PCR引物設(shè)計及相關(guān)軟件使用

PCR引物設(shè)計及相關(guān)軟件使用重慶大學(xué)生物工程學(xué)院楊應(yīng)斌主要內(nèi)容背景PCR引物設(shè)計原那么常用PCR引物設(shè)計軟件PrimerPremier5.0介紹Oligo6.22介紹在線Primer3介紹PCR聚合酶鏈反響(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期開展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。PCR引物設(shè)計是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不適宜的PCR引物容易導(dǎo)致實驗失?。罕憩F(xiàn)為擴增出目的帶之外的多條帶〔如形成引物二聚體帶〕，不出帶或出帶很弱，等等?，F(xiàn)在PCR引物設(shè)計大都通過計算機軟件進行?？梢灾苯犹峤荒０逍蛄械教囟ňW(wǎng)頁，得到設(shè)計好的引物，也可以在本地計算機上運行引物設(shè)計專業(yè)軟件。引物設(shè)計的原那么引物與模板的序列要緊密互補引物與引物之間防止形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反響(即錯配)。影響因素如引物長度〔primerlength〕，產(chǎn)物長度〔productlength〕序列Tm值(meltingtemperature)引物與模板形成雙鏈的穩(wěn)定性(internalstability,用?G值反映)，形成引物二聚體(primerdimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)〔duplexformationandhairpin〕的能值在錯配位點〔falseprimingsite〕的引發(fā)效率引物及產(chǎn)物的GC含量〔composition〕，等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點，引進突變等。一般原那么引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進行反響。引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否那么容易導(dǎo)致錯配。引物3’端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加。

一般原那么3.引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應(yīng)當(dāng)防止在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反響失敗。5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標(biāo)記物。一般原那么4.引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反響。上下游引物的GC含量不能相差太大。5.引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件最正確。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(thenearestneighbormethod)。一般原那么6.?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)中選用3’端?G值較低〔絕對值不超過9〕，而5’端和中間?G值相對較高的引物。引物的3’端的?G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反響。一般原那么7.引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高〔超過4.5kcal/mol〕易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反響不能正常進行。

一般原那么8.對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。

常用的引物設(shè)計軟件Oligo6〔引物評價〕*PremierPrimer〔自動搜索〕*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3〔在線效勞〕*PrimerPremier5.0的使用技巧簡介主要功能:1、即引物設(shè)計2、限制性內(nèi)切酶位點分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析簡并引物設(shè)計根據(jù)氨基酸序列來設(shè)計引物DNA引物PremierPrimer5提供了8種生物遺傳密碼使用的偏好選擇1、纖毛蟲大核〔CiliateMacronuclear〕2、無脊椎動物線粒體〔InvertebrateMitochondrion〕3、支原體〔Mycoplasma〕4、植物線粒體〔PlantMitochondrion〕5、原生動物線粒體〔ProtozoanMitochondrion〕6、一般標(biāo)準(zhǔn)〔Standard〕7、脊椎動物線粒體〔VertebrateMitochondrion〕8、酵母線粒體〔YeastMitochondrion〕PrimerPremier5.0使用介紹(1)PreimerPremier啟動界面Loadsequence根本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8種密碼子偏好Chooseafunction引物設(shè)計界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer引物搜索選項設(shè)定引物類型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長度搜索結(jié)果28對引物引物分值100分為總分值每對引物的信息雙擊選中一對引物引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer一對理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有But…引物編輯引物編輯EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindowSomeotherusefulfunctionofPP5EnzymeMeltingtemperaturegraphPer25-merGC%graphPer25-merStabilityPer5-mer心肌特異性表達雙順反子載體的構(gòu)建PMYL2EcoRIpIRESneo－2質(zhì)?？寺U增MYL2序列查詢及啟動子功能分析不加酶切位點引物設(shè)計基因組DNA制備高保真PCRCloning大量純化的MYL2promoter片段酶切獲得無promoter線性質(zhì)粒載體片段DNALigationReaction

轉(zhuǎn)入DH5aColonyScreeningPCRIdentification

MYL2promoterpIRESneopEGFP-c3質(zhì)?？寺U增酶切獲取MYL2promoterPlasmidvector開環(huán)分子酶切獲得EGFP片段酶切及凝膠電泳鑒定及回收環(huán)狀DNA分子DNALigationReaction

環(huán)狀DNA分子轉(zhuǎn)入DH5aColonyScreeningPCRIdentification

rat原代胚胎心肌細胞培養(yǎng)及凍存MYL2promoterpIRES/neo/EGFP心肌細胞脂質(zhì)體熒光鑒定rat心肌細胞特異表達EGFP無綠色熒光蛋白表