HJ 1001-2018 水質(zhì) 總大腸菌群、糞大腸菌群和 大腸埃希氏菌的測定 酶底物法（正式版）

中華人民共和國國家環(huán)境保護標(biāo)準(zhǔn)水質(zhì)總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法Waterquality—Determinationoftotalcoliforms,fecalcoliformsandEscherichiacoli—Enzymesubstra2018-12-26發(fā)布i中華人民共和國生態(tài)環(huán)境部2018年第73號為貫徹《中華人民共和國環(huán)境保護法》,保護生態(tài)環(huán)境，保障人體健康，規(guī)范生態(tài)環(huán)境監(jiān)測工作，現(xiàn)批準(zhǔn)《水質(zhì)糞大腸菌群的測定濾膜法》等五項標(biāo)準(zhǔn)為國家環(huán)境保護標(biāo)準(zhǔn)，并予發(fā)布。二、《水質(zhì)糞大腸菌群的測定多管發(fā)酵法》(HJ347.2—2018);四、《水質(zhì)總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法以上標(biāo)準(zhǔn)自2019年6月1日起實施，由中國環(huán)境出版集團出版，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容可在生態(tài)環(huán)境部網(wǎng)站自以上標(biāo)準(zhǔn)實施之日起，《水質(zhì)糞大腸菌群的測定多管發(fā)酵法和濾膜法(試行)》(HJ/T347—2007)廢止。2018年12月26日 1適用范圍 12規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 14方法原理 25干擾和消除 26試劑和材料 27儀器和設(shè)備 8樣品 39分析步驟 410結(jié)果計算與表示 511精密度和準(zhǔn)確度 612質(zhì)量保證和質(zhì)量控制 713廢物處理 7附錄A(資料性附錄)結(jié)果判定參考圖片 8附錄B(規(guī)范性附錄)97孔定量盤法MPN表 附錄C(資料性附錄)97孔定量盤法MPN表對應(yīng)95%置信區(qū)間 為貫徹《中華人民共和國環(huán)境保護法》和《中華人民共和國水污染防治法》,保護生態(tài)環(huán)境，保障人體健康，規(guī)范水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定方法，制定本標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的酶底物法。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄B為規(guī)范性附錄，附錄A和附錄C為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。本標(biāo)準(zhǔn)由生態(tài)環(huán)境部生態(tài)環(huán)境監(jiān)測司、法規(guī)與標(biāo)準(zhǔn)司組織制訂。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：上海市環(huán)境監(jiān)測中心。本標(biāo)準(zhǔn)驗證單位江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心、浙江省環(huán)境監(jiān)測中心、常州市環(huán)境監(jiān)測中心、上海市松江區(qū)環(huán)境監(jiān)測站、上海市長寧區(qū)環(huán)境監(jiān)測站和上海市青浦區(qū)環(huán)境監(jiān)測站。本標(biāo)準(zhǔn)生態(tài)環(huán)境部2018年12月26日批準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)自2019年6月1日起實施。本標(biāo)準(zhǔn)由生態(tài)環(huán)境部解釋。水質(zhì)總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法1適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的酶底物法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定。本方法的檢出限為10MPN/L。2規(guī)范性引用文件本標(biāo)準(zhǔn)引用了下列文件或其中的條款。凡是未注明日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T6682分析實驗用水規(guī)格和實驗方法GB/T14581水質(zhì)湖泊和水庫采樣技術(shù)指導(dǎo)HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)HJ/T91地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。37℃培養(yǎng)24h,能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase),分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細菌。又稱耐熱大腸菌群(thermotolerantcoliforns)。44.5℃培養(yǎng)24h,能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase),分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細菌。俗稱大腸桿菌。37℃培養(yǎng)24h,能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase),分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黃色的鄰硝基苯酚，同時產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶(β-Glucuronidase),分解選擇性培養(yǎng)基中的4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)釋放出熒光物質(zhì)(4-甲基傘形酮)的腸桿菌科細菌。最大可能數(shù)mostprobable又稱稀釋培養(yǎng)計數(shù)，是一種基于泊松分布的間接計數(shù)法。利用統(tǒng)計學(xué)原理，根據(jù)一定體積不同稀釋2度樣品經(jīng)培養(yǎng)后產(chǎn)生的目標(biāo)微生物陽性數(shù)，查表估算一定體積樣品中目標(biāo)微生物存在的數(shù)量(單位體積存在目標(biāo)微生物的最大可能數(shù))。4方法原理在特定溫度下培養(yǎng)特定的時間，總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，將選擇性培養(yǎng)基中的無色底物鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)分解為黃色的鄰硝基苯酚(ONP);大腸埃希氏菌同時又能產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶，將選擇性培養(yǎng)基中的4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)分解為4-甲基傘形酮，在紫外燈照射下產(chǎn)生熒光。統(tǒng)計陽性反應(yīng)出現(xiàn)數(shù)量，查MPN表，分別計算樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌的濃度值。5干擾和消除5.1活性氯具有氧化性，能破壞微生物細胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細胞死亡，可在樣品采集(8.1)時加入硫代硫酸鈉溶液(6.4)消除干擾。5.2重金屬離子具有細胞毒性，能破壞微生物細胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細胞死亡，可在樣品采集(8.1)時加入乙二胺四乙酸二鈉溶液(6.5)消除干擾。6試劑和材料除非另有說明，分析時均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純試劑，實驗用水應(yīng)滿足GB/T6682中三級水的6.1培養(yǎng)基。本標(biāo)準(zhǔn)采用MinimalMediumONPG-MUG培養(yǎng)基。每100ml樣品需使用培養(yǎng)基粉末2.7g±0.5g,所含基本成分如下：硫酸銨[(NH?)?SO?]0.5g硫酸鎂(MgSO?)10mg氯化鈉(NaCl)1g氯化鈣(CaCl?)5mg亞硫酸鈉(Na?SO?)4mg兩性霉素B(AmphotericinB)0.1mg鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)50mg4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)7.5mg茄屬植物萃取物(Solanium萃取物)50mgN-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸鈉鹽(HEPES鈉鹽)0.53g也可采用市售商品化培養(yǎng)基制品。6.2硫代硫酸鈉(Na?S?O?·5H?O)。6.3乙二胺四乙酸二鈉(C?H??N?O?Na?·2H?O)。6.4硫代硫酸鈉溶液：p(Na?S?O?)=0.10g/ml。稱取15.7g硫代硫酸鈉(6.2),溶于適量水中，定容至100ml,臨用現(xiàn)配。36.5乙二胺四乙酸二鈉溶液：p(C??H??N?O?Na?·2H?O)=0.15g/ml。稱取15g乙二胺四乙酸二鈉(6.3),溶于適量水中，定容至100ml,此溶液保質(zhì)期為30d。6.697孔定量盤：含49個大孔，48個小孔。其中，每個小孔可容納0.186ml樣品，大孔中48個大孔每個可容納1.86ml樣品，一個頂部大孔可容納11ml樣品。也可采用經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌的市售商品化成品。6.7標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤。6.8無菌水：取適量實驗用水，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min,備用。7儀器和設(shè)備7.1采樣瓶：具螺旋帽或磨口塞的100ml、250ml、500ml廣口玻璃瓶。7.2高壓蒸汽滅菌器：121℃可調(diào)。7.3恒溫培養(yǎng)箱：允許溫度偏差37℃±1℃、44.5℃±0.5℃。7.4程控定量封口機：用于97孔定量盤(6.6)的封口。7.5紫外燈：365～366nm。7.6移液管：1ml±0.01ml、10ml±0.1ml。也可采用計量合格的可調(diào)式移液器。7.7三角瓶：100ml。7.8量筒：100ml±1ml。7.9一般實驗室常用儀器和設(shè)備。8樣品8.1樣品采集點位布設(shè)及采樣頻次按照GB/T14581、HJ/T494和HJ/T91的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。采集微生物樣品時，采樣瓶(7.1)不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。采集河流、湖庫等地表水樣品時，可握住瓶子下部直接將帶塞采樣瓶插入水中，距水面10～15cm處，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使樣品灌入瓶內(nèi)然后蓋上瓶塞，將采樣瓶從水中取出。如果沒有水流，可握住瓶子水平往前推。采樣量一般為采樣瓶容量的80%左右。樣品采集完畢后，迅速扎上無菌包裝紙。從龍頭裝置采集樣品時，不要選用漏水龍頭，采水前將龍頭打開至最大，放水3～5min,然后將龍頭關(guān)閉，用火焰灼燒約3min滅菌或用70%～75%的酒精對龍頭進行消毒，開足龍頭，再放水1min,以充分除去水管中的滯留雜質(zhì)。采樣時控制水流速度，小心接入瓶內(nèi)。采集地表水、廢水樣品及一定深度的樣品時，也可使用滅菌過的專用采樣裝置采樣。在同一采樣點進行分層采樣時，應(yīng)自上而下進行，以免不同層次的攪擾。如果采集的是含有活性氯的樣品，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液(6.4),以除去活性氯對細菌的抑制作用(每125ml容積加入0.1ml的硫代硫酸鈉溶液);如果采集的是重金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液(6.5),以消除干擾(每125ml容積加入0.3ml的乙二胺四乙酸二鈉溶液)。48.2樣品保存采樣后應(yīng)在2h內(nèi)檢測，否則，應(yīng)10℃以下冷藏但不得超過6h。實驗室接樣后，不能立即開展檢測的，將樣品于4℃以下冷藏并在2h內(nèi)檢測。9分析步驟9.1樣品稀釋根據(jù)樣品污染程度確定接種量(見表1),避免接種樣品培養(yǎng)后97孔定量盤(6.6)出現(xiàn)全部陽性或全部陰性。接種量小于100ml時，應(yīng)稀釋樣品后接種，接種量為10ml時，取10ml樣品加入盛有90ml無菌水(6.8)的三角瓶(7.7)中混勻制成1:10的稀釋樣品，其他接種量的稀釋樣品依次類推。對于未知樣品，可選用多個接種量進行檢測。表1樣品接種量參考表▲湖泊(水庫)▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲處理后▲▲9.2接種量取100ml樣品或稀釋樣品于滅菌后的三角瓶，加入2.7g±0.5g培養(yǎng)基(6.1)粉末，充分混勻，完全溶解后，全部倒入97孔定量盤(6.6)內(nèi)，以手撫平97孔定量盤背面，趕除孔內(nèi)氣泡，然后用程控定量封口機(7.4)封口。觀察97孔定量盤顏色，若出現(xiàn)類似或深于標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤(6.7)的顏色，則需排查樣品、培養(yǎng)基、無菌水等一系列因素后，終止試驗或重新操作。9.3培養(yǎng)測定總大腸菌群和大腸埃希氏菌時，將封口后的97孔定量盤放入恒溫培養(yǎng)箱(7.3)中37℃±1℃下培養(yǎng)24h。測定糞大腸菌群時，將封口后的97孔定量盤放入的恒溫培養(yǎng)箱中44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24h。9.4對照試驗9.4.1空白對照每次試驗都要用無菌水(6.8)按照步驟9.1～9.3進行實驗室空白測定。培養(yǎng)后的97孔定量盤不得有任何顏色反應(yīng)，否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定。9.4.2陰性和陽性對照總大腸菌群、大腸埃希氏菌、糞大腸菌群的陰性、陽性菌株參考表2。5表2陰性、陽性菌株參考表陽性菌種陰性菌種大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)金黃色葡萄球菌、假單胞菌屬大腸埃希氏菌(耐熱型)、克雷伯氏菌屬(Klebsiellatrevisan)(耐熱型)產(chǎn)氣腸桿菌、糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis)、假單胞菌屬將標(biāo)準(zhǔn)菌株制成300～3000個/ml的菌懸液，將菌懸液按接種(9.2)和培養(yǎng)(9.3)要求操作，陽性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽性反應(yīng)；陰性菌株呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)重新測定。9.4.3結(jié)果判讀與計數(shù)將培養(yǎng)24h后的97孔定量盤進行結(jié)果判讀，樣品變黃色判斷為總大腸菌群或糞大腸菌群陽性；樣品變黃色且在紫外燈(7.5)照射下有藍色熒光，判斷為大腸埃希氏菌陽性。如果結(jié)果可疑，可延長培養(yǎng)至28h進行結(jié)果判讀，超過28h后出現(xiàn)的顏色反應(yīng)不作為陽性結(jié)果。可使用保質(zhì)期內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤以輔助判讀，參見附錄A。分別記錄97孔定量盤中大孔和小孔的陽性孔數(shù)量。10結(jié)果計算與表示10.1結(jié)果計算從97孔定量盤法MPN表(見附錄B)中查得每100ml樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群數(shù)或大腸埃希氏菌的MPN值(置信區(qū)間參見附錄C)后，再根據(jù)樣品不同的稀釋度，按照式(1)換算樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群數(shù)或大腸埃希氏菌濃度(MPN/L):MPN值——每100ml樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群數(shù)或大腸埃希氏菌濃度，MPN/100ml;1000——將C單位由MPN/ml轉(zhuǎn)換為MPN/L;10.2結(jié)果表示測定結(jié)果保留兩位有效數(shù)字，當(dāng)測定結(jié)果≥100MPN/L時，以科學(xué)計數(shù)法表示；若97孔均為陰性，可報告為總大腸菌群、糞大腸菌群數(shù)或大腸埃希氏菌未檢出或<10MPN/L。611精密度和準(zhǔn)確度11.1精密度6個實驗室分別對低濃度(地下水，濃度均值為6.0×102MPN/L)、中濃度(地表水，濃度均值為4.0×10?MPN/L)和高濃度(生活污水，濃度均值為9.0×10?MPN/L)三個不同濃度細菌總數(shù)的樣品及有證標(biāo)準(zhǔn)樣品(濃度為2000MPN/L)進行了6次重復(fù)測定：實驗室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為0.26%~1.3%、0.65%～2.0%、1.3%～3.7%和0.68%～2.8%;實驗室間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為9.9%、1.3%、4.2%和1.3%;重復(fù)性限為0.17、0.18、0.21和0.18;再現(xiàn)性限為1.8、0.23、0.38和0.20;實驗室間置信區(qū)間見表3。表3總大腸菌群實驗室間95%置信區(qū)間表低濃度/(MPN/L)中濃度/(MPN/L)高濃度/(MPN/L)有證標(biāo)準(zhǔn)樣品/(MPN/L)95%置信區(qū)間95%置信區(qū)間5.5×102~3.5×10?~3.7×10?~1.8×103~6個實驗室分別對低濃度(地下水，濃度均值為70MPN/L)、中濃度(地表水，濃度均值為9.0×103MPN/L)和高濃度(生活污水，濃度均值為2.0×10?MPN/L)三個不同濃度細菌總數(shù)的樣品及有證標(biāo)準(zhǔn)樣品(濃度為2000MPN/L)進行了6次重復(fù)測定：實驗室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為0.69%~1.9%、0.93%～2.9%、5.4%～21%和1.8%～3.0%;實驗室間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為9.6%、1.6%、15%和3.7%;重復(fù)性限為0.23、0.21、0.58和0.19;再現(xiàn)性限為1.7、0.26、0.90和0.35;實驗室間置信區(qū)間見表4。表4大腸埃希氏菌實驗室間置信區(qū)間表低濃度/(MPN/L)中濃度/(MPN/L)高濃度/(MPN/L)有證標(biāo)準(zhǔn)樣品/(MPN/L)95%置信區(qū)間95%置信區(qū)間95%置信區(qū)間95%置信區(qū)間7.3×103~9.9×1031.3×10?~1.7×10?1.7×103~2.3×1036個實驗室分別對低濃度(地下水，濃度均值為1.0×102MPN/L)、中濃度(地表水，濃度均值為1.3×10?MPN/L)和高濃度(生活污水，濃度均值為3.0×10?MPN/L)三個不同濃度細菌總數(shù)的樣品及有證標(biāo)準(zhǔn)樣品(濃度為3700MPN/L)進行了6次重復(fù)測定：實驗室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為0.40%~2.4%、1.3%～2.9%、3.4%～17%和2.4%～9.2%;實驗室間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為8.9%、6.4%、6.6%、6.4%;重復(fù)性限為0.22、0.26、0.58和0.55;再現(xiàn)性限為1.6、0.76、0.64和0.75;實驗室間置信區(qū)間見表5。表5糞大腸菌群實驗室間置信區(qū)間表低濃度/(MPN/L)中濃度/(MPN/L)高濃度/(MPN/L)有證標(biāo)準(zhǔn)樣品/(MPN/L)95%置信區(qū)間95%置信區(qū)間95%置信區(qū)間95%置信區(qū)間9.5×103~1.4×101.6×10?~2.1×10?2.5×103~5.4×1076家實驗室對總大腸菌群有證標(biāo)準(zhǔn)樣品(2000MPN/L)進行了6次重復(fù)測定：實驗室內(nèi)的相對誤差范圍為-6.4%～-3.5%;相對誤差的最終值為-4.7%