胚胎冷凍技術

胚胎冷凍技術發(fā)展歷史胚胎冷凍保存的研究起始于20世紀50年代，當時Smith用甘油坐防凍劑，保存兔胚胎獲得成功。1971年Whittingham用慢速冷凍方法獲得小鼠胚胎的成功保存。1978年willadsen建立了快速冷凍方法。1984年Takeda等采用一步冷凍方法首次冷凍小鼠胚胎獲得成功。1985年Rau和Fahy用高濃度的DMSO、乙酰胺、丙二醇和聚乙二醇分別組成玻璃化溶液，對8細胞期的小鼠胚胎進行了一步冷凍實驗，獲得87.5%的凍后發(fā)育率。此后。牛、綿羊、山羊、家兔和大鼠胚胎先后應用玻璃化冷凍法獲得成功。目前該技術已廣泛應用于畜牧生產。原理將胚胎和冷凍液裝入冷凍管中，經過慢速（第2-3天的胚胎）和快速（第5-6天的囊胚）兩種降溫方式使胚胎能靜止下來并可在-196度的液氮中保存的一種方法。醫(yī)療應用若有剩余的質量較好的胚胎，可以冷凍保存，待以后自然周期或人工周期解凍后植入子宮腔內，將增加受孕的機會?？捎糜谝粋€超排卵周期得到的胚胎數量多，質量好，不能一次全部移植，可將多余的胚胎冷凍保存。以及發(fā)生嚴重卵巢過度刺激綜合征的患者，不宜在治療周期移植胚胎者，可將胚胎冷凍，待以后的自然周期或人工周期進行胚胎復蘇移植。優(yōu)勢可以合理限制移植胚胎數，降低多胎妊娠率。為胚胎移植失敗或流產患者提供再次移植機會,不必反復進行女性超促排卵。在超排卵周期出現(xiàn)卵巢過度刺激綜合征跡象時，取消胚胎移植，將胚胎進行冷凍保存，在其后非刺激周期進行冷凍胚胎移植。方法1、常規(guī)緩慢冷凍

此方法需專用的冷凍儀,可獲得較高的移植妊娠率,是目前生產中廣泛采用并且最為成功的冷凍方法。冷凍液一般為1.4mol/L甘油+PBSS(含20%NCS的PBS)。2、一步冷凍法

利用高濃度的抗凍劑使胚胎在冷凍前脫水,從而減少冷凍過程中細胞內冰晶的形成。其特點是胚胎在室溫脫水后不需要特殊的降溫程序,能在很短得時間內完成冷凍過程,具有重要的實用價值。3、玻璃化法(vitrification)

Rall和Fahy(1985)提出了玻璃化冷凍胚胎的方法,即可用幾種保護劑混合組成一種玻璃化(vitrificationsolution,VS),它在低溫時變的很粘稠,不發(fā)生結晶就可固化,形成不規(guī)則結構的玻璃樣固體,能保持液態(tài)時正常的分子和離子分布,因而用玻璃化液進行胚胎冷凍前處理有較好的保護效果。

胞質部分脫水后的玻璃化和胞外溶液的部分玻璃化是有效冷凍保存胚胎的重要因素。胚胎在這種玻璃樣固體中脫水到一定程度,可引起內源性胞質大分子(如蛋白質)

及已滲入白細胞內的冷凍保護劑濃縮,從而使細胞在降溫過程中得到保護。

玻璃化冷凍具有許多冷存液沒有的優(yōu)點操作簡單、快捷、價格便宜、不需要特殊設備,避免細胞內外冰晶形成,更重要的是其粘滯性高,在6℃冷存后形成的玻璃樣結構,保持了分子、離子正常的擴散與分配,細胞內物冰晶形成,維持了正常的細胞超微結構,減少了對透明帶和基因的損害,提高了冷凍存活率和妊娠率。

應充分重視高濃度玻璃化冷凍溶液對胚胎的毒性作用,合理選擇玻璃化冷凍溶液,嚴格控制胚胎和玻璃化冷凍溶液接觸的總時間。目前較簡單的玻璃化溶液的組成是25%甘油、25%PROH或25%乙二醇。

玻璃化冷凍技術正處于實驗研究到臨床應用的過渡階段,隨著玻璃化冷凍方法的逐漸成熟,有望成為程序冷凍方法外的另一種選擇。臨床應用超速玻璃化冷凍

是指使用微型工具,如Cryoloop、CPS、Cryotop和電鏡銅珊(EMG)等,通過極度縮小含胚胎玻璃化溶液的體積來實現(xiàn)“即時玻璃化”,使降溫速率由普通玻璃化的2000℃/min提高到20000℃/min以上,有效避免了細胞內冰晶形成,并減輕了寒冷損傷,提高了冷凍效率。與傳統(tǒng)玻璃化冷凍方法比較

超速玻璃化冷凍一方面提高了降溫速率,另一方而縮短了胚胎與冷凍保護劑溶液的接觸時間,進一步提高了冷凍效率。

在輔助生殖技術領域,Cryoloop超速玻璃化冷凍人囊胚獲得了較高的妊娠分娩率,結果比開放型拉細麥答(OPS)、普通麥管玻璃和CPS能更好的保存胚胎的形態(tài)和活力。

到目前為止,超低溫冷凍人的體外受精(IVF)胚胎,在國內外均獲得成功。

2004年,意大利學者應用ICSI對慢速冷凍卵母細胞與凍融睪丸精子受精后再次凍存多余胚胎,解凍胚胎移植后分娩一健康女嬰,為世界首例。

北京大學第三醫(yī)院生殖醫(yī)學中心應用冷凍精液中精子、冷凍卵母細胞、冷凍胚胎即“三凍”技術,成功獲得世界第2例、我國第1例“三凍”嬰兒。并在卵母細胞冷凍技術方而,采用了與世界首例不同的簡捷的玻璃化冷凍卵母細胞的方法。人類胚胎冷凍的應用現(xiàn)狀

從冷凍技術第一次成功應用于人類胚胎并獲妊娠至今,有關技術、方法不斷成熟。據報道,正常胚胎移植的妊娠失敗率可達到40%～60%,冷凍胚胎尤其是冷凍IVF人胚胎成功率就更低,一些研究結果認為,8～16細胞的人胚胎冷凍效果較好,也有認為,4細胞期胚胎冷凍后的成活率也不低。

從總體上講,凍胚移植的妊娠率比鮮胚低,影響人類胚胎冷凍保存結果的因素是多方面的,主要有胚胎的質量(大小、滲透性等)和分裂(發(fā)育)階段、母體年齡及移植時機以及冷凍保護劑(滲透性、毒性等)和冷凍溶解程序等幾方面。

另外,從理論上講,冷凍胚胎可長期保存,但對于保存過程中胚胎細胞是否發(fā)生老化的問題還缺乏直接的實踐證據;對于冷凍效果鑒定,主要采用形態(tài)學方法鑒定凍胚質量,對其移植后的發(fā)育潛力無法判斷。在多種冷凍方法中,現(xiàn)較多采用慢速冷凍、快速溶解方法,但是其他方法也有其自身優(yōu)點。因此,在實驗中應綜合考慮多方面因素,根據具體的胚胎情況選擇恰當的方法。

玻璃化冷凍方法簡單、快速,防止了冰晶對胚胎造成的損傷,但由于玻璃化溶液的濃度極高且溶質存在毒性,會使胚胎的成活率降低,所以當今研究熱點集中在如何減少高濃度溶液對胚胎的毒害作用。主要有以下幾個方面：通過兩步平衡胚胎;縮短平衡時間;降低平衡溫度;使用蔗糖、海藻糖等抗毒性物質。

目前使用的冷凍保護劑對胚胎尚有一定的毒性,選擇恰當的冷凍保護劑也十分重要,人胚胎的保護劑為DMSO和丙二醇,蔗糖等非滲透性保護劑和滲透性保護劑聯(lián)合使用常取的較好的效果。1、胚胎冷凍技術如今已趨向簡單化、實用化及產業(yè)化,特別是牛的胚胎冷凍技術已經日臻成熟。但是,對人類胚胎的冷凍技術有待于進一步提高,尤其是冷凍過程中細胞形態(tài)和代謝上的影響是制定冷凍保存的最大難題。展望2、胚胎冷凍技術為建立優(yōu)良品種的胚胎庫或基因庫提供了條件,同時也便于胚胎的運輸和移植。胚胎冷凍保存的自身優(yōu)越性決定其有很大的發(fā)展?jié)摿?盡管其