實驗-蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)與顏色反應(yīng)

實驗蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)與顏色反應(yīng)一、實驗?zāi)康恼莆砧b定蛋白質(zhì)的原理和方法。熟悉蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)，進一步熟悉蛋白質(zhì)的有關(guān)反應(yīng)。二、實驗原理蛋白質(zhì)分子中某種或某些集團可與顯色劑作用，產(chǎn)生顏色。不同的蛋白質(zhì)由于所含的氨基酸不完全相同，顏色反應(yīng)亦不完全相同。顏色反應(yīng)不是蛋白質(zhì)的專一反應(yīng)，一些非蛋白物質(zhì)也可產(chǎn)生同樣的顏色反應(yīng)，因此不能根據(jù)顏色反應(yīng)的結(jié)果來決定被測物是否為蛋白質(zhì)。另外，顏色反應(yīng)也可作為一些常用蛋白質(zhì)定量測定的依據(jù)。蛋白質(zhì)是親水性膠體，在溶液中的穩(wěn)定性與質(zhì)點大小、電荷、水化作用有關(guān)，但其穩(wěn)定性是有條件的，相對的。如果條件發(fā)生了變化，破壞了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)就會從溶液中沉淀出來。三、實驗儀器1、吸管2、滴管3、試管4、電爐5、pH試紙6、水浴鍋7、移液管四、實驗試劑1、卵清蛋白液：雞蛋清用蒸餾水稀釋10-20倍，3-4層紗布過濾，濾液放在冰箱里冷藏備用。2、0.5%苯酚：1g苯酚加蒸餾水稀釋至200ml。3、Millon’s試劑：40g汞溶于60ml濃硝酸（水浴加溫助溶）溶解后，冷卻，加二倍體積的蒸餾水，混勻，取上清夜備用。此試劑可長期保存。4、尿素晶體5、1%CuSO4：1gCuSO4晶體溶于蒸餾水，稀釋至100ml6、10%NaOH：10gNaOH溶于蒸餾水，稀釋至100ml7、濃硝酸8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀釋至100ml.9、冰醋酸10、濃硫酸11、飽和硫酸銨溶液：100ml蒸餾水中加硫酸銨至飽和。12、硫酸銨晶體：用研缽研成碎末。13、95%乙醇。14、醋酸鉛溶液：1g醋酸鉛溶于蒸餾水并稀釋至100ml15、氯化鈉晶體16、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸餾水中并稀釋至100ml17、飽和苦味酸溶液：100ml蒸餾水中加苦味酸至飽和。18、1%醋酸溶液。五、實驗步驟蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)（一）

米倫（Millon’s）反應(yīng)其中米倫試劑能與苯酚及某些二羥基苯衍生物起顏色反應(yīng)，而組成蛋白質(zhì)的氨基酸中酪氨酸含苯酚基團，因此可用米倫試劑檢測蛋白質(zhì)中酪氨酸的存在。尿素被加熱，形成雙縮脲，在堿性環(huán)境中，能與硫酸銅結(jié)合成紫色的化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵與縮脲結(jié)構(gòu)相似，也能進行此反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于濃硝酸可反應(yīng)并生成黃色物質(zhì)，此物質(zhì)在堿性環(huán)境下變?yōu)榻埸S色的硝基苯衍生物硝醌酸等。蛋白質(zhì)與茚三酮共熱，產(chǎn)生蘭紫色的還原茚三酮、茚三酮和氨的縮合物。此反應(yīng)為一切蛋白質(zhì)及a-氨基酸所共有。亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）與茚三酮反應(yīng)呈黃色，含有氨基的其他物質(zhì)亦呈此反應(yīng)蛋白質(zhì)是親水性膠體，在溶液中的穩(wěn)定性與質(zhì)點大小、電荷、水化作用有關(guān)，但其穩(wěn)定性是有條件的，相對的。如果條件發(fā)生了變化，破壞了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)就會從溶液中沉淀出來。向蛋白質(zhì)中加入大量的中性鹽（硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等），使蛋白質(zhì)膠體顆粒脫水，破壞其水化層，同時它所帶有的電荷亦被中性鹽上所帶的相反電荷的離子所中和。于是穩(wěn)定因素被破壞，蛋白質(zhì)聚集沉淀。鹽析作用一般不使蛋白質(zhì)變性。某些有機溶劑（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白質(zhì)脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點間的相互作用，致使蛋白質(zhì)顆粒容易凝聚而沉淀。重金屬離子（如Pb2+、Cu2+等）與蛋白質(zhì)的羧基等結(jié)合生成不溶性的金屬鹽類而沉淀，同時蛋白質(zhì)發(fā)生變性。某些有機酸的酸根則與蛋白質(zhì)的自由氨基結(jié)合而沉淀。植物體內(nèi)具有顯著生理作用的含氮堿性化合物成為生物堿。能沉淀生物堿或與其產(chǎn)生顏色反應(yīng)的物質(zhì)稱為生物堿試劑，如鞣酸等。當(dāng)溶液PH小于等電點時，蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷，容易與生物堿試劑的負離子發(fā)生反應(yīng)而沉淀。蛋白質(zhì)變性（proteindenaturation）是指蛋白質(zhì)在某些物理和化學(xué)因素作用下其特定的空間構(gòu)象被改變，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)的改變和生物活性的喪失。一般認為蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)有了改變或遭到破壞，都是變性的結(jié)果。能使蛋白質(zhì)變性的化學(xué)方法有加強酸、強堿、重金屬鹽、尿素、乙醇、丙酮等；能使蛋白質(zhì)變性的物理方法有加熱(高溫)、紫外線及X射線照射、超聲波、劇烈振蕩或攪拌等。如果變性條件劇烈持久，蛋白質(zhì)的變性是不可逆的。如果變性條件不劇烈，這種變性作用是可逆的。這時，如果除去變性因素，在適當(dāng)條件下變性蛋白質(zhì)可恢復(fù)其天然構(gòu)象和生物活性，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)復(fù)性（renaturation）。例如胃蛋白酶加熱至80～90℃時，失去溶解性，也無消化蛋白質(zhì)的能力，如將溫度再降低到37℃，則又可恢復(fù)溶解性和消化蛋白質(zhì)的能力。蛋白質(zhì)變性的應(yīng)用價值醫(yī)學(xué)：臨床上的消毒和滅菌---使病原微生物變性注射及外傷采用75%乙醇滅菌手術(shù)器械及其它用品采用高溫高壓滅菌手術(shù)室用紫外線滅菌用熱凝法檢查尿蛋白實驗室：防止蛋白質(zhì)變性：在生產(chǎn)和保存激素、酶、抗體血清等具有生物活性的蛋白質(zhì)（如酶、疫苗、免疫血清等）時，應(yīng)防止其變性失活，其中在低溫條件下生產(chǎn)與貯存以上蛋白質(zhì)就是這個道理。實驗室的滅菌：細胞培養(yǎng)室等亦用紫外線照射消毒滅菌。日常生活：熟食較生食易消化：因為蛋白質(zhì)變性后，肽鏈構(gòu)象由卷曲變?yōu)樯煺梗闺慕”┞?，易被蛋白水解酶消化水解。其中鹽析法作為一種蛋白質(zhì)膠體簡便的提取手段被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。鹽析法是在中藥水提液中,加入無機鹽至一定濃度,或達飽和狀態(tài),使某些成分在水中溶解度降低,從而與水溶性大的雜質(zhì)分離。如向蛋白質(zhì)溶液中加入某些濃的無機鹽[如(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后，可以使蛋白質(zhì)凝聚而從溶液中析出，這種作用就叫做鹽析。這樣析出的蛋白質(zhì)仍可以溶解在水中，而不影響原來蛋白質(zhì)的性質(zhì)。因此，鹽析是一個可逆的過程。利用這個性質(zhì)，可以采用多次鹽析的方法來分離、提純蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度取決于蛋白質(zhì)分子表面離子周圍的水分子數(shù)目，亦即主要是由蛋白質(zhì)分子外周親水基團與水形成水化膜的程度以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽后，由于中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，致使蛋白質(zhì)分子周圍的水化層減弱乃至消失。同時，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后由于離子強度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。由于各種蛋白質(zhì)在不同鹽濃度中的溶解度不同，不同飽和度的鹽溶液沉淀的蛋白質(zhì)不同，從而使之從其他蛋白中分離出來。簡單的說就是將硫酸銨、硫化鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液