DB21-T 2219.8-2024 玉米高粱主要病害抗病性鑒定技術(shù)規(guī)范 第8部分：玉米木霉穗腐病

ICS65.020.2021RulesforevaluationofsorghumandmaizeforresistancetodPart8：TrichodermaearrotIDB21/T2219.8—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是DB21/T2219《玉米高粱主要病害抗病性鑒定技術(shù)規(guī)范》的第8部分。DB21/T2219已經(jīng)發(fā)布和計(jì)劃發(fā)布以下部分：——第1部分：高粱靶斑病；——第2部分：高粱煤紋??；——第3部分：高粱鐮孢菌莖腐??；——第4部分：高粱絲黑穗病；——第5部分：玉米灰斑病；——第6部分：玉米彎孢菌葉斑?。骸?部分：玉米青霉穗腐??；——第8部分：玉米木霉穗腐病；…………請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：丹東農(nóng)業(yè)科學(xué)院、沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)、錦州市科學(xué)技術(shù)研究院、朝陽(yáng)市農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)本文件主要起草人：趙睿杰、那明慧、王作英、高越、陳曉旭、王應(yīng)玲、高偉、高艷、黃宇飛、李巖、陳麗、左青、趙成昊、劉曉馨、王小芬、高宇、金曉明、張照然、徐連營(yíng)。本文件發(fā)布實(shí)施后，任何單位和個(gè)人如有問(wèn)題和意見(jiàn)建議，均可以通過(guò)來(lái)電和來(lái)函等方式進(jìn)行反饋，我們將及時(shí)答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實(shí)際情況，依法進(jìn)行評(píng)估及復(fù)審。歸口管理部門(mén)聯(lián)系方式：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（沈陽(yáng)市和平區(qū)太原北街2號(hào)聯(lián)系電話文件起草單位聯(lián)系方式：丹東農(nóng)業(yè)科學(xué)院(遼寧省鳳城市草河區(qū)草河大街99號(hào))，聯(lián)系電話DB21/T2219.8—2024玉米、高粱種植面積約占遼寧省谷類(lèi)作物一半以上。近年來(lái)，在玉米、高粱生產(chǎn)中病害的發(fā)生趨于嚴(yán)重，已成為制約玉米、高粱生長(zhǎng)發(fā)育和優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的重要因素。因此，開(kāi)展玉米、高粱主要病害抗病性鑒定，為抗病育種和病害流行預(yù)測(cè)預(yù)警提供技術(shù)支撐意義重大。為確保標(biāo)準(zhǔn)制定的系統(tǒng)性和應(yīng)用的便利性，針對(duì)遼寧省玉米、高粱主要病害抗病性鑒定技術(shù)需求，特制定本系列標(biāo)準(zhǔn)。DB21/T2219本次發(fā)布兩個(gè)部分：——第7部分：玉米青霉穗腐??；——第8部分：玉米木霉穗腐病。本系列標(biāo)準(zhǔn)還將陸續(xù)發(fā)布其他玉米、高粱主要病害的抗病性鑒定技術(shù)部分。1DB21/T2219.8—2024玉米高粱主要病害抗病性鑒定技術(shù)規(guī)范第8部分：玉米木霉穗腐病本文件規(guī)定了玉米木霉（Trichodermasp.）穗腐病抗病性鑒定技術(shù)的準(zhǔn)備、接種和評(píng)價(jià)等要求。本文件適用于栽培玉米（ZeamaysL.）種質(zhì)資源和雜交種對(duì)玉米木霉穗腐病抗性的人工接種鑒定及評(píng)價(jià)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T1248.8玉米抗病蟲(chóng)性鑒定技術(shù)規(guī)范第8部分：鐮孢穗腐病3術(shù)語(yǔ)和定義NY/T1248.8界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1花絲通道接種silkchannelinoculation采用木霉菌分生孢子懸浮液經(jīng)玉米花絲通道注射而進(jìn)行玉米抗木霉穗腐病鑒定的技術(shù)。4準(zhǔn)備4.1接種物準(zhǔn)備4.1.1接種物的分離、鑒定以常規(guī)組織分離法和單孢分離法（見(jiàn)附錄A）從田間采集的具有典型玉米木霉穗腐病癥狀的果穗分離獲得純培養(yǎng)物，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為木霉菌，4℃保存?zhèn)溆谩?.1.2接種物的制備挑取4.1.1保存的木霉菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PotatoDextroseAgar，簡(jiǎn)稱(chēng)PDA）培養(yǎng)基25℃自然光培養(yǎng)5d后，用無(wú)菌打孔器打取菌落邊緣直徑5mm的菌餅，將其接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液（PotatoDextrose，簡(jiǎn)稱(chēng)PD）培養(yǎng)基中25℃、120r/min搖培5d。培養(yǎng)物經(jīng)滅菌的雙層紗布過(guò)濾，獲得分生孢子懸浮液，用無(wú)菌水將孢子濃度調(diào)至1×105個(gè)/mL，即可用于接種。PDA和PD培養(yǎng)基配方見(jiàn)附錄B。4.2鑒定圃準(zhǔn)備4.2.1鑒定圃設(shè)置鑒定圃應(yīng)具備良好的自然發(fā)病環(huán)境。2DB21/T2219.8—20244.2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)鑒定材料隨機(jī)排列或順序排列。在進(jìn)行選育品種抗病性鑒定時(shí)，每30行鑒定材料設(shè)1組已知抗病和感病對(duì)照材料（見(jiàn)附錄C）。在進(jìn)行種質(zhì)資源抗病性鑒定時(shí)，每50行鑒定材料設(shè)1組已知抗病和感病對(duì)照材料。鑒定圃應(yīng)具備良好的自然發(fā)病環(huán)境和排灌設(shè)施，周邊應(yīng)設(shè)置保護(hù)行。4.2.3種植要求鑒定材料播種時(shí)間與生產(chǎn)播種時(shí)間相同。鑒定小區(qū)行長(zhǎng)5m，行距0.6m，條播或穴播，每行保苗21株，低于13株時(shí)視為該品種/材料鑒定無(wú)效。鑒定種質(zhì)資源時(shí)，每份鑒定材料種植1行；鑒定選育品種時(shí)，每份材料種植2行。土壤肥力水平和耕作管理與大田生產(chǎn)相同。5接種5.1接種時(shí)期接種時(shí)期為玉米雌穗吐絲后14d～21d，接種可全天進(jìn)行。5.2接種方法宜采用花絲通道注射法。將注射器吸液管置于病原菌的分生孢子懸浮液中，金屬的注射針管從雌穗頂端上方的花絲通道部位側(cè)邊插入至花絲通道中間，定量注入2mL接種液，器具為可進(jìn)行連續(xù)定量注射的連動(dòng)注射器。每株僅接種第1個(gè)雌穗。5.3接種前后的田間管理接種后對(duì)鑒定圃進(jìn)行常規(guī)田間管理。6調(diào)查6.1調(diào)查時(shí)間在玉米生理成熟后進(jìn)行調(diào)查，同批次接種材料應(yīng)在同一天完成。6.2調(diào)查方法采收接種的雌穗，去除苞葉后逐穗調(diào)查并對(duì)雌穗籽粒被病菌侵染的面積進(jìn)行分級(jí)記載。表1玉米木霉穗腐病田間調(diào)查結(jié)果表12346.3病情分級(jí)依據(jù)表2中的描述，逐個(gè)記載調(diào)查雌穗的發(fā)病級(jí)別。3DB21/T2219.8—2024表2玉米對(duì)穗腐病抗性鑒定的病情級(jí)別劃分13579注：發(fā)病面積占雌穗總面積比例以A表示。7抗性評(píng)價(jià)7.1鑒定有效性判別當(dāng)設(shè)置的感病對(duì)照材料平均病情級(jí)別≥5.6時(shí)，該批次鑒定視為有效。7.2抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算每份鑒定材料雌穗的平均病情級(jí)別，并依據(jù)平均級(jí)別確定該鑒定材料對(duì)穗腐病的抗性，抗性的劃分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表3。表3玉米對(duì)穗腐病抗性鑒定的病情級(jí)別劃分注：平均病情級(jí)別以D表示。7.3重復(fù)鑒定若鑒定材料初次鑒定時(shí)表現(xiàn)為高抗、抗、中抗，應(yīng)在次年進(jìn)行重復(fù)鑒定。7.4抗性評(píng)價(jià)對(duì)初次鑒定結(jié)果和重復(fù)鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，以記載的最高病情級(jí)別為最終鑒定結(jié)果，并依此結(jié)果對(duì)鑒定材料進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)。8鑒定結(jié)果匯總玉米抗木霉穗腐病鑒定結(jié)果整理后填入鑒定結(jié)果表格，見(jiàn)圖1。4DB21/T2219.8—2024圖1玉米抗木霉穗腐病鑒定結(jié)果匯總表樣式圖5DB21/T2219.8—2024（資料性）玉米木霉穗腐病病原菌A.1主要致病菌種學(xué)名和形態(tài)學(xué)鑒定A.1.1綠色木霉無(wú)性態(tài)學(xué)名：TrichodermaviridePers.exFries綠色木霉無(wú)性態(tài)特征：病菌菌落生長(zhǎng)迅速，初白色，后出現(xiàn)松散的絮狀氣生菌絲，漸黃綠色至藍(lán)綠色；分生孢子梗頂部多次分枝，小梗呈錐狀；分生孢子聚生于小梗上，球形，單孢，無(wú)色至淡色，直徑2.5μm～4.0μm。A.1.2哈茨木霉無(wú)性態(tài)學(xué)名：TrichodermaharzianumRifai哈茨木霉無(wú)性態(tài)特征：病菌菌落生長(zhǎng)迅速，氣生菌絲為白色，產(chǎn)孢區(qū)黃綠色，培養(yǎng)基背面呈暗黃色；菌絲透明，壁光滑，初級(jí)分枝與主枝多呈直角或略向上彎曲，分枝呈金字塔結(jié)構(gòu)，多對(duì)生；分生孢子亞球狀，淺綠色，較小，約3μm×2.6μm。A.2木霉菌的分子鑒定對(duì)木霉菌脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid，DNA）中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（InternalTranscribedSpacer，ITS）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)，確定其分類(lèi)地位。PCR反應(yīng)體系（25μL）：上、下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA（50ng/μL）1μL，2×TaqPCRmix12.5μL，ddH2O9.5μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；94℃30s，退火52℃30s，72℃1min，循環(huán)35次；最后72℃延伸5min。PCR擴(kuò)增引物見(jiàn)表A.1。表A.1PCR擴(kuò)增引物6DB21/T2219.8—2024（資料性）木霉菌培養(yǎng)基配方B.1PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g～20g，蒸餾水1000mL。分裝在三角瓶中后121℃高壓滅菌20min后備用。PDA培養(yǎng)基用于木霉菌生長(zhǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃。B.2PD培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL。分裝在三角