸餾水定容至100ml，該試劑避光保存7～10天。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液〔1.0*10-2mol/l〕：準(zhǔn)確稱量0.1990g無水葡萄糖，待溶解后定容至100ml容量瓶中。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液〔1.0*10-3mol/l〕：取10ml上述10-2mol/l溶液，稀釋至100ml容量瓶中。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液〔1.0*10-4mol/l〕：取10ml上述10-3mol/l溶液，稀釋至100ml容量瓶中。試管號01234DNS/ml02221水/ml31糖/ml001（10-3mol/l）

1（10-4mol/l）2（10-2mol/l)二.顯色條件的選擇1.波長選擇取5支試管按下表加相應(yīng)溶液，沸水浴15min,均參加7ml水定容為10ml，流水冷卻，在不同波長處分別進(jìn)行掃描。圖1為不同條件下溶液的波長——吸光度圖〔水調(diào)零〕。由圖1可以看出白色與綠色曲線幾乎重合，說明0.0001mol/l葡萄糖溶液與DNS反響生成的氨基化合物極少，用比色法很難區(qū)分，故此法所能夠測量的葡萄糖濃度應(yīng)大于0.0001mol/l。由DNS＋H2O曲線可以看出當(dāng)波長大于530nm時，DNS的吸光度已經(jīng)很小，這時DNS對反響生成的氨基化合物吸光度的影響可以忽略。

Fig.24號試管稀釋10倍后波長掃描吸光度A

λ/nm圖2為4號試管稀釋10倍后波長掃描圖4號試管用高濃度的葡萄糖溶液和少量的DNS試劑反響，使生成大量的氨基化合物，但其吸光度太大，儀器無法測定，故將其稀釋10倍。以水調(diào)零未出現(xiàn)最頂峰，以DNS調(diào)零時〔圖2〕在540nm處有最頂峰，這說明在該濃度下，DNS可能會對氨基化合物吸光度的測量有較大影響，故測量時以DNS調(diào)零較準(zhǔn)確。選擇540nm作為最正確吸收波長。2.DNS用量選擇取試管按下表加相應(yīng)溶液，沸水浴30min,參加適量水使定容為10ml，流水冷卻，以1號試管中DNS溶液為參比，在540nm處測吸光度。

試管號01234567DNS/ml0211.522.533.5水/ml31

11*10-4mol/l葡萄糖00111111

由圖3可以看出溶液的吸光度隨著DNS用量的增大而增大，但當(dāng)DNS用量到達(dá)3.5ml時，吸光度反而下降，這說明DNS的用量不是越多越好，只要在與糖的反響中DNS有剩余即可。如果DNS用量過多，會使測量時DNS溶液濃度過大，造成測量不準(zhǔn)。綜合考慮，此次實(shí)驗(yàn)選定的DNS用量為2ml。

3.反響時間(水浴時間)取試管按下表加相應(yīng)溶液，沸水浴相應(yīng)時間后,參加7ml水定容為10ml，流水冷卻，以6號試管中的DNS試劑調(diào)零，在540nm處測吸光度。

試管號0123456789DNS/ml0222222222水/ml3

1

11*10-4mol/l糖/ml0111110111煮沸時間/min1551015202515304050

由圖4可以看出，隨著煮沸時間的加長，吸光度加大，另有實(shí)驗(yàn)說明單純加熱DNS試劑也會使其吸光度增大，故在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定未知濃度時，煮沸時間必須相同。此次實(shí)驗(yàn)確定最正確煮沸時間為30min。4反響溶液的酸度范圍的選擇取試管按下表加相應(yīng)試劑，由于所用器皿為試管，不方便用PH計調(diào)節(jié)PH，此次實(shí)驗(yàn)采用參加不同量的6%的鹽酸溶液的方法，以PH試紙調(diào)節(jié)溶液的酸度。煮沸20min后，各參加7ml水定容為10ml，流水冷卻，以DNS試劑調(diào)零，在540nm處測吸光度。試管號01234567DNS/ml02222222水/ml31

11*10-4mol/l葡萄糖00111111PH/〉141189107〉14圖5中的PH是用PH試紙調(diào)出的，該曲線只能反映變化趨勢。由圖5可以看出，溶液的堿性越強(qiáng)，反響進(jìn)行的越完全，溶液的酸度越小，越有利于氨基化合物的生成。另外由于DNS試劑就是用NaOH溶液配制的，單純DNS與水的混合液的PH值已經(jīng)超過14。且DNS在反響中是過量的，反響時間是足夠長的，故測量時只需將被測溶液調(diào)至中性，無需刻意調(diào)節(jié)反響混合物溶液的PH值，保證測量時DNS試劑、糖的用量與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時相同即可。三．標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立取試管按下表加相應(yīng)試劑，由0.01mol/l葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液配制x*10-4mol/l〔3<=x<=27〕的葡萄糖，煮沸30min后，各參加7ml水定容為10ml，流水冷卻，以DNS試劑調(diào)零，在540nm處測吸光度。試管號01234567891011121314DNS/ml022222222222222水/ml31

葡萄糖/ml001111111111111濃度/10-4mol/l

3579111315171921232527以下圖1為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，葡萄糖含量〔mol/l〕與相應(yīng)的吸光度〔A〕有一定的線性關(guān)系，且其回歸方程為：y=-0.14971+0.035786x，R=0.9954。另外采用較高濃度的葡萄糖來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到以下圖2：其回歸方程為：y=-0.104