蔗糖磷酸合成酶（SucrosephosphatesynthaseSPS）試劑盒說明書

第第頁蔗糖磷酸合成酶（Sucrosephosphatesynthase，SPS）試劑盒說明書蔗糖磷酸合成酶（Sucrosephosphatesynthase，SPS）試劑盒說明書微量法100管/48樣注意：正式測定管前務(wù)必取23個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：蔗糖不僅是重要的光合產(chǎn)物，也是植物體內(nèi)運(yùn)輸?shù)闹饕镔|(zhì)，還是碳水化合物的貯存形式之一、SPS（EC2.4.1.14）以果糖6磷酸為受體，形成的蔗糖磷酸在蔗糖磷酸酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶蔗糖磷酸酶系統(tǒng)看作是蔗糖合成的主要途徑。測定原理：蔗糖磷酸合成酶催化果糖6磷酸形成蔗糖磷酸，蔗糖磷酸與間苯二酚反應(yīng)可呈現(xiàn)顏色變化，在480nm下有特征吸收峰，酶活力大小與顏色的深淺成正比。需自備的的儀器和用品：可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、離心機(jī)、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰試劑的組成和配制：提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；試劑一：液體2.5mL×1瓶，20℃保存；試劑二：1000μg/mL蔗糖溶液10mL×1瓶，4℃保存；試劑三：液體2mL×1瓶，4℃保存試劑四：液體25mL×1瓶，4℃保存；試劑五：液體6mL×1瓶，4℃避光保存；樣品測定的準(zhǔn)備：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測。測定步驟：1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至480nm，蒸餾水調(diào)零。2、樣本測定，（在EP管中依次加入下列試劑）：試劑名稱（μL）測定管對照管標(biāo)準(zhǔn)管空白管樣本1010蒸餾水454555試劑二10試劑一45混勻，25℃準(zhǔn)確水浴10min試劑三15151515沸水浴中煮沸10min左右（蓋緊，以防止水分散失），冷卻試劑四210210210210試劑五60606060混勻，沸水浴30min，冷卻后，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，480nm下測定各管吸光值。標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只要做一管。每個測定管需要設(shè)一個對照管。SPS活力單位的計(jì)算：1、按照蛋白濃度計(jì)算單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg蔗糖定義為一個酶活力單位。SPS活性(μg/min/mgprot)=C標(biāo)準(zhǔn)管×V1×（A測定管A對照管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管A空白管)÷(V1×Cpr)÷T=100×（A測定管A對照管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管A空白管)÷Cpr2、按照樣本鮮重計(jì)算單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg蔗糖定義為一個酶活力單位。SPS活性(μg/min/g鮮重)=C標(biāo)準(zhǔn)管×V1×（A測定管A對照管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管A空白管)÷(W×V1÷V2)÷T=100×（A測定管A對照管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管A空白管)÷WC標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，1000μg/mL；V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，