以DC為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗策略

樹突狀細胞與DC疫苗2010.12.31腫瘤疫苗和DC簡史腫瘤細胞的免疫逃避機制和DC抗腫瘤機制以DC為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗策略DC腫瘤疫苗的主要影響因素樹突狀細胞dendriticcell;DC1973

美國學者Steinman

小鼠的脾細胞因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名目前所知的功能最強的抗原提呈細胞CD34骨髓干細胞腫瘤疫苗dendriticcellvaccineDCvaccine1、增強腫瘤的免疫原性2、增強機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答3、打破腫瘤免疫耐受核心問題誘導主動性免疫刺激宿主產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答安全、無不良反應(yīng)能為預防腫瘤復發(fā)提供保護性的長期免疫記憶功能理想腫瘤疫苗腫瘤疫苗的研究進展疫苗的出現(xiàn)1796EdwardJenner

接種疫苗——天花腫瘤疫苗嘗試性研究提高腫瘤自身免疫原性的方法增加機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)1、WiUiamColey丹毒患者的活的鏈球菌→注射腫瘤患者腫瘤結(jié)節(jié)內(nèi)→激發(fā)起腫瘤患者機體對腫瘤的免疫應(yīng)答2、牛痘病毒感染的腫瘤細胞→腫瘤溶解物→注射人體3、混合卡介苗或短小棒狀桿菌+經(jīng)過照射滅活的腫瘤細胞→共孵育→注射人體沒有取得明顯肯定的治療效果理論基礎(chǔ)的奠定1971BurnetThomas

免疫監(jiān)視學說免疫系統(tǒng)細胞免疫機制識別清除腫瘤細胞

臨床和實驗證據(jù)1、免疫缺陷（尤其是細胞免疫缺陷）→腫瘤發(fā)生率↑2、幼兒期（免疫功能未發(fā)育成熟）和老年期（免疫功能衰退）→腫瘤發(fā)生率比其他年齡↑3、經(jīng)抗淋巴細胞血清處理或胸腺摘除的小鼠腫瘤發(fā)生率高腫瘤疫苗研究的飛躍20世紀末

90年代初以基因修飾腫瘤細胞為基礎(chǔ)的疫苗發(fā)展腫瘤疫苗真正成為能夠應(yīng)用于臨床的腫瘤治療方法1997年美國Jefferson大學約60％的黑色素細胞瘤轉(zhuǎn)移患者注射腫瘤疫苗后存活5年以上1998年波士頓研究人員制成一種經(jīng)生物工程改造的腫瘤疫苗，它包含一種可以刺激機體免疫系統(tǒng)，使Ｔ細胞保持較長時間的攻擊力。

（一）全腫瘤細胞疫苗

1、經(jīng)物理、化學等方法處理的疫苗

2、轉(zhuǎn)基因疫苗

3、感染病毒類疫苗

4、細胞融合疫苗（二）腫瘤抗原及抗原類分子疫苗

該類疫苗的研究最為廣泛,該類疫苗特異性高,但免疫原性低

1、抗原疫苗

2、多肽類疫苗

3、抗獨特型抗體疫苗

4、熱休克蛋白—肽類復合物疫苗（三）核酸疫苗（四）重組病毒、病菌疫苗（五）樹突狀細胞疫苗腫瘤疫苗新熱點近10年來以樹突狀細胞為基礎(chǔ)的腫瘤抗原特異性疫苗1991年Steinman首次發(fā)現(xiàn)DC這一強大的抗原遞呈功能以來，DC就被用于腫瘤的免疫治療研究轉(zhuǎn)基因疫苗表達的共刺激分子、細胞因子,通過激活ＤＣ細胞使更多的抗原被攝取呈遞臨床試驗效果不如動物實驗；瘤細胞獲取復雜；滅活要求高；基因?qū)氲陌踩珕栴}直接攜帶腫瘤抗原的DC細胞作用則更為直接可以活化靜息Ｔ細胞，激發(fā)更強抗腫瘤免疫反應(yīng)DC疫苗VS易獲取，操作簡便，效果和轉(zhuǎn)基因疫苗相當甚至更好美國密執(zhí)安大學、瑞士蘇黎世大學等應(yīng)用樹突狀細胞分別攜帶乳腺癌、黑色素瘤抗原制備疫苗Dukes大學則應(yīng)用腫瘤細胞ＲＮＡ轉(zhuǎn)導ＤＣ細胞均已進入Ⅰ期或Ⅱ期臨床試驗。2005年中山大學腫瘤醫(yī)院研發(fā)出一種除了干細胞移植、化療等常規(guī)治療方法外的白血病治療方法——白血病DC疫苗已在14位患者身上獲得明顯療效，國內(nèi)尚屬首創(chuàng)。腫瘤細胞免疫逃避機制和DC抗腫瘤的機制1）

腫瘤的免疫原性較弱,并具有抗原調(diào)變能力腫瘤細胞逃避免疫的機制2）MHC-I類分子表達下降或消失。B7，ICAM-1等共刺激分子在癌細胞上的表達異常；

3）腫瘤細胞表面抗原封閉或覆蓋腫瘤細胞高水平表達包括唾液酸在內(nèi)的粘多糖或其他的凝聚系統(tǒng)；血清中的封閉因子（封閉抗體）封閉腫瘤表面抗原表位。4）免疫系統(tǒng)無法清除大量腫瘤細胞使之漏逸。漏逸的少量腫瘤細胞不能引起足夠的免疫應(yīng)答，反而可以刺激腫瘤不斷生長，產(chǎn)生免疫刺激。存在于某些腫瘤組織內(nèi)的淋巴細胞可以為腫瘤細胞提供某些腫瘤營養(yǎng)因子并刺激腫瘤細胞生長。3）腫瘤細胞表面Fas表達下調(diào)；Fas/FasL反擊Sakaguchi’等在1995年發(fā)現(xiàn)鼠源性的CD4CD25雙陽性T細胞亞群，能通過細胞與細胞間接觸以及分泌細胞因子顯著抑制多種免疫細胞的功能。局部微環(huán)境的腫瘤抗原可顯著誘導特異Treg細胞生成，稱為腫瘤特異Treg細胞。很多資料顯示Treg細胞在腫瘤微環(huán)境及患者外周血中富集存在。4）免疫抑制細胞的大量生成，如Treg細胞腫瘤免疫抑制因子可以使腫瘤細胞躲避局部免疫效應(yīng)細胞的攻擊，還能進入外周血循環(huán)，抑制宿主全身抗腫瘤免疫功能。Lyon小組應(yīng)用“微量樣本多指標流式蛋白定量技術(shù)(CytometricBeadArray，CBA)”對35例確診乳癌患者及24例疑似患者的樣本進行了檢測對比，得出在所測的IL-1B、IL-2、IL4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、MCP-1、MIP-1B和TNF-α細胞因子中，除了GM—CSF，INF-γ外，其他因子都有顯著的增高。5）免疫抑制性細胞因子的生成，如VEGF、IL-10、PGE2、IL-6、TGF-β和M-CSF。6）DC數(shù)量減少或功能缺陷,不足以激發(fā)機體的抗原特異性免疫應(yīng)答以殺滅腫瘤細胞。Ishigami等的研究顯示,胃癌組織中DC數(shù)量與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和周圍浸潤呈負相關(guān)。1)未成熟DC與腫瘤細胞的直接接觸影響了DC的成熟;2)腫瘤細胞釋放的可溶性免疫抑制因子影響著全身的DC的成熟和功能,包括VEGF、TNF-α、TGF-β、M-CSF、GM-CSF、IL-6和IL-10等

。造成DC細胞這種缺陷的主要原因:腫瘤局部DC浸潤數(shù)量可作為判斷腫瘤預后的獨立指標。正常DC細胞的抗腫瘤機制1）DC細胞加工抗原，啟動MHC-I類和Ⅱ類分子限制性的CD8+T細胞CD4+T細胞反應(yīng)。2)活化的DCIL-12Th0Th1IFN-γ、GM-CSF、TNF-α3）活化的DC高水平表達多種共刺激分子(如CD80／CD86和CD40)和黏附分子(如CD54、CD58)，使T細胞充分被激活4）啟動活化的效應(yīng)T細胞遷移至腫瘤部位。5）DC可能通過釋放某些抗血管生成物質(zhì)(IL-12，IFN-γ)及前血管生成因子而影響腫瘤血管的形成。以DC為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗策略以DC為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗策略以DC為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗策略腫瘤細胞/腫瘤細胞提取物沖擊DC1蛋白質(zhì)沖擊DC2腫瘤抗原肽沖擊DC3腫瘤抗原DNA/RNA沖擊DC4腫瘤抗原在體內(nèi)沖擊DC51.腫瘤細胞/腫瘤細胞提取物沖擊DC腫瘤細胞DCDC-腫瘤融合細胞1.腫瘤細胞/腫瘤細胞提取物沖擊DC自體腫瘤細胞自體DCDC-腫瘤融合細胞1.腫瘤細胞/腫瘤細胞提取物沖擊DC異體腫瘤細胞自體DCDC-腫瘤融合細胞1.腫瘤細胞/腫瘤細胞提取物沖擊DC自體腫瘤細胞異體DCDC-腫瘤融合細胞Yasuda1.腫瘤細胞/腫瘤細胞提取物沖擊DC優(yōu)點1.所含抗原信息量大2.可在無須了解該腫瘤TSA（腫瘤特異性抗原）的情況下誘導出針對該腫瘤的特異性T細胞免疫3.可減少腫瘤對單一抗原表位發(fā)生的免疫逃避2.蛋白質(zhì)沖擊DC對于抗原表位尚不了解的腫瘤，可以可溶性蛋白作為抗原裝載DC在腫瘤動物模型和腫瘤患者中，以腫瘤抗原蛋白轉(zhuǎn)染的DC在體外和體內(nèi)均可誘導出針對腫瘤的抗原特異性CTL反應(yīng)優(yōu)點：可使那些因MHC限制而排除在肽疫苗治療之外的患者受益。3.腫瘤抗原肽沖擊DC

以腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原肽裝載DC的腫瘤疫苗優(yōu)點：高度表位特異性，避免引起自身免疫反應(yīng)不需要腫瘤組織或細胞，可以調(diào)控免疫強度抗原表位擴展缺點：抗原表位必須已知應(yīng)用受MHC限制腫瘤細胞逃避免疫識別的可能性增加4.腫瘤抗原DNA/RNA沖擊DC

分離、提取DNA/RNA擴增（PCR）電泳&DNA/RNAblotting轉(zhuǎn)染DC載體4.腫瘤抗原DNA/RNA沖擊DC

DNA/RNA疫苗可在體外合成而大量獲得，并可包含多個抗原表位，還可經(jīng)修飾使其功效加強。RNA疫苗只在宿主細胞的胞質(zhì)中表達，DNA疫苗需進入細胞核后轉(zhuǎn)錄——癌變的潛在危險DNA疫苗穩(wěn)定性好，功效長久5.腫瘤抗原在體內(nèi)沖擊DC抗原肽蛋白接種體內(nèi)轉(zhuǎn)染DC腫瘤抗原外周血單核細胞未成熟DCDC疫苗GM-CSF,IL-4脂質(zhì)體DC裝載抗原策略免疫佐劑的使用DC的體外擴增免疫途徑臨床病人的選擇DC腫瘤疫苗的主要影響因素DC的來源DC的分離純化DC的培養(yǎng)基DC培養(yǎng)使用的細胞因子DC細胞的鑒定DC的培養(yǎng)技術(shù)DC的來源——骨髓取材有限，HSC含量極少,大約為1/105

單個核細胞。BM為侵入性操作,患者不容易接受。

其增殖及多向分化能力隨供者年齡增加體質(zhì)衰弱而減弱。在體外培養(yǎng)過程中有自發(fā)分化和衰老的現(xiàn)象,且BM有病毒污染的可能DC的來源——外周血標本來源充足,取材方便,因子組合簡單,培養(yǎng)步驟簡單、經(jīng)濟。HSC含量極少,最終收獲的DC數(shù)量少,活力和純度均不高。其端粒及端粒酶活性均長于和高于BM及PBHSC/HPC,并且低表達或不表達細胞凋亡配基CD95/Fas,故體外生存期更長DC的來源——臍帶血較豐富的原始且能重建長期造血的HSC/HPC,自我增殖及多向分化能力較強對刺激因子的反應(yīng)和增殖能力、體外集落形成能力、刺激后進入細胞周期的速度以及自泌生長因子能力均強于BM及PB的HSC/HPC,臍帶血優(yōu)點缺點產(chǎn)量大、純度高等母嬰無不良影響,不涉及社會、倫理及法律等方面的爭論,受胎盤屏障保護,被污染概率低CB量較少,通常只有50～150ml;CBHSC對理化變化較敏感,洗滌、分離或運用傳統(tǒng)方法去除紅細胞的方法均會導致HSC的嚴重丟失分離純化操作簡單,

細胞成分復雜,

多次傳代后不能純化,

增殖活力相對較低連續(xù)貼壁法操作簡單,

成本低廉,

純化率較低密度梯度離心法細胞純度高(≥90%),

但操作復雜,價格昂貴,

單克隆抗體選擇不當,容易丟失目的細胞免疫磁珠分選法聯(lián)合DC的培養(yǎng)基10%胎牛血清——引起機體免疫反應(yīng)自體單核細胞條件培養(yǎng)基細胞因子維持DC分化、發(fā)育、存活、功能的最基本的CK,主要使HSC向DC、單核及巨噬細胞分化,并以生成單核細胞為主GM-CSFIL-4IL-4通過抑制單核細胞向巨噬細胞方向的分化而誘導其向DC方向分化IL-4可以增加并穩(wěn)固GM-CSF誘導的CD1a的表達IL-4與極低濃度GM-CSF協(xié)同刺激iDC后,促進DC成熟,上調(diào)MHCⅡ和共刺激分子表達;

IL-4還能促進IL-12分泌,TNF-αGM-CSF體外誘導DC的體系中是必需的,早期誘導細胞進入細胞周期,促進細胞增殖;后期阻止細胞向粒系的分化,上調(diào)GM-CSF受體表達,并促進DC成熟可抑制DC發(fā)生自發(fā)性凋亡DC的鑒定形態(tài)學鑒定表面特異性標記物的鑒定（CD1a、CD83）功能學鑒定：混合淋巴細胞反應(yīng)促T細胞增殖作用

DC分泌IL-12的檢測DC的鑒定形態(tài)學鑒定