核酸合成 第1部分：合成寡核苷酸的生產(chǎn)和質(zhì)量控制要求

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中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

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`

核酸合成第1部分：合成寡核苷酸的生產(chǎn)

和質(zhì)量控制要求

Nucleicacidsynthesis-Part1:Requirementsfortheproductionandqualitycontrolof

synthesizedoligonucleotides

(ISO20688-1:2020,IDT)

（征求意見稿）

在提交反饋意見時，請將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

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目次

前言III

1范圍1

2規(guī)范性引用文件1

3術(shù)語和定義1

4寡核苷酸的設(shè)計和選擇2

5一般質(zhì)量管理要求2

5.1一般要求2

5.2寡核苷酸分級2

5.3控制文件2

5.4質(zhì)量管理體系2

5.5人員和培訓(xùn)3

5.6安全控制3

6資源管理3

7生產(chǎn)工藝要求3

7.1總則3

7.2寡核苷酸合成3

7.3純化3

7.4質(zhì)量控制檢查4

7.5干燥4

7.6配制錯誤!未定義書簽。

8質(zhì)量控制過程要求4

8.1總則4

8.2分析方法的確認與驗證4

8.3鑒定與純度4

8.3.1堿基序列的鑒定4

8.3.2純度4

8.3.3雜質(zhì)5

8.4定量5

8.4.1總則5

8.4.2濃度5

8.4.3質(zhì)量5

8.5摩爾質(zhì)量和/或堿基長度5

8.6退火溫度6

8.7報告6

8.8糾正措施和改進的驗證7

9合成寡核苷酸（RNA）的附加要求7

I

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附錄A（規(guī)范性）過程檢查表8

附錄B（規(guī)范性）裝置和設(shè)備清單及其控制標(biāo)準(zhǔn)9

附錄C（規(guī)范性）摩爾質(zhì)量和摩爾數(shù)的計算10

附錄D（規(guī)范性）采用質(zhì)量分析法驗證寡核苷酸序列12

附錄E（規(guī)范性）采用經(jīng)過認證的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對測量儀器的精度進行控制—示例錯誤!未定義書

簽。

附錄F（規(guī)范性）Tm值的計算方法錯誤!未定義書簽。

參考文獻錯誤!未定義書簽。

II

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核酸合成第1部分：合成寡核苷酸的生產(chǎn)和質(zhì)量控制要求

1范圍

本文件規(guī)定了合成寡核苷酸（通常最多250個堿基）的生產(chǎn)和質(zhì)量控制要求。

本文件還描述了合成寡核苷酸的一般質(zhì)量指標(biāo)以及質(zhì)量評價指標(biāo)的常用方法。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)certifiedreferencematerial

CRM

附有由權(quán)威機構(gòu)發(fā)布的文件，提供使用有效程序獲得的具有不確定度和溯源性的一個或多個特性值

的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

[來源：ISOGuide30:2015,2.1.2,修改-注釋已刪除。]

3.2

性能performance

<合成寡核苷酸>具有滿足合成特定目的用途（包括生物學(xué)測定法）的寡核苷酸的能力。

注1：合成的寡核苷酸在作為PCR引物的情況下，合成的寡核苷酸具有引物的性能。

注2：合成的寡核苷酸在作為探針以用于DNA微陣列、實時PCR或NGS的情況下，合成的寡核苷酸具有與靶核酸特異性

雜交的能力。

注3：通過評估寡核苷酸在其各自用途中的功能來確認其性能。

3.3

純度purity

<合成寡核苷酸>合成寡核苷酸的預(yù)期序列和/或長度與寡核苷酸總量之間的比率。

注：合成寡核苷酸的純度是對應(yīng)于合成寡核苷酸的預(yù)期序列和/或長度的吸收峰面積與寡核苷酸的總峰面積的比率。

通過高效液相色譜（HPLC）或毛細管電泳（CE）計算260nm處的吸光度（OD260）。純度是根據(jù)HPLC或CE或質(zhì)

譜儀的結(jié)果通過面積歸一化法計算的。

3.4

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)referencematerial

RM

具有一種或多種足夠均勻和穩(wěn)定的特定特性的物質(zhì)，其特性適用于測量過程中的預(yù)期用途。

[來源：ISOGuide30:2015，2.1.1，修改-注釋已刪除。]

3.5

合成寡核苷酸syntheticoligonucleotides

用化學(xué)方法合成的DNA（脫氧核糖核酸）或RNA（核糖核酸）。

1

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注1：各種化合物（例如修飾的堿基、堿基類似物、末端標(biāo)記試劑、熒光化合物等）均可以引入到合成的寡核苷酸

中。

注2：本文件中的合成寡核苷酸是單鏈的、線性的，長度從大約10個到250個核苷酸。

4寡核苷酸的設(shè)計和選擇

合成寡核苷酸的質(zhì)量和一致性要求依據(jù)其預(yù)期用途有差異。例如，引物和探針在聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

或微陣列或NGS中的質(zhì)量要求不同。

通常，用戶負責(zé)指定具體用途的寡核苷酸的質(zhì)量要求。

用戶可以從生產(chǎn)商提供的質(zhì)量等級列表中選擇符合預(yù)期用途的質(zhì)量等級，例如“基因組等級”或“反

義等級”（參見5.2）。

健全的質(zhì)量管理和檢測以及對質(zhì)量控制要求的共識，可以達成一致信息，以便：

——用戶適當(dāng)?shù)剡x擇符合預(yù)期用途的寡核苷酸；

——用戶和生產(chǎn)商能夠更好地溝通，并就定制寡核苷酸的要求達成一致。

5一般質(zhì)量管理要求

5.1一般要求

合成寡核苷酸的生產(chǎn)者（以下稱為“生產(chǎn)者”）應(yīng)建立并實施一種程序，包括描述并保存記錄以下

過程：

a)訂單信息；

b)寡核苷酸的生產(chǎn)；

c)質(zhì)量控制要求。

應(yīng)制定訂單接收過程中的質(zhì)量方針和質(zhì)量目標(biāo)。用戶的質(zhì)量要求可能因其預(yù)期用途、實驗方法的設(shè)

計以及影響重復(fù)性和再現(xiàn)性結(jié)果因素的差異而變化。生產(chǎn)商應(yīng)根據(jù)訂單信息明確質(zhì)量方針、質(zhì)量目標(biāo)和

合成寡核苷酸的等級（如適用），根據(jù)質(zhì)量等級表等方式監(jiān)控是否按照相應(yīng)的工藝進行生產(chǎn)（示例見附

錄A）。此外，應(yīng)在生產(chǎn)過程中采取必要的措施，通過測量和分析所生產(chǎn)的合成寡核苷酸的質(zhì)量來達到

預(yù)期的結(jié)果。

5.2寡核苷酸分級

為了減少對質(zhì)量要求的過度定制，可以考慮對寡核苷酸質(zhì)量進行分級。生產(chǎn)商在記錄寡核苷酸質(zhì)量

等級時，應(yīng)根據(jù)預(yù)期用途確定等級。應(yīng)選擇和確定符合每個等級的純化方法，見7.3。

5.3控制文件

生產(chǎn)商應(yīng)制定一套程序，確保對程序化信息（包括本文件要求的記錄）進行受控，并應(yīng)確保防止任

何作廢文件的非預(yù)期使用。文件信息包括記錄保存在電子媒介中時，生產(chǎn)者應(yīng)確保對電子媒介的受控。

5.4質(zhì)量管理體系

生產(chǎn)者應(yīng)建立質(zhì)量管理體系。質(zhì)量管理體系應(yīng)建立必要的程序，并確保生產(chǎn)根據(jù)程序進行控制。應(yīng)

定期檢查合成寡核苷酸的生產(chǎn)是否正確執(zhí)行本文件規(guī)定的質(zhì)量管理體系。

注：對于標(biāo)記的寡核苷酸，可根據(jù)標(biāo)記的特性考慮其他質(zhì)量指標(biāo)，例如熒光強度和波長。

2

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5.5人員和培訓(xùn)

生產(chǎn)商應(yīng)確保人員具備執(zhí)行本文件規(guī)定的程序的能力，并對其進行適當(dāng)監(jiān)督。生產(chǎn)商應(yīng)向人員提供

適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)和能力監(jiān)控。

5.6安全控制

生產(chǎn)商應(yīng)根據(jù)適用要求制定安全計劃，以確保本文件規(guī)定的寡核苷酸合成人員和純化人員的安全。

6資源管理

生產(chǎn)商應(yīng)確保生產(chǎn)寡核苷酸的設(shè)施和區(qū)域環(huán)境處于適當(dāng)?shù)臈l件下。生產(chǎn)者應(yīng)當(dāng)維護生產(chǎn)合成寡核苷

酸的設(shè)備和儀器。生產(chǎn)者應(yīng)當(dāng)對可能影響合成寡核苷酸質(zhì)量的原料（包括試劑、純水和輔助材料）進行

妥善監(jiān)控。

附錄B列出了適合生產(chǎn)合成寡核苷酸的設(shè)備和儀器示例。

7生產(chǎn)工藝要求

7.1總則

單序列合成寡核苷酸的生產(chǎn)通常包括以下過程：

a)合成；

b)純化；

c)質(zhì)量控制檢查；

d)干燥（如適用）；

e)分裝。

這些過程應(yīng)使用經(jīng)過定期維護/校準(zhǔn)的儀器進行，例如移液管或干燥器。

注1：有幾種用于生產(chǎn)復(fù)雜的寡核苷酸庫的生產(chǎn)工藝。例如，幾個寡核苷酸組合成復(fù)雜的寡核苷酸庫?；蛘撸ㄟ^

基于陣列的合成產(chǎn)生復(fù)雜的寡核苷酸庫。可根據(jù)生產(chǎn)方法選擇和實施適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制措施。

注2：確定質(zhì)量屬性的常規(guī)方法不一定適用于基于陣列的合成。

注3：在某些情況下，單序列寡核苷酸是用兼并堿基合成的，用于非特異性退火的特定應(yīng)用。在這種情況下，堿基

在一個特定的位點被橫移或轉(zhuǎn)換。

7.2寡核苷酸合成

應(yīng)使用經(jīng)過定期校準(zhǔn)和維護的測量儀器進行質(zhì)量控制檢查。

寡核苷酸合成儀應(yīng)定期維護和保養(yǎng)。操作人員應(yīng)按照文件程序進行資格認證。應(yīng)保存與實驗操作有

關(guān)的記錄。

7.3純化

應(yīng)根據(jù)寡核苷酸設(shè)計規(guī)范的風(fēng)險、與用戶協(xié)議的預(yù)期用途，選擇適當(dāng)?shù)募兓O(shè)備和方法。

純化方法包括：反相高效液相色譜（反向HPLC）純化、陰離子交換高效液相色譜（SAX、WAX）、

聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、寡核苷酸純化柱（OPC）、高純度無鹽（HPSF）純化和直接沉淀（脫

鹽）。純化方法可根據(jù)寡核苷酸的預(yù)期用途選擇。應(yīng)保留所用方法的記錄。

純化設(shè)備應(yīng)由有資質(zhì)的人員進行操作。與操作有關(guān)的記錄應(yīng)予以保存。

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7.4質(zhì)量控制檢查

應(yīng)使用經(jīng)過充分校準(zhǔn)和維護的測量儀器進行質(zhì)量控制檢查。測量操作應(yīng)由有資質(zhì)的人員按照文件程

序進行，并保留操作記錄。對寡核苷酸的特性、純度、雜質(zhì)、量和其他與預(yù)期用途有關(guān)的重要屬性應(yīng)進

行質(zhì)量控制。

7.5干燥

干燥可采用離心蒸發(fā)、冷凍干燥或空氣干燥設(shè)備進行。

這些操作應(yīng)由有資質(zhì)的人員按照程序文件進行，并保留操作記錄。

7.6分裝

這些操作應(yīng)由有資質(zhì)的人員按照程序文件執(zhí)行，并保留操作記錄。

8質(zhì)量控制過程要求

8.1總則

質(zhì)量控制過程應(yīng)確定寡核苷酸與其預(yù)期用途有關(guān)的特性、純度、雜質(zhì)、量和其他重要屬性。

應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆椒ú⑦M行驗證，以確定寡核苷酸的特性和質(zhì)量。

測量工作應(yīng)由有資質(zhì)的人員進行。

8.2分析方法的確認與驗證

用于進行質(zhì)量控制和檢測質(zhì)量屬性的分析方法應(yīng)得到驗證和確認。儀器應(yīng)使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行校

準(zhǔn)。

注：附錄E描述了使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對測量儀器進行精度控制的示例。

8.3鑒定與純度

8.3.1堿基序列的鑒定

堿基序列可通過適當(dāng)?shù)姆椒ù_認，例如電噴霧電離（ESI）或基質(zhì)輔助激光解析/電離（MALDI）

作為離子源，飛行時間質(zhì)量分析器（ToF）、離子阱或四極桿質(zhì)譜儀（MS）用于分子量分析或者測序。

注1：附錄D中描述了使用MS確認堿基序列的示例。

注2：MS可用于確認短寡核苷酸的序列，而根據(jù)合成寡核苷酸的長度，準(zhǔn)確分析序列有一定的局限性。

應(yīng)記錄確認的基本序列標(biāo)識。

8.3.2純度

生產(chǎn)商和使用者應(yīng)就特定用途的寡核苷酸的純度達成一致。

示例：合成寡核苷酸的純度可確定為預(yù)期寡核苷酸量與寡核苷酸總量之比。預(yù)期的寡核苷酸是具有“預(yù)期長度”和

/或正確序列的寡核苷酸。

測定純度的方法可包括以下一種或結(jié)合多種方法：

a)分析用反相或離子交換高效液相色譜法；

b)經(jīng)驗證的有線性響應(yīng)的毛細管電泳或平板凝膠電泳；

c)質(zhì)譜（例如，ESI或MALDI作為離子源，ToF、MS作為分子量分析儀）；

d)測序。

注：合成的寡核苷酸是復(fù)雜的分子，根據(jù)寡核苷酸的設(shè)計和生產(chǎn)工藝，會產(chǎn)生不同的結(jié)果。

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應(yīng)記錄測定的純度。

8.3.3雜質(zhì)

在某些應(yīng)用中，雜質(zhì)的測定是很重要的。

生產(chǎn)商和使用者應(yīng)就特殊用途的寡核苷酸雜質(zhì)的可接受程度或范圍確定并達成一致。一般來說，雜

質(zhì)是指干擾預(yù)期用途的寡核苷酸的含量。應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆椒y定雜質(zhì)的含量。

注：雜質(zhì)包括但不限于有機溶劑、單核苷酸、短核酸和序列錯誤的核酸。

雜質(zhì)測定方法包括以下一種或多種方法：

a)分析用反相或離子交換高效液相色譜法；

b)經(jīng)驗證的有線性響應(yīng)的毛細管電泳或平板凝膠電泳；

c)質(zhì)譜（TOF或ESI）；

d)測序。

應(yīng)記錄測定的雜質(zhì)。

8.4定量

8.4.1總則

應(yīng)按照事先商定的預(yù)期用途提供足夠量的合成寡核苷酸。

生產(chǎn)商應(yīng)確認合成總量符合用戶要求。

應(yīng)記錄協(xié)商的合成寡核苷酸的總量。

8.4.2濃度

寡核苷酸濃度的測量可作為生產(chǎn)或產(chǎn)品測試（檢查）過程中質(zhì)量控制的一部分。吸光度可以用來測

量溶液中寡核苷酸的濃度。通常，使用260nm處的吸光度。

摩爾濃度是根據(jù)摩爾消光系數(shù)和OD值公式（C.1）計算的，摩爾消光系數(shù)的參數(shù)見附錄C。

由于在計算摩爾消光系數(shù)時使用了不同的假設(shè)，摩爾消光系數(shù)數(shù)據(jù)（包括使用的假設(shè)）均應(yīng)被記錄。

其他方法，如高效液相色譜法，使用寡核苷酸參考物質(zhì)或有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（如果適用），在證明與光

密度的相關(guān)性后，也可用于測量濃度。

應(yīng)記錄測量的濃度。

8.4.3質(zhì)量

質(zhì)量應(yīng)以納克（ng）或可溯源至SI單位的形式記錄。

質(zhì)量通過公式（1）來計算：

m=??260×??×?×?·······································································(1)

式中：

m————質(zhì)量，單位為ng；

OD260——260nm處的吸光度；

Vf————液體體積，單位為毫升（mL）；

C—————換算系數(shù)，單位為ng/mL；

D—————稀釋因子。

8.5摩爾質(zhì)量和/或堿基長度

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應(yīng)檢測并記錄合成寡核苷酸的摩爾質(zhì)量和/或堿基長度。摩爾質(zhì)量可以用質(zhì)譜（包括ESI或MALDI作

為離子源，ToF、MS作為分子量分析儀）直接測定，也可以通過平板電泳儀或毛細管電泳儀間接測定。

應(yīng)由有資質(zhì)的人員進行確認，并保留記錄。

質(zhì)譜是一種測量分子量的方法。使用質(zhì)譜時，合成寡核苷酸的摩爾質(zhì)量可按式（2）計算：

M=[*(#??×313.20)+(#??×289.17)+(#??×329.19)+(#??×304.18)

+(#??×290.16)+(#?×314.18)+(#??×329.19)+(#??×305.17)

+(#??×345.19)+(#??×306.15))+(#??×330.18)?62]+1····································································(2)

式中：

M——摩爾質(zhì)量，單位為g/mol；

#dA——腺嘌呤（脫氧核糖核酸）的數(shù)量；

#dC——胞嘧啶（脫氧核糖核酸）的數(shù)量；

#dG——鳥嘌呤（脫氧核糖核酸）的數(shù)量；

#dT——胸腺嘧啶（脫氧核糖核酸）的數(shù)量；

#dU——尿嘧啶（脫氧核糖核酸）的數(shù)量；

#I——肌苷（脫氧核糖核酸）的數(shù)量；

#rA——腺嘌呤（核糖核酸）的數(shù)量；

#rC——腺嘌呤（核糖核酸）的數(shù)量；

#rG——腺嘌呤（核糖核酸）的數(shù)量；

#rU——腺嘌呤（核糖核酸）的數(shù)量；

#rI——腺嘌呤（核糖核酸）的數(shù)量；

注1：注1：更多信息見參考文獻以及C.1和表C.1。

注2：公式（2）可用于計算基于3'端修飾的磷酸的摩爾質(zhì)量。

使用不同的公式時，應(yīng)予以記錄。

修飾的寡核苷酸的摩爾質(zhì)量可由C.2中所示修飾化合物的摩爾質(zhì)量值來計算。

8.6退火溫度

Tm值可通過附錄F中的公式（F.1）計算。計算時應(yīng)記錄Tm值。

8.7報告

合成寡核苷酸的報告單，應(yīng)包括但不限于以下內(nèi)容：

a)產(chǎn)品標(biāo)識；

b)產(chǎn)品批號；

——生產(chǎn)過程和質(zhì)量控制可追溯；

c)訂單的使用者；

d)純化方法；

e)寡核苷酸序列；

——描述應(yīng)采用IUPAC代碼的形式，示例見附錄C；

f)摩爾質(zhì)量；

注1：見公式（2）。原則上，寡核苷酸部分的摩爾質(zhì)量不包括帶有連接臂的修飾物，并且不包含5'端的磷酸基團。

g)用于計算摩爾質(zhì)量的公式；

h)OD單位；

注2：OD是一種廣泛使用的表示寡核苷酸量的單位。

注3：見8.4.3.

6

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i)摩爾消光系數(shù)數(shù)據(jù)，包括假定的數(shù)據(jù)；

注4：見公式（C.1）.

j)總摩爾數(shù)；

注5：可根據(jù)表C.1中所示的吸光度指數(shù)和附錄C中描述的公式（C.1）計算該值。

k)退火溫度；

l)鳥嘌呤胞嘧啶（GC）含量；

m)推薦（例如特定的緩沖液，包括TE緩沖液）用于稀釋合成寡核苷酸的溶液；

n)有效期；

——有效期應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗確定——可根據(jù)類似寡核苷酸穩(wěn)定性研究的結(jié)果估計保質(zhì)期；

注6：例如，干粉在4°C下的典型保質(zhì)期為兩年，溶液在?20°C下經(jīng)典保質(zhì)期為一年。

o)儲存條件；

——儲存條件應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗確定；

——可根據(jù)類似寡核苷酸穩(wěn)定性研究的結(jié)果，確定儲存條件。

注7：原則上，干粉儲存在4°C，溶液儲存在-20°C，但可根據(jù)用戶和生產(chǎn)商之間的協(xié)議使用不同的溫度范圍。

p)運輸條件。

8.8糾正措施和改進建議

質(zhì)量管理體系應(yīng)采取糾正措施消除包括不合格和顧客對產(chǎn)品的投訴等問題的原因。當(dāng)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品有問

題需要改進時，應(yīng)考慮采取適當(dāng)?shù)募m正措施。質(zhì)量管理體系應(yīng)保存糾正措施或改進的記錄。質(zhì)量管理體

系應(yīng)定期審查糾正措施和改進的情況。

9合成寡核苷酸（RNA）的附加要求

第4條至第8條所述的質(zhì)量管理體系要求也應(yīng)適用于合成RNA。

此外，由于RNA易被酶降解，以下附加要求也適用于RNA：

a)應(yīng)使用經(jīng)消毒的無核酸酶的設(shè)備，如容器或吸頭。

b)生產(chǎn)用純水或緩沖溶液應(yīng)由受控過的純水系統(tǒng)制成。應(yīng)定期檢查所采用的純水系統(tǒng)制備的水

的電導(dǎo)率。試劑應(yīng)在受控條件下在適當(dāng)?shù)脑O(shè)施中制備，以避免核酸酶的污染。此外，對于干

粉狀態(tài)的產(chǎn)品，應(yīng)在打開密封容器后立即使用試劑。試劑應(yīng)在干粉的狀態(tài)下運輸。當(dāng)產(chǎn)品以

溶液形式運輸和儲存時，應(yīng)保持冷凍狀態(tài)運輸，且儲存在?80°C中。

7

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AA

附錄A

（規(guī)范性）

過程檢查表

表A.1提供了可用于合成寡核苷酸合格性評估的檢查表示例。

表A.1工藝檢查表

一致性

流程要求章節(jié)

合格不合格不適用文件和章節(jié)

生產(chǎn)編號

客戶信息

序列信息

修飾

訂單接收過程純化方法

訂單接收日期/交

貨期

訂單接收負責(zé)人

產(chǎn)量

設(shè)備管理

合成

合成負責(zé)人

生產(chǎn)過程純化

純化負責(zé)人

定量測量

定量測量負責(zé)人

質(zhì)量控制

設(shè)備控制

質(zhì)量控制過程質(zhì)量控制負責(zé)人

報告編寫

報告編寫負責(zé)人

運輸過程運輸負責(zé)人

質(zhì)量經(jīng)理

培訓(xùn)/資質(zhì)

法律要求

總則

糾正措施

文件控制

記錄控制

8

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BB

附錄B

（規(guī)范性）

裝置和設(shè)備清單及其控制標(biāo)準(zhǔn)

設(shè)備和裝置清單及其控制標(biāo)準(zhǔn)示例見表B.1.

表B.1設(shè)備和裝置及其控制標(biāo)準(zhǔn)清單

裝置類型規(guī)格預(yù)期用途要求檢查頻率

溫控設(shè)備安裝時、安裝后每

溫度穩(wěn)定性和均勻性

（培養(yǎng)箱、兩年，以及維修后

——儲存試劑

冰箱、冷凍

溫度檢查每天

機等）

純水生產(chǎn)

——質(zhì)量控制電導(dǎo)率檢查每周

系統(tǒng)

至少使用兩種質(zhì)量合格的可

pH計——試劑制備每天或使用時

溯源的緩沖溶液進行校正

零點確認和讀數(shù)檢查采用標(biāo)

稱重設(shè)備——試劑制備每天或使用時

準(zhǔn)重量，或執(zhí)行內(nèi)置性能檢查

移液器a

——試劑分配校準(zhǔn)并檢查移液量的準(zhǔn)確性定期

離心機

——離心運轉(zhuǎn)正常，無異常響聲使用時

寡核苷酸能夠通過β-氰乙基亞磷酰胺法合成寡核苷酸

寡核苷酸合成檢查閥門和試劑流量定期a

合成儀的裝置1），2）

自動移液試劑或合成寡核

自動移液機器人等檢查移液量的準(zhǔn)確性定期a

系統(tǒng)苷酸等的分液

可以安裝適當(dāng)?shù)纳V柱，并配備可測量254nm-

高效液相檢查內(nèi)置性能和色譜柱的有

260nm的吸收波長的檢測器，以及能夠在需要寡核苷酸純化定期a

色譜系統(tǒng)效性。

匯總峰面積的記錄器和餾分采集器。

能夠在自然條件和變性條件下進行聚丙烯酰

具有分離和檢測相應(yīng)摩爾質(zhì)

電泳設(shè)備胺或瓊脂糖凝膠電泳的設(shè)備以及檢測設(shè)備，如確認堿基長度定期a

量標(biāo)記的能力。

紫外線燈。

能夠在自然或變性條件下分離合成寡核苷酸

毛細管電具有分離和檢測相應(yīng)摩爾質(zhì)

的裝置，并配有檢測器和記錄裝置，可對峰面確認堿基長度定期a

泳系統(tǒng)量標(biāo)記的能力。

積進行匯總。

合成寡核苷酸的

內(nèi)置性能檢查。定期a

分光光度得量測定

單光束或雙光束分光光度計。

計合成寡核苷酸的

用濾光片b進行校準(zhǔn)。定期a

得量測定

a考慮正常使用方式及其頻率（見ISO9001或與組織質(zhì)量管理體系相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)），確定檢驗頻率，以確保其適用于

目的。

b例如，一種光學(xué)玻璃濾波器，它是為光譜光度計的校準(zhǔn)而設(shè)計的。

9

GB/TXXXXX—XXXX

CC

附錄C

（規(guī)范性）

摩爾質(zhì)量和摩爾數(shù)的計算

C.1計算摩爾質(zhì)量和摩爾消光系數(shù)所需的信息

計算摩爾質(zhì)量（見8.5）和摩爾消光系數(shù)所需的信息見表C.1和C.2。這里給出的信息是常見示例的

部分列表，尤其是關(guān)于帶標(biāo)簽的表單。

合成寡核苷酸的摩爾數(shù)可用吸光度（用OD值表示）除以摩爾消光系數(shù)計算。

pH值為7.0和260nm時的摩爾消光系數(shù)可按式（C.1）計算：

ε=(#??×15.2)+(#??×7.4)+(#??×11.8)+(#??×8.8)+(#??×10.1)+(#?×12.1)+

(#??×14.9)+(#??×7.55)+(#??×13.6)+(#??×10)+(#??×12.1)···············································(C.1)

式中：

ε——摩爾消光系數(shù)，單位為l×mol?1×cm?1；

#dA——腺嘌呤（脫氧核糖核酸）的數(shù)量；

#dC——胞嘧啶（脫氧核糖核酸）的數(shù)量；

#dG——鳥嘌呤（脫氧核糖核酸）的數(shù)量；

#dT——胸腺嘧啶（脫氧核糖核酸）的數(shù)量；

#dU——尿嘧啶（脫氧核糖核酸）的數(shù)量；

#I——肌苷（脫氧核糖核酸）的數(shù)量；

#rA——腺嘌呤（核糖核酸）的數(shù)量；

#rC——腺嘌呤（核糖核酸）的數(shù)量；

#rG——腺嘌呤（核糖核酸）的數(shù)量；

#rU——腺嘌呤（核糖核酸）的數(shù)量；

#rI——腺嘌呤（核糖核酸）的數(shù)量；

公式（C.1）不適用于修飾寡核苷酸。

如果8.7中有記錄和報告，則可以使用不同的公式。

表C.1堿基分子的摩爾質(zhì)量和摩爾消光系數(shù)（不帶保護基）

pH值為7.0和260nm時的摩爾消光系數(shù)

IUPAC代碼摩爾質(zhì)量ag×mol?1

l×mol?1×cm?1

dA313.2015.2

dC289.177.4

dG329.1911.8

dT304.188.8

dU290.1610.1

rA329.1914.9

rC305.177.55

rG345.1913.6

rU306.1510

I314.1812.1

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GB/TXXXXX—XXXX

pH值為7.0和260nm時的摩爾消光系數(shù)

IUPAC代碼摩爾質(zhì)量ag×mol?1

l×mol?1×cm?1

rI330.1812.1

a摩爾質(zhì)量是水溶液中的摩爾質(zhì)量。

C.2計算摩爾質(zhì)量和摩爾消光系數(shù)的附加參考

表C.2是廣泛使用的修飾基團示例的部分清單。

表C.2修飾基團

激發(fā)波長發(fā)射波長

摩爾質(zhì)量摩爾消光系數(shù)

位點修飾λmaxλ

g×mol?1l×mol?1×cm?1

nmnm

5'-Cy5534.6250000(650nm)643667

5'-Cy3507.6150000(550nm)550570

5'-Cy5(viaaminomodified)817.0250000(650nm)643667

5'-Cy3(viaaminomodified)791.9150000(550nm)550570

5'-Amino179.2———

5'-Biotin405.5———

5'-Thiol329.4———

5'-6-FAM537.583000(496nm)496516

3'Cy5(viaaminomodified)848.0250000(650nm)643667

3'Cy3(viaaminomodified)820.9150000(550nm)550570

3'Amino208.2———

3'Biotin(withTEGlinker)569.6———

3'Thiol(beforereduction)244.3———

3'TAMRA626.795000(546nm)546576

7-deazapropagylamino

3'351.26———

dA

7-deazapropagylamino

3'368.26———

dG

3'N2-aminohexyldG429.39———

3'5-aminohexyldC457.43———

3'5-aminohexyldT458.41———

3'5-fluoresceindC874.91———

3'5-TAMRAdC815.73———

3'5-TAMRAdT875.9———

3'5-fluoresceindT816.72———

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DD

附錄D

（規(guī)范性）

采用質(zhì)量分析法驗證寡核苷酸序列

D.1總則

本附錄提供了使用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-ToF-MS）和電噴霧電離四極桿

質(zhì)譜儀（ESI-Q-MS）通過離子源衰變（離子化？）對寡核苷酸進行堿基序列分析的示例。

D.2MALDI-TOF-MS實驗方案

a)樣品前處理

——將每種分析物溶解在純水中，使最終濃度為50pmol/μL。取1μL樣品溶液和0.5μL基質(zhì)溶液

點在MALDI板上。然后，將MALDI板風(fēng)干，加載到裝置中，最后進行質(zhì)譜分析。

注：基質(zhì)溶液為20mg/mL2,4-二羥基苯乙酮（DHAP）和70mmol檸檬酸二銨的50%乙腈溶液。

b)MALDITOF測試條件

——試驗條件見表D.1.

表D.1MALDI-TOFMS測試條件

測試設(shè)備基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀

特點光源：氮氣激光器（λ=337,1nm）

加速電壓20kV

延遲提取針對m/z3000優(yōu)化

飛行模式線性模式（陽離子檢測模式）

測量范圍m/z1-15000

5＇-ATGCGTTCCTTCAGCCTGTCCACTA-3＇

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X質(zhì)荷比；

Y強度。

圖D.1合成寡核苷酸的質(zhì)譜結(jié)果示例

利用D.2中描述的條件，用MALDI-ToF-MS分析合成的寡核苷酸。使用原始分析軟件，圖D.1中所示的

每個峰與寡核苷酸中指定位置的每個核苷酸相關(guān)。

D.3ESI-Q-MS實驗方案

a)樣品前處理

1)將每種分析物溶于純水中，終濃度為10pmol/μL。柱上的質(zhì)量負荷保持恒定，上樣量為

50pmol或5μL。

2)流動相A:15mMTAE緩沖液，400mM六氟-2-丙醇（HFIP）的pH8.0的水溶液。

3)流動相B:15mmTAE（TAE）緩沖液，400mMHFIP的甲醇溶液。

表D.2HPLC梯度表

時間（min）流速（mL/min）%A%B

00.281.019.0

15.00.273.526.5

16.00.250.050.0

17.00.281.019.0

21.00.281.019.0

b)ESI-Q-MS測試條件（見表D.3）

表D.3ESI-Q-MS測試條件

測試設(shè)備（液相色譜）超高效液相色譜法

測試設(shè)備（檢測器）質(zhì)譜儀

色譜柱寡核苷酸分離柱，1.7μm，2.1mm，50mm

柱溫60°C

樣品溫度