放射免疫技術(shù)課件

放射免疫技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)=免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)抗原抗體反應(yīng)示蹤物質(zhì)標(biāo)記特異性敏感性標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點(diǎn)：高特異性、高靈敏性類(lèi)別標(biāo)記物用途熒光素FITC、RB200、PE、鑭系元素螯合物免疫組化免疫分析測(cè)定放射性核素125I、3H免疫分析測(cè)定酶HRP、AP免疫組化免疫分析測(cè)定化學(xué)發(fā)光物魯米諾、吖啶酯免疫分析測(cè)定金屬顆粒膠體金、鐵蛋白免疫組化免疫分析測(cè)定常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)放射免疫技術(shù)的發(fā)展歷史1959年由Yalow和Berson首先用于糖尿病患者血漿胰島素含量的測(cè)定開(kāi)創(chuàng)了體液超微量物質(zhì)定量分析的嶄新領(lǐng)域，并為其他標(biāo)記免疫分析奠定了基礎(chǔ)1977年獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)（一）放射性核素常用于放射免疫技術(shù)的放射性核素3H→β類(lèi)（液體閃爍計(jì)數(shù)器）125I→γ類(lèi)（γ計(jì)數(shù)器）125I的特點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：化學(xué)性質(zhì)活潑，易于制備標(biāo)記物γ射線測(cè)定簡(jiǎn)便，測(cè)量效率高半衰期60天適中缺點(diǎn)：125I取代H會(huì)改變?cè)镔|(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)易發(fā)生輻射損傷而使抗原（體）變性試劑的貨架期較短放射標(biāo)記物的制備（一）抗原：高純度抗體：高純度、高親和力高效價(jià)、高特異性（二）標(biāo)記方法：125I通過(guò)取代反應(yīng)置換被標(biāo)記物中的酪氨酸或酪胺殘基苯環(huán)上的氫原子氯胺T（ch-T）法間接標(biāo)記法標(biāo)記物的純化凝膠層析法聚合物雜質(zhì)放射峰含標(biāo)記物的主放射峰游離125I峰標(biāo)記物的鑒定放射化學(xué)純度比放射活性免疫活性放射化學(xué)純度標(biāo)記物中結(jié)合在被標(biāo)記物上的放射活性占該標(biāo)記物總放射活性的百分比>95%標(biāo)記物脫碘程度的指標(biāo)比放射活性單位質(zhì)量標(biāo)記物中所含的放射性強(qiáng)度，也可理解為每分子被標(biāo)記物平均所結(jié)合放射性原子數(shù)目比放射活性較高可提高方法的靈敏度，但過(guò)高，將影響標(biāo)記物免疫活性免疫活性標(biāo)記物與抗原或抗體反應(yīng)的能力反映標(biāo)記過(guò)程中被標(biāo)記物免疫活性受損情況少量標(biāo)記物與過(guò)量抗體反應(yīng)百分比（B/T>80%）放射免疫技術(shù)放射免疫分析（RIA）-競(jìng)爭(zhēng)法-1959年-Yalow和Berson免疫放射分析（IRMA）-非競(jìng)爭(zhēng)法-1968年-Miles和Hales放射免疫分析（RIA）--原理標(biāo)記抗原（Ag*）和非標(biāo)記抗原（Ag）與限量抗體（Ab）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Ag*和Ag與Ab具有相同的親合力放射免疫分析（RIA）--實(shí)驗(yàn)方法抗原抗體反應(yīng)分離結(jié)合與游離標(biāo)記物放射性測(cè)量及數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)方法--抗原抗體反應(yīng)①平衡法

將Ag和Ag*同時(shí)與Ab反應(yīng)，達(dá)到平衡后分離Ag*-Ab和Ag*，方法穩(wěn)定，但敏感度稍差；②非平衡法

先將待測(cè)Ag與Ab充分反應(yīng)，達(dá)平衡后再加入Ag*，敏感度提高，穩(wěn)定性不如平衡法。實(shí)驗(yàn)方法--B/F分離理想的分離方法：分離徹底，迅速分離試劑和過(guò)程不影響反應(yīng)平衡效果不受反應(yīng)介質(zhì)影響操作應(yīng)簡(jiǎn)單、重復(fù)性好經(jīng)濟(jì)實(shí)驗(yàn)方法-B/F分離分離方法：聚乙二醇（PEG）沉淀法雙抗體法雙抗體-PEG法PEG沉淀法非特異性沉淀大分子蛋白質(zhì)（抗原抗體復(fù)合物）→離心PEG6000終濃度7%-9%pH6-9優(yōu)點(diǎn)：沉淀完全，快速、經(jīng)濟(jì)方便缺點(diǎn)：非特異結(jié)合率高，受環(huán)境因素影響較大雙抗體法以第二抗體（抗抗體）作為沉淀劑特異性結(jié)合抗原抗體復(fù)合物中的第一抗體并形成沉淀→離心因第一抗體含量甚微，還需加入一定量的與一抗同源的動(dòng)物的IgG優(yōu)點(diǎn)：特異性好，重復(fù)性好缺點(diǎn)：沉淀慢，成本高雙抗體--PEG法目前廣泛應(yīng)用的方法融合了雙抗體法和PEG法的優(yōu)點(diǎn)既保持了雙抗體法的特異沉淀作用，又保持了PEG快速沉淀的優(yōu)點(diǎn)同時(shí)減少兩者的用量，降低成本，降低非特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法--放射性測(cè)量測(cè)T、B、F---晶體閃爍計(jì)數(shù)器（γ計(jì)數(shù)器）γ計(jì)數(shù)器又稱(chēng)晶體閃爍計(jì)數(shù)器，包括NaI閃爍晶體、光電倍增管以及計(jì)數(shù)器三個(gè)基本部分探測(cè)原理：γ射線→閃爍體→激發(fā)→退激發(fā)→熒光→光電子→電脈沖數(shù)測(cè)量的放射性信號(hào)是儀器輸出的電脈沖數(shù)，每分鐘計(jì)數(shù)(cpm)實(shí)驗(yàn)方法--數(shù)據(jù)處理參數(shù)BB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)RIA標(biāo)準(zhǔn)曲線的類(lèi)型（1）以測(cè)定物標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，B%或B/F、B/B0、計(jì)數(shù)（cpm）為縱坐標(biāo)，呈雙曲函數(shù)；（2）以測(cè)定物標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，B%或B/F、B/B0、cpm為縱坐標(biāo)，曲線呈反S型；

(3）以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的算術(shù)數(shù)（或?qū)?shù)）為橫坐標(biāo)，F(xiàn)/B（或B0/B）為縱坐標(biāo)，呈雙曲函數(shù)；（4）以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，logitB/B0為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線為從左到右的漸降直線。免疫放射分析（IRMA）--原理非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析以過(guò)量125I標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行非競(jìng)爭(zhēng)性免疫結(jié)合反應(yīng),用固相免疫吸附方法對(duì)B或F進(jìn)行分離雙位點(diǎn)IRMA（雙抗體夾心法）分離技術(shù)固相吸附分離方法吸附材料：塑料（聚苯乙烯）試管此技術(shù)的重點(diǎn)不是分離，而是吸附（包被），一般采用物理吸附法特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、無(wú)離心步驟數(shù)據(jù)處理免疫放射分析的劑量反應(yīng)曲線RIA和IRMA的比較RIAIRMA標(biāo)記物抗原抗體抗體用量限量過(guò)量反應(yīng)模式競(jìng)爭(zhēng)性分析非競(jìng)爭(zhēng)性分析反應(yīng)時(shí)間較慢較快分離技術(shù)PEG-雙抗體法固相吸附法測(cè)量范圍較窄較寬敏感度較低較高應(yīng)用范圍小分子半抗原大分子抗原或抗體放射免疫技術(shù)--方法學(xué)評(píng)價(jià)靈敏度高特異性強(qiáng)放射性污染和危害放射性核素半衰期短，試劑盒有效期不長(zhǎng)無(wú)法自動(dòng)化分析放射免疫技術(shù)--臨床應(yīng)用激素（蛋白質(zhì)、多肽類(lèi)、非多肽類(lèi)）病原體抗原或抗體腫瘤標(biāo)志物藥物思考題