游離脂肪酸（FFA）含量試劑盒（測血清、動物組織、微生物、細(xì)胞）

第第頁游離脂肪酸（FFA）含量試劑盒（測血清、動物組織、微生物、細(xì)胞）游離脂肪酸（FFA）含量試劑盒（測血清、動物組織、微生物、細(xì)胞）微量法100管/96樣注意：正式測定前務(wù)必取23個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：游離脂肪酸，也稱為非酯化脂肪酸，在與白蛋白結(jié)合的血漿中循環(huán)。動物血液中的游離脂肪酸(FFA)含量是一項重要的生理生化指標(biāo)。血清中游離脂肪酸的濃度與脂類代謝、糖代謝、內(nèi)分泌功能有關(guān)，游離脂肪酸的濃度會因為糖尿病、重癥肝障礙、甲狀腺功能亢進(jìn)等疾病而上升。測定原理：用有機溶劑萃取FFA。含有FFA的有機液與三乙醇胺銅反應(yīng),在有機相中形成脂肪酸銅(銅皂)FFA一Cu。Cu離子與顯色液反應(yīng)形成紫紅色絡(luò)合物。反應(yīng)形成的顏色深淺與Cu離子濃度的關(guān)系符合朗伯一比爾定律，因此可利用此反應(yīng)進(jìn)行比色。自備的儀器和用品：酶標(biāo)儀、離心機、可調(diào)式移液器、96孔板、蒸餾水。試劑的組成和配制：萃取液：液體120mL×1瓶，4℃保存；試劑一：液體15mL×1瓶，4℃保存；試劑二：液體15mL×1瓶，4℃保存；試劑三：粉劑×1瓶，室溫保存；試劑四：液體12mL×1瓶，4℃保存；樣本前處理：1.動物組織：按照動物組織質(zhì)量（g）：萃取液mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL萃取液），進(jìn)行冰浴勻漿。震蕩提取15min，5000rpm4℃離心5min，取有機相待測。2.血清：吸取50μL血清樣本，加入1mL萃取液，震蕩提取15min后，4℃，5000rpm離心5min，取有機相待測。3.微生物、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個）：萃取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL萃取液）加入萃取液，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲2秒，間隔3秒，總時間3min）；震蕩提取15min，然后5000rpm4℃離心5min，取有機相待測。注意：有機相待測液可能存在于上層，也可能存在于下層，注意觀察，體積較多的那一層即為有機相待測液。測定步驟：1、酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至550nm。2、工作液的配制：臨用前根據(jù)用量按照試劑一（V）：試劑二（V）：試劑三（m）=1（mL）：1（mL）：0.66（g）的比例充分混勻。（注意：現(xiàn)用現(xiàn)配，用多少配多少，在空瓶中配制，試劑盒中帶有4個空瓶，先將試劑一與試劑二混合，最后再加入試劑三粉劑）3、測定管：吸取600μL樣本，加入200μL工作液，蓋緊后震蕩20min，4℃，5000rpm離心5min，分層后取200μL上層有機相，加入100μL試劑四，搖勻，10min后測定550nm的吸光值，記為A測定。4、空白管：吸取600μL萃取液，加入200μL工作液，蓋緊后震蕩20min，4℃，5000rpm離心5min，分層后取200μL上層有機相，加入100μL試劑四，搖勻，10min后測定550nm的吸光值，記為A空白。空白管只需測一次?！鰽=A測定A空白注意：1、有機溶劑易揮發(fā)，加入96孔板后應(yīng)盡快檢測。2、測定管中加入的樣本即樣本前處理中的有機相待測液。FFA含量計算：標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0161x0.0141R2=0.9985x：棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL）y：吸光值差值△A1、血清FFA含量計算：FFA含量(μmol/mL)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V3×V1÷V2)÷1000=1.242×(△A+0.0141)2、動物組織、微生物、細(xì)胞中FFA含量計算：（1）按樣本蛋白濃度計算FFA含量(μmol/g鮮重)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷（W×V1÷V2）÷1000=0.062×(△A+0.0141)÷W（2）按樣本蛋白濃度計算FFA含量(μmo/mgprot)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V1×Cpr)÷1000=0.062×(△A+0.0141)÷CprV1：加入樣本體積，0.6mL；V2：萃取液體積，1mL；V3：加入血清（漿）體積，0.05mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：動物組織樣品質(zhì)量，g；1000：1μmol=1000nmol